支原体膜的结构与功能——Ⅱ、鸡败血症支原体细胞及细胞膜超精细结构

用负染、投影、超薄切片电镜技术研究鸡败血症支原体S_6细胞及细胞膜的超精细结构。结果表明,鸡败血症支原体S_6和其它类型支原体一样,具有多形态特征。细胞直径约为0.6微米。鸡败血症支原体细胞一端有小疱结构,此为其独特形态。用低渗法破碎鸡败血症支原体S_6细胞分离细胞膜,当细胞培养时间为36小时,可获较纯净的膜制品。分离出的膜结构为空囊状,有时在膜囊一端可见小疱状结构。用戊二醛与四氧化锇先后固定膜和四氧化锇单固定法进行比较,发现四氧化锇单固定可获更清楚的三层膜结构。     

冰冻断裂方法在豌豆叶光合膜亚分子结构观察中的初步应用

当前在光合作用研究领域内,光合膜结构与功能的研究极为活跃;而电子显微镜冰冻断裂和冰冻蚀刻方法则是揭示生物膜(包括光合膜)亚分子结构的一种有效手段。冰冻断裂就是将生物材料迅速冷却固定后施以外力,使之断裂,再利用低温真空复型技术将材料的断裂面制成复型后于电镜下观察。如果材料断裂后,使其温度适当上升,让断裂     

支原体膜的结构与功能 Ⅰ.支原体膜上ATPase基本性质的研究

以鸡败血症支原体为材料,研究阳离子、pH、温度、底物、抑制剂等对膜上ATPase活性的影响。结果表明鸡败血症支原体膜上ATPase是被Mg~(2 )激活,而不被K~ Na~ 激活,乌巴碱不能抑制。除Mg~(2 )外,Mn~(2 )、Co~(2 )、Zn~(2 )对该酶都有不同程度的激活作用,Ca~(2 )则略有抑制作用。鸡败血症支原体膜的ATPase pH适应范围较广,对温度有较高的耐受力。几种线粒体内膜上ATPase复合体的抑制剂如寡霉素、DCCD等对鸡败血症支原体膜上ATPase都无抑制作用。与线粒体、细菌的ATPase的性质进行了比较和讨论。     

一种冰冻刻蚀装置的设计及应用

冰冻刻蚀(或断裂)技术与其他常规电镜技术相比具有许多优点。样品的快速冰冻可起到物理固定的作用这不仅减少了化学固定引起的人为改变,而且也省去了固定和脱水等步骤;对生物标本进行不同时期的冰冻可以得到不同阶段的细胞复型;在膜的研究方面;它可与生物化学方法相辅,同样起到生物化学方法所起的弱化膜疏水键的作用,从而使两层疏水性面的任何侧面的三维结构暴露出来,远比超薄切片所得到的两维片层结构要丰富。     

应用重离子束苏制核微孔滤膜除菌除支原体的研究

本文采用苏制核微孔滤膜进行了除菌、除支原体实验研究,核孔膜孔径分别为０．０７、０．１、０．５、０．７及１．５微米,采用的菌种为白色葡萄球菌、链球菌和大肠杆菌,支原体为解脲脲原体,实验结果表明：０．０７及０．１微米的核孔膜可完全滤除细菌及支原体,０．５微米的核孔膜可滤除绝大部分细菌,不能滤除支原体,１．５微米的核孔膜只能滤除少量细菌。     

冰冻断裂的枣疯病树韧皮组织中类支原体的扫描电镜观察

枣疯病树韧皮组织的冰冻断裂样品,经扫描电镜观察揭示,病树韧皮组织的筛管中存在类支原体,而健树韧皮组织筛管中则未观察到。用此方法观察到的类支原体,其大小和形状,与文献中利用其它方法获得的结果基本相符。讨论了这种方法的优、缺点。     

