小鼠FANCL抗体制备及组织表达谱分析

FANCL是一个范可尼氏贫血新蛋白,它作为泛素E3连接酶催化FANCD2的单一泛素化,在修复DNA损伤、维持染色体稳定的FA途径中起着关键作用。胚胎期FANCL与小鼠原始生殖细胞增殖密切相关,成年睾丸中FANCL与几个生殖细胞特异性蛋白形成一个睾丸特异网络,可能参与影响精子的生成。采用RT-PCR方法从小鼠总RNA中扩增克隆FancL全长cDNA片段,构建表达质粒,在大肠杆菌中表达了6His-FANCL蛋白,用表达蛋白作为抗原免疫新西兰白兔制备了抗FANCL多抗血清。采用镍离子金属螯合柱纯化6His-FANCL蛋白后,通过与活性基团-NHS交联制备了FANCL抗原柱,亲和纯化了FANCL多抗。为了验证抗体活性和特异性,在HEK293T细胞中瞬时表达了HA-FANCL融合蛋白,分别用HA单抗和纯化多抗进行Western印迹分析,结果表明获得了特异性的FANCL抗体。为了观察FANCL在组织中的表达谱,制备了多种小鼠组织匀浆蛋白,使用纯化的FANCL多抗进行Western印迹分析,在脑、心、肺、肝、脾、肾、睾丸、卵巢、子宫和肌肉组织中都检测到FANCL蛋白的表达,说明FANCL在小鼠组织中是广泛表达的,这与其是DNA修复复合物中的重要成员相一致。     

PHD finger protein 8蛋白多克隆抗体的制备、纯化与检测

PHD finger8(PHF8)蛋白是最新发现的一种带有PHD结构域和Jmjc结构域的蛋白。现有研究表明其可能在基因转录、组蛋白去甲基化等方面发挥重要作用。为研究其功能,本研究构建原核表达载体pET41b-PHF8(aa886-936),在大肠杆菌Escherichia coli BL21中诱导表达带有GST标签的PHF8(aa886-936)亲水片段融合蛋白,并纯化该片段作为抗原免疫家兔,再以CNBr活化Sepharose4B微珠纯化抗血清制备PHF8特异性多克隆抗体。Western blotting以及免疫荧光检测表明该抗体具有很好的特异性,同时免疫荧光染色的结果也表明PHF8蛋白定位于细胞核。     

小鼠泛素结合酶UBE2W的抗体制备及组织表达谱分析

泛素结合酶(E2)是蛋白泛素化修饰所需的第二个连接酶, 在泛素转移和底物特异性识别过程中发挥着重要作用。UBE2W是一种新发现的E2酶, 其果蝇属同源蛋白可能在光转导或视网膜变性过程中发挥作用, 鼠和人同源蛋白功能未见报道。生物信息学分析UBE2W鼠源氨基酸序列, 发现UBE2W具有典型的UBC结构域并在多种物种高度保守。通过构建UBE2W原核表达质粒, 在大肠杆菌中表达并纯化了GST-UBE2W融合蛋白。以此纯化蛋白作为抗原免疫新西兰白兔制备抗UBE2W多抗血清, 并利用制备的UBE2W抗原柱亲和纯化UBE2W多抗。为了检测纯化抗体特异性, 在真核细胞中瞬时表达了myc-UBE2W融合蛋白, 分别用myc单抗和UBE2W多抗进行Western blotting分析, 结果表明获得了特异性的UBE2W抗体。利用此特异性抗体在小鼠脑、心脏、肾脏、肝脏、肺、肌肉、脾脏和睾丸等组织中均检测到了UBE2W的表达, 且在小鼠睾丸中成年期表达最高。     

