幽门螺杆菌感染与胃癌相关基因的筛选及预后分析

目的通过分析幽门螺杆菌感染胃黏膜组织和胃癌细胞系后的差异基因变化,并在癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas,TCGA)数据库和肿瘤基因芯片(Oncomine)数据库进行验证,探究幽门螺杆菌导致胃癌发生、发展的分子机制。方法分析基因表达汇编(Gene Expression Omnibus,GEO)数据库幽门螺杆菌感染相关芯片集GSE5081与GSE70394,绘制维恩图查找幽门螺杆菌感染后共同上调的差异基因。对共同上调的差异基因进行功能富集分析。通过TCGA和Oncomine数据库验证差异基因在胃癌中的表达。利用Kaplan-Meier Plotter数据库和GEPIA数据库分析差异基因表达高低与胃癌患者预后是否存在相关性。结果通过差异基因筛选和维恩分析,两个芯片集共有21个共同上调差异基因。GO分析发现共同上调差异基因主要富集在对细菌来源分子的反应、趋化因子CXCR受体结合、中性粒细胞趋化作用等相关的基因功能上;KEGG通路主要富集在癌症通路、TNF信号通路、趋化因子信号通路等。STRING以及PPI数据库分析发现21个基因中PRDM1、IL10、NRP1、BIRC3、GNG13、CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL8基因存在有网络关系,属于关键枢纽基因。通过TCGA和Oncomine数据库筛选及验证,发现在胃癌组织中NRP1、CXCL1、CXCL8基因明显上调,结果差异有统计学意义(TCGA数据库中,三者P值均小于0.05,Oncomine数据库中,NRP1:t=4.607,P0.01;CXCL1:t=5.854,P0.01;CXCL8:t=5.316,P0.01)。在Kaplan-Meier Plotter数据库(210615-at芯片:P0.01;210510-s-at芯片:P0.01;212298-at芯片:P0.01)以及GEPIA数据库(P0.01)两个数据库中,NRP1的高表达均与胃癌的预后负相关。结论不同的数据库均显示NRP1、CXCL1、CXCL8三个基因与幽门螺杆菌感染相关,同时在胃癌中高表达,并且NRP1的高表达与胃癌的不良预后相关,这些结果为进一步探究幽门螺杆菌导致胃癌发生、发展的分子机制提供了重要基础。     

肠道病毒71型感染小鼠心肌损害与CXCL12/CXCR4通路激活的关系

重症手足口病患儿中心肌损害常见,肠道病毒71型(Enterovirus 71,EV71)是引起手足口病的主要病原体之一,EV71感染小鼠可以出现心肌炎的病理改变,但EV71引起心肌损害的机制尚不明确。为了阐明EV71引起心肌损害的机制,本实验观察了EV71感染小鼠心肌损害与CXC趋化因子配体12(CXC chemokine ligand 12,CXCL12)/CXC趋化因子受体4(CXC chemokine receptor 4,CXCR4)通路激活的关系。BALB/c乳鼠随机分为对照组、EV71组、EV71+AMD3100组、AMD3100组,对照组、AMD3100组给予生理盐水腹腔注射,EV71组、EV71+AMD3100组给予EV71病毒液腹腔注射;而后EV71+AMD3100组、AMD3100组给予CXCR4抑制剂AMD3100腹腔注射、连续7d。比较四组间血清中CXCL12、磷酸肌酸激酶同工酶(CreatineKinase-MB,CK-MB)、乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase,LDH)含量、心肌病理改变及细胞凋亡率、心肌中CXCR4、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3(caspase-3)表达及肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor,TNF-α)、白介素-6(Interleukin-6,IL-6)含量的差异。与对照组比较,EV71组血清中CXCL12、CK-MB、LDH的含量明显增加,心肌出现了典型的心肌炎病理改变且细胞凋亡率、CXCR4及caspase-3表达水平、TNF-α及IL-6含量明显增加;与EV71组比较,EV71+AMD3100组血清中CXCL12、CK-MB、LDH的含量明显降低,心肌的病理改变改善且细胞凋亡率、CXCR4及caspase-3表达水平、TNF-α及IL-6含量明显降低。以上结果表明EV71感染小鼠心肌中CXCL12/CXCR4通路过度激活,该通路的激活介导了心肌细胞凋亡及炎症反应。本研究创新点为阐明了CXCL12/CXCR4通路在EV71病毒感染引起心肌损害中的作用,CXCL12/CXCR4通路激活能够激活EV71感染小鼠心肌的炎症反应及细胞凋亡,这为今后研究手足口病发病过程中心肌损害的机制提供了依据。     