滑液支原体醛缩酶的亚细胞定位及免疫原性

【背景】滑液支原体(Mycoplasma synoviae,MS)感染能够引起鸡和火鸡的气囊炎、关节渗出性的滑液囊膜及腱鞘滑膜炎等。有研究表明,许多支原体中与代谢相关的酶类不仅分布在细胞质,也分布于细胞膜表面,通过结合宿主细胞的胞外基质蛋白,协助病原菌黏附入侵宿主细胞。已有报道牛支原体(Mycoplasma bovis)和鸡毒支原体(Mycoplasma gallisepticum)的醛缩酶(Fructose-bisphosphate aldolase,FBA)分布在膜蛋白和胞浆蛋白中,而MS的FBA蛋白还未见相关研究。【目的】对MSFBA蛋白进行生物信息学分析、原核表达、免疫原性分析及亚细胞定位检测,为进一步探索MS代谢相关酶类的生物学功能奠定基础。【方法】通过分析软件PSORTb、SignalP 4.1 Server和TMHMM Server在线预测MSFBA的亚细胞定位、信号肽及跨膜区,并用BLASTn和MEGA 5.0进行同源比对及进化树分析;通过Overlap PCR点突变扩增MS的fba全基因序列,连接表达载体pET-28a(+)并进行原核表达及纯化,获得纯化后的重组MSFBA(rMSFBA)蛋白;用MS阳性血清进行Westernblot鉴定rMSFBA的免疫原性;用纯化的rMSFBA蛋白制备兔多克隆抗体,与MS全菌蛋白、膜蛋白及胞浆蛋白进行Western blot分析,同时对MS全菌进行悬浮免疫荧光分析,检测MSFBA的膜定位情况。【结果】生物信息分析预测MSFBA分布在细胞质中,无信号肽,无跨膜区,在MS种内相似性高达99%,与其他种属FBA相似性在61%-78%之间,进化树显示其与牛鼻支原体(Mycoplasma bovirhinis)、仓鼠支原体(Mycoplasm acricetuli)等的FBA蛋白进化关系较近,与精氨酸支原体(Mycoplasma arginini)、人型支原体(Mycoplasma hominis)等的FBA蛋白进化关系较远;表达rMSFBA蛋白并纯化,经测定其相对分子质量大小约为33kD;rMSFBA能与MS阳性鸡血清特异性结合,证实其具有较好的免疫原性;Western blot显示抗rMSFBA的兔血清能与MS全菌蛋白和胞浆蛋白反应,而与膜蛋白不反应,说明MSFBA蛋白分布于胞浆中;悬浮免疫荧光实验证实MS的细胞膜上未见FBA蛋白分布。【结论】首次报道了滑液支原体的FBA蛋白是一个高度保守的免疫原性蛋白,主要分布在细胞质中,该结果为进一步研究MSFBA蛋白的生物学功能提供了分子基础。     

用抗原复合物免疫马匹制备抗气性坏疽多价血清

<正>实验研究证明,由一种生物制剂制备多价血清是可能的。 目前,研究在生产中制备抗气性坏疽主要病菌的抗气性坏疽三价血清的生产方法。以A型产气荚膜杆菌、肿瘤杆菌和败血型弧菌研究最理想的预防(保护)剂量,其目的是为了减少每种剂量中蛋白的含量。 共免疫了3—4岁的乌拉尔草原马39匹作实验。在基础免疫前,用羊毛脂和油脂混合,以A型产气荚膜杆菌。肿瘤杆菌和败血型弧菌抗原对所有的马免疫二次。用加温法制备抗原混合物,填加的抗原加温到40℃,初步消毒后,把羊毛脂缓缓装入大的试管中。抗原和羊毛脂均匀混合,加上油脂重新搅匀,用这样得到的多种抗原,在马的颈部作皮下注射。给马第一次注射后,得到的混合     

牛传染性鼻气管炎病毒的繁殖的冰冻蚀刻研究

用冰冻断裂和蚀刻技术对牛传染性鼻气管炎病毒及其在细胞中的繁殖进行了观察。验证了Furlong等提出的疱疹病毒核壳体模型;同时发现在细胞膜上大片形成吞饮泡,细胞质泡状结构的膜上颗粒随机分布于PF和EF面． 本文对这些现象与病毒繁殖及细胞骨架的关系进行了讨论。     

家兔晶状体纤维的超微结构扫描电镜和冰冻断裂的研究

关于脊椎动物眼睛晶状体纤维细胞的研究,已有不少报道,但涉及到其细胞表面结构的有关工作还不多。至于不同部位细胞的结构,特别是晶状体核纤维细胞的构形,报道也不完全一致。本文主要介绍用常规扫描电镜以及冰冻断裂扫描电镜技术,研究家兔晶状体纤维细胞的三维结构。Hansson(1970);Sakuragawa和Kuwabara(1975);Nelson和Rafferty(1976)均以小自鼠为材料。Farnsworth(1974)以及Sakuragawa(1975)分别用大白鼠为研究对象。他们先后开展了晶状体的扫描电镜研究,并对该课题的发展作出了一定贡献。Dickson和Crock(1972;1975)将冰冻断裂扫描电镜技术引入对猴晶状体     