小鼠泛素结合酶UBE2W的抗体制备及组织表达谱分析

泛素结合酶(E2)是蛋白泛素化修饰所需的第二个连接酶, 在泛素转移和底物特异性识别过程中发挥着重要作用。UBE2W是一种新发现的E2酶, 其果蝇属同源蛋白可能在光转导或视网膜变性过程中发挥作用, 鼠和人同源蛋白功能未见报道。生物信息学分析UBE2W鼠源氨基酸序列, 发现UBE2W具有典型的UBC结构域并在多种物种高度保守。通过构建UBE2W原核表达质粒, 在大肠杆菌中表达并纯化了GST-UBE2W融合蛋白。以此纯化蛋白作为抗原免疫新西兰白兔制备抗UBE2W多抗血清, 并利用制备的UBE2W抗原柱亲和纯化UBE2W多抗。为了检测纯化抗体特异性, 在真核细胞中瞬时表达了myc-UBE2W融合蛋白, 分别用myc单抗和UBE2W多抗进行Western blotting分析, 结果表明获得了特异性的UBE2W抗体。利用此特异性抗体在小鼠脑、心脏、肾脏、肝脏、肺、肌肉、脾脏和睾丸等组织中均检测到了UBE2W的表达, 且在小鼠睾丸中成年期表达最高。     

奥利亚罗非鱼DMRT1和DMRT4抗体制备及组织表达谱分析

DMRT1和DMRT4是DMRT基因家族的成员,该家族成员与果蝇的性别决定基因和线虫性别决定基因一样,所编码的蛋白质都包含一个具有DNA结合能力的保守基序,即DM结构域,并以锌指结构与特异DNA序列相结合,在性别决定和分化发育中起调控作用。采用RT-PCR方法分别从奥利亚罗非鱼卵巢和精巢中扩增克隆出DMRT1和DMRT4全长cDNA片段,构建表达载体,在大肠杆菌中表达了BMP-DMRT4和BMP-DMRT1蛋白。经Xa切割、Amylose-sepharose柱层析纯化后作为抗原免疫新西兰白兔制备了DMRT1和DMRT4多克隆抗体,并进行纯化。对纯化多抗进行Western blot分析,结果表明获得了高特异性的DMRT1和DMRT4抗体。为了观察DMRT1和DMRT4在组织中的表达谱,首先,我们通过实时荧光定量RT-PCR检测雌雄奥利亚罗非鱼多种组织mRNA的表达,仅在卵巢和脑中检测到DMRT4,在精巢中检测到DMRT1;其次,制备了多种组织匀浆蛋白,使用纯化的抗体进行Western blot分析,仅分别在卵巢和精巢中检测到DMRT4和DMRT1蛋白的表达;制备多种奥利亚罗非鱼组织切片,使用纯化的DMRT4和DMRT1多抗进行免疫组织化学分析,发现DMRT4仅在卵巢表达,而DMRT1仅在精巢表达。这些结果有助于阐明DMRT4和DMRT1的功能及在鱼类性别调控中的作用。     

GGNBP1抗体制备及小鼠组织表达谱分析

体外实验研究表明配子生成素结合蛋白1(GGNBP1)可能与GGN1相互作用形成睾丸特异性复合物,在精子生成过程中发挥作用.从小鼠睾丸总RNA中反转录扩增Ggnbpl全长cDNA,构建表达质粒,在大肠杆菌中表达GGNBP1,经聚丙烯酰胺凝胶纯化后免疫新西兰白兔,制备兔多抗血清.镍离子金属螯合柱纯化表达的GGNBP1蛋白,与NHS活化基团交联,制备GGNBP1抗体亲和层析柱,纯化GGNBP1多抗.在293FT细胞中瞬时表达Myc-GGNBP1融合蛋白,用于Mvc单抗验证GGNBP1抗体特异性,结果证明获得了特异性的GGNBP1抗体.分别制备小鼠脑、心、肺、肝、脾、肾、肌肉、卵巢、睾丸和子宫组织匀浆,用GGNBP1抗体进行Western印迹分析,结果仅在睾丸组织匀浆中检测到GGNBP1特异性条带,证明GGNBP1是睾丸特异性表达蛋白.     

O-GlcNAcase抗原片段的选择、优化表达和多克隆抗体的制备

为了探讨O-GlcNAc修饰的生物学作用和相关疾病的发病机理,需制备高效、专一的O-GlcNAcase (OGA) 抗体。通过对人源OGA蛋白进行序列分析发现,氨基端1~350 aa片段 (sOGA) 抗原性和亲水性较强,将该片段构建至原核表达载体pET-28a,并在大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3) 中进行诱导表达,通过优化IPTG浓度 (0.05 mmol/L) 和诱导时间 (10 h) 获得了高可溶性表达的重组蛋白酶。采用Ni-NTA亲和层析和分子筛层析对重组蛋白进行了纯化,SDS-PAGE检测分子量的大小 (45 kDa) 和纯度 (95％以上)。以4-MU-O-GlcNAc为荧光底物,检测到sOGA的糖苷酶活性为106 nmol/(min·mg),表明该片段是OGA糖苷酶的活性区域。以此片段作为抗原免疫新西兰大白兔,以CNBr活化Sepharose 4B微珠纯化抗血清制备OGA特异性多克隆抗体。Western blotting和ELISA检测表明,该抗体可以特异识别含有OGA糖苷酶活性区域的多种变体,检测灵敏度为0.11 ng/mL (效价为1∶80 000),可应用于O-GlcNAcase生物功能研究。     

类泛素化修饰蛋白SUMO1的表达纯化及抗体制备

SUMO是近年发现的类泛素化修饰蛋白,可通过异肽键共价连接到靶蛋白上,影响靶蛋白的细胞内定位、稳定性及与其它生物大分子的相互作用. 为研究蛋白质的SUMO化修饰,本文表达并利用亲和层析的方法纯化了重组的人SUMO1,制备了兔抗hSUMO1的多克隆抗体. 经ELISA和免疫印迹检测,获得了灵敏度高、特异性好的抗体,可用于SUMO化修饰靶蛋白的鉴定及SUMO化修饰的生物学功能研究.     

拟南芥WUSCHEL蛋白的原核表达、亲和纯化和多克隆抗体制备

本研究构建了带有His标签的拟南芥(Arabidopsis thaliana)WUSCHEL基因原核表达载体pET-31b(+)-WUS-His(6),优化了大肠杆菌(Escherichia coli)诱导表达体系,将亲和层析纯化后的WUS融合蛋白,经尿素梯度透析复性溶解,免疫新西兰大白兔,成功制备了WUS蛋白多克隆抗体。通过琼脂糖免疫扩散检测确定了抗血清效价和特异性,并以斑点杂交和Western blotting检验其灵敏性。结果表明,成功构建的拟南芥WUS原核表达载体,在E.coli中以0.5mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)28°C诱导表达10h后,融合蛋白得到高水平表达,亲和纯化后目标蛋白纯度达96%以上,所制备的多克隆抗体具有较高特异性和灵敏性,可用来检测纳克级蛋白抗原。     

果蝇spen蛋白的抗体制备、组织特异性表达及功能分析

Spen家族蛋白参与多种生物学过程,包括神经元细胞的命运、神经元突起延伸的调节、细胞周期调控等,并且是联系Notch信号途径和生长因子受体途径的关键分子。最近的研究表明spen基因在果蝇的眼睛、翅膀和腿组织中参与Wnt信号转导。但该基因在果蝇中的功能还有很多不明确之处。文章采用基因克隆、原核表达及亲和层析等方法制备并纯化了黑腹果蝇spen的C端6×His-spen融合蛋白,以纯化的融合蛋白免疫大鼠获得了抗spen的多克隆抗体。利用制备的抗体进行免疫染色结果显示spen蛋白定位于细胞核内,并且在大脑、脂肪体、血细胞、肠和唾液腺等组织中表达量较高。分析野生型和突变体果蝇血细胞的噬菌作用,发现spen蛋白低表达的突变体吞噬外来异物明显低于野生型,结果表明spen蛋白能够调节血细胞的吞噬功能。     