支原体、G~-细菌和某些G~+细菌共同具有类似的蛋白质抗原的证据

<正>在人型支原体的膜蛋白特性的研究过程中,人型支原体的一个主要膜相关蛋白45KDa膜蛋白的特异抗体呈现和一些支原体属细菌的约42～48KDa的膜相关蛋白的强烈交叉反应。研究了抗发酵型支原体的43KDa膜蛋白的特异抗体和一些支原体以及细菌株的交叉反应性。在所检测的支原体、G~-细菌以及是G~+的金黄色葡萄球菌中,发现了取决于细菌本身的显而易见们分子量为42000～48000的交叉反应抗原(称为45000分子重量[45K]蛋白质)。     

用单宁酸作示踪剂观察上皮细胞间的紧密连接

运用单宁酸染色示踪技术是研究细胞膜和细胞膜特化结构与功能关系的一种新发展起来的技术。用戊二醛加单宁酸的混合液固定生物组织,能够提高各类细胞表面膜的电子密度和反差。冰冻复型技术是研究质膜结构的一种很好方法,结合单宁酸示踪技术,可进而了解膜上某些结构及其功能之间的关系。冰冻复型膜上显示:在胃和小肠粘膜上皮顶端相邻两上皮细胞之间以及近肝毛细胆管处组成紧密连接的网状索条层数多,排列紧密,此处紧密连接结构发育好,单宁酸不能通过这个部位;在肾近端小管上皮细胞,网状索条仅有1～2层,单宁酸能通过此部位不受阻挡,在生理条件下,有利于肾近端小管参与重吸收和对机体水盐代谢平衡的调节。     

在鸡胚绒毛尿囊膜上评价血管生成技术的应用与优化

目的：用鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）评价血管生成并进行优化,为抗血管生成药物筛选提供良好的体内实验模型。方法：对CAM技术的各个环节,包括合适日龄胚蛋选择、蛋壳开窗及暴露CAM的方法、载体选择、结果分析等进行了实验对比。结果：采取气室开窗,以甲基纤维素为药物载体,促进血管生成的药物在孵化11d以后、抑制血管生成的药物在孵化7～9d给药,鸡胚存活率为85.8%,生长状况良好,被检测药物有明显的抑制或促进血管生成的效应。结论：通过优化建立了操作简便、鸡胚存活率高的在CAM上评价血管生成的技术;应用CAM技术评价了若干影响血管生成的因子。     

共表达O型口蹄疫病毒3C、P1-2A基因和猪白细胞介素18基因的重组鸡痘病毒免疫原性研究

目的 对本室已筛选到的一株共表达O型口蹄疫病毒3C基因、P1-2A基因和猪白细胞介素18基因的重组鸡痘病毒rFPV-3C-P1-2A-IL-18进行免疫原性研究。方法 分别用重组鸡痘病毒rFPV-3C-P1-2A-IL-18、rFPV-P1-2A-3C和对照组282E4株FPV、PBS对小鼠进行免疫接种,并检测各免疫组的T 淋巴细胞亚类数量、CTL杀伤活性及抗体效价。结果 重组鸡痘病毒疫苗组免疫小鼠T 淋巴细胞亚类数量,CTL杀伤活性和抗体效价均显著高于对照组,且重组鸡痘病毒rFPV-3C-P1-2A-IL-18的小鼠T 淋巴细胞亚类数量和CTL特异性杀伤活性与rFPV-P1-2A-3C相比,差异显著。结论 本实验为开发新型FMDV疫苗奠定了实验免疫基础。     

植物冰冻切片条件的优化及其与石蜡切片在组织化学应用中的比较

冰冻切片是植物组织学研究中一项重要的实验技术,冷冻温度和冷冻时间是决定切片质量的关键因素。通过比较15种冰冻切片条件,得出植物组织直接冰冻切片较适宜的冷箱温度、冷台温度和冷冻时间。同时,通过对5种植物的不同组织进行组织化学染色,比较了新鲜材料直接冰冻切片与常规石蜡切片在不同化学成分鉴定上的异同及各自的适用范围。结果表明,对于多糖、蛋白质和角质,两种切片方法的鉴定结果比较一致,但对于脂肪只能采用冰冻切片技术。研究结果对植物组织学实验和研究方法的改进具有一定的参考价值。     