人NANOGP8蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备

为获得抗人 NANOGP8基因的多克隆抗体,采用PCR法扩增了NANOGP8基因,经序列测定正确后,连接到pET-28a质粒上,将获得的重组质粒pET-28a-NANOGP8转化到大肠杆菌BL21（DE3）中,在16℃和37℃下分别进行诱导表达,经SDS-PAGE检测发现融合蛋白以包涵体形式存在于37℃诱导表达的沉淀中,大小约为45kDa。对包涵体进行洗涤、溶解处理,经Chelating Sepharose Fast Flow亲和层析柱进行纯化。对纯化得到的蛋白进行SDS-PAGE及Western blot免疫印记杂交检测,得到了单一条带。用获得的高纯度融合蛋白免疫新西兰兔,得到兔来源的抗人NANOGP8血清。对抗血清进行蛋白免疫印记杂交反应和酶联免疫吸附反应检测,结果显示成功制备了高滴度和特异性的兔抗人NANOGP8多克隆抗体,与市售抗人Nanog多克隆抗体相比,杂交更迅速,效果更明显。为进一步研究NANOGP8基因在肿瘤发生、发展中的作用奠定了基础。     

Generation of Mouse FANCL Antibody and Analysis of FANCL Protein Expression Profile in Mouse Tissues

Fanconi anemia complementation group L (FANCL) is a novel Fanconi anemia protein, which mono-ubiquitinates FANCD2 as a ubiquitin E3 ligase, and plays a crucial role in DNA damage repair and chromosome stability maintenance. FANCL is involved in the proliferation of primordial germ cells (PGC) in early embryonic stages, and may play a role in the development of germ cells by forming a novel testis-specific network with testis-specific proteins in the adult testis. FancL cDNA sequence was cloned by RT-PCR from mouse testis total RNA, and expressed in E. coli BL21(DE3). Rabbit FANCL polyclonal antiserum was generated using the recombinant protein as the antigen. To prepare an antigen column for affinity purification of FANCL-specific antibody, recombinant His-tagged FANCL was purified by Ni²⁺-charged HiTrap Chelating HP column and coupled to an NHS-activated HiTrap column. To confirm the activity and specificity of the FANCL antibody, we constructed plasmid pCMV-HA/FANCL to transfect HEK 293T cells. Transiently expressed HA-FANCL fusion protein was analyzed by immunoblotting with both the FANCL antibody and HA monoclonal antibody. The antibody was used in Western blotting to check the expression of FANCL protein in mouse tissues. We found wide expression of FANCL in brain, muscle, heart, lung, liver, spleen, kidney, testis, ovary and uterus, indicating the functional importance of this novel protein.     

重组C8orf32蛋白的表达、纯化及抗体制备

C8orf32是一种功能未知基因,其mRNA含量在乳腺癌组织中显著高于正常乳腺组织。将其开放式阅读框插入pGEX-6P1原核表达载体T7启动子控制下的GST编码基因下游,构建了C8orf32蛋白表达质粒pGEX-6P-C8。表达质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3)菌株,经IPTG诱导,成功表达了GST- C8orf32融合蛋白。经带有GST标签的位点特异性蛋白酶切割除去GST-C8orf32融合蛋白的GST标签,获得了N端带有8个多余氨基酸残基的C8orf32蛋白,蛋白纯度为95%左右。N端氨基酸序列分析表明该蛋白N端氨基酸序列正确,质谱鉴定进一步证明所表达C8orf32蛋白的正确性。用制备的C8orf32蛋白免疫新西兰白兔,获得了能够正确识别C8orf32蛋白的抗血清。该蛋白及其抗体的成功制备,为进一步研究C8orf32蛋白的结构功能和体内分布打下了基础。     