用胰酶消化法浓缩纯化恙虫病立克次体

用不同感染材料和方法进行了浓缩纯化恙虫病立克次体的试验。结果证明以0．25％的胰蛋白酶消化感染鸡胚卵黄囊膜,可获得形态完整的立克次体;浓缩纯化的立克次体保持活性;用于补体结合试验,抗原滴度可达1：128。经冰冻干燥保存后,仍能保持其形态的完整性。     

实验用小型猪呼吸道支原体检测及方法比较

目的通过常用的三种不同方法对支原体的检测,了解实验用小型猪支原体感染情况,为今后实验用小型猪支原体检测方法国家标准的制定提供参考。方法采用培养法、PCR和ELISA方法分别对20头小型猪的气管、肺和血清进行检测。结果三种检测方法中,PCR方法支原体阳性检出率为15%,ELISA方法为20%,而培养法结果均为阴性。结论目前在普通级小型猪中存在支原体的感染。检测方法中PCR和ELISA方法较培养法更省时,敏感性更高。     

用原位电泳技术测定艾氏腹水癌细胞膜的流动性

细胞膜组分(膜蛋白、膜脂等)分子能沿膜进行侧向扩散运动,研究这种运动对了解细胞的功能有重要意义。原位电泳(In Situ Electrophoresis)是近年发展起来的测量细胞膜组分侧向扩散的新技术之一。我们用这种技术研究了小鼠艾氏腹水癌细胞膜ConA(Concanavalin A)受体的侧向扩散,并测得在22℃时,其侧向扩散系数为3.2×10~(-10)cm~2/see。实验结果提示,侧向扩散系数具有较大离散性可能是癌细胞的特征之一。     

兔支气管败血波氏杆菌单克隆抗体的制备及鉴定

目的建立能稳定分泌抗兔支气管败血波氏杆菌（Bb）的单克隆抗体杂交瘤细胞株,为今后进一步建立该菌的免疫检测技术奠定基础。方法以Bb分离株BLJ05的灭活菌液为免疫原,腹腔免疫BALB/c小鼠,采用常规杂交瘤技术制备Bb单克隆抗体（McAb）,用间接ELISA、Western-blot等方法对McAb特性进行鉴定。结果获得两株能稳定分泌抗Bb单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为A7D5和D6B2,其小鼠腹水抗体效价分别为1∶409600和1∶102400;且不与兔大肠杆菌、多杀性巴氏杆菌、产气荚膜梭菌等兔的常见病原菌反应,特异性强。两株单抗亲和力实验表明A7D5亲和力略高于D6B2。ELISA相加试验表明它们针对相同的抗原表位。结论成功建立了两株能稳定分泌抗兔支气管败血波氏杆菌单克隆抗体的杂交瘤细胞株,效价高、特异性强,为今后建立该菌的免疫检测技术建立奠定了基础。     

逆转录法筛选mRNA靶点设计核酶对GPA的表达干预实验研究

采用自行设计5’固定3’随机的文库对基因mRNA进行杂交用于逆转录反应以筛选mRNA的寡核苷酸结合靶点。对人I型跨膜糖蛋白-血型糖蛋白A （glycophorin A,GPA）的mRNA筛选了4个反义寡核苷酸可结合靶点,分别设计反义核酸（Antisense）,分别加入mRNA中用RNase H验证各靶点的核酸结合和切割效率,最终确定2个高效结合和切割靶点。再设计Ribozyme,构建表达核酶（Ribozyme）质粒,利用慢病毒（Lentivirus）包装技术,感染人源红系白血病细胞株K562细胞,在细胞水平验证其下调GPA基因表达的效果,对转染细胞mRNA进行反转录和Real Time PCR分析mRNA表达水平,并在蛋白水平进行了Western Blot分析。结果表明文库结合逆转录方法筛选靶点设计的Ribozyme具有高效率下调膜受体表达的作用,GPA为I型跨膜糖蛋白,该实验为筛选mRNA靶点提供参考方法,并对膜受体表达干预有参考价值。