小鼠单个GV期卵母细胞中ATP8基因的表达分析

目的:探讨小鼠GV期卵母细胞线粒体中ATP8(ATP合酶亚基8)基因的表达情况。方法:应用挤压法从卵巢中分离获得生发泡期(germinal vesicle,GV)卵母细胞;用RT-PCR检测GV期单个卵母细胞中ATP8基因的表达:其中cDNA的合成分两种方法进行:一是将GV期单个卵母细胞直接进行RT合成cDNA,二是先用DNA酶加EcoRⅠ酶祛除mtDNA和核DNA后再进行RT;回收产物构建克隆质粒并测序。结果:1.5%琼脂糖电泳显示、测序结果均表明ATP8基因在GV期卵母细胞中有表达。结论:小鼠GV期卵母细胞特异表达的ATP8基因可能与卵母细胞的正常发育成熟相关。     

小鼠OAZ2基因的原核表达及抗体制备

目的:克隆小鼠鸟氨酸脱羧酶抗酶2(OAZ2)功能基因,原核表达、纯化OAZ2蛋白并制备抗OAZ2多克隆抗体.方法:IRT-PCR法从鼠黑色素瘤细胞总RNA中克隆OAZ2 cDNA后,通过重叠延伸PCR技术构建无需移码即可全长翻译的功能基因.将OAZ2功能基因克隆人原核表达载体pET15b并原核表达.表达的蛋白经Ni-NTA亲和层析纯化后,用SDS-PAGE和Western Blot分析鉴定.用纯化的OAZ2蛋白作为抗原免疫Bab/C小鼠以制备多克隆抗体,制备抗体用ELISA和Western Blot检测抗体滴度和特异性.结果:成功获得小鼠OAZ2 cDNA并构建出无需移码翻译的OAZ2功能基因.OAZ2功能基因在大肠杆菌BL21(DE3)中可诱导性高表达并能用Ni-NTA树脂高效纯化.用纯化蛋白免疫Bab/C小鼠制备的抗血清经ELISA检测有较高的多克隆抗体效价(＞1∶64000),经Western blot鉴定可与纯化的OAZ2蛋白质特异性结合.结论:建立了鼠OAZ2蛋白原核表达和纯化技术,制备出高效价和特异性抗OAZ2多克隆抗体,为进一步研究OAZ2基因的功能奠定了基础.     

Widespread Expression of PICOT in Mouse and Human Tissues With Predominant Localization to Epithelium

The protein kinase C-interacting cousin of thioredoxin (PICOT; also termed glutaredoxin 3) protein was discovered a decade ago as a protein kinase C θ (PKCθ)-binding protein in human T lymphocytes. PICOT possesses an amino-terminal monothiol thioredoxin-like domain and a carboxy-terminal tandem repeat of a monothiol glutaredoxin-like domain. Nevertheless, the enzymatic activities of PICOT and its potential substrates have not yet been characterized and its biological importance is unknown. Earlier studies reported the presence of PICOT in several different cell lines and tissues, but its expression pattern has not been thoroughly investigated. We performed Northern blot analysis of 19 different human organs and tissues and found the expression of PICOT mRNA in all organs and tissues tested. Western blot analysis confirmed the expression of PICOT at the protein level in all organs and tissues tested and showed, in addition, that PICOT and PKCθ expression in different tissues only partially overlap. These findings support the involvement of PICOT in biological functions that are independent of PKCθ. To analyze the in vivo expression pattern of PICOT within cells of different human organs, we performed immunohistochemical staining using PICOT-specific antibodies. Analysis of breast, pituitary, adrenal, pancreas, and kidney sections demonstrated a differential expression of PICOT in various cell types, with a predominant cytosolic staining of epithelial cells and low or undetectable levels of PICOT in the stroma. (J Histochem Cytochem 58:799–806, 2010)