miR373和miR542-5p调控肠道病毒71型在人横纹肌肉瘤细胞中的复制

研究发现microRNAs(miRNAs)可以参与调控病毒在宿主细胞内感染和复制的过程。为了揭示miRNAs是否参与肠道病毒71型(Enterovirus 71,EV71)的感染与复制,研究了miRNAs对EV71病毒在宿主细胞内复制的影响。构建miRNAs靶基因筛选系统,在双荧光素酶报告体系的pMIR载体插入病毒基因,如果插入的基因序列能被细胞内的miRNAs靶向调控,报告基因的表达将发生变化。实验发现EV71病毒5′-UTR基因可能是miRNAs的作用靶标。随后利用miRNAs在线分析软件预测并验证可能作用于5′-UTR基因片段的miRNAs。为了研究miRNAs分子对5′-UTR基因的调控作用是否可以体现在EV71病毒的复制过程中,在人横纹肌肉瘤(Rhabdomyosarcoma,RD)细胞中转染miRNAs mimics,利用Western blotting和real-time PCR实验检验EV71病毒的复制和表达情况。实验结果表明,miR373和miR542-5p可以通过作用于EV71病毒5′-UTR基因从而抑制病毒在RD细胞中的复制和表达。细胞内miR373和miR542-5p可以调控EV71在宿主细胞中的复制过程。研究EV71病毒与宿主miRNAs的相互作用机制为进一步阐明EV71病毒感染与复制机理奠定了基础。     

miR-34b调控肠道病毒71型在人横纹肌肉瘤细胞中的复制及机制

【背景】研究发现microRNAs(miRNAs)可以参与调控病毒在宿主细胞内感染和复制的过程。【目的】研究miR-34b对肠道病毒71型(Enterovirus71,EV71)在宿主细胞内的复制及其可能机制。【方法】在人横纹肌肉瘤(Rhabdomyosarcoma,RD)细胞中转染miR-34b mimics和Inhibitor,通过Western blot和Real-time PCR实验检验EV71病毒的复制和表达情况。随后利用双荧光素酶报告系统验证miR-34b与潜在靶点eIF4E的相互作用,并检测miR-34b对RD细胞中eIF4E mRNA表达水平的影响。【结果】miR-34b可以促进病毒在RD细胞中的复制和表达,而miR-34b抑制剂有抑制病毒复制的作用,细胞内miR-34b可以通过作用于靶基因eIF4E调控EV71在宿主细胞中的复制过程。【结论】揭示了miR-34b在EV71病毒复制过程中的调控作用及机制,研究EV71病毒与宿主miRNAs的相互作用机制为进一步阐明EV71病毒感染与复制机理奠定了基础。     

白介素18启动子区基因多态性与儿童EV71感染相关性研究

目的:研究白介素18基因启动子多态性与儿童EV71感染遗传易感性的关系.方法:收集EV71感染患儿177例,单纯HFMD组127例,HFMD并脑炎组50例,提取外周血DNA,用序列特异性引物-聚合酶链反应(SSP-PCR)技术及基因测序法检测IL-18启动子区-137G/C、-607A/C位点的基因多态性.结果:EV71感染患儿与健康儿童IL-18-607基因型以CA为主,AA、CC次之,EV71感染患儿AA基因型、A等位基因分布频率显著高于健康儿童.EV71感染HFMD并脑炎组患儿AA基因型分布显著高于单纯HFMD组患儿,差异有统计学意义.EV71感染患儿与健康儿童IL-18-137基因型以CC为主,CG次之,GG占少数.该位点基因型及等位基因在EV71感染组与健康儿童、单纯HFMD与HFMD并脑炎组的分布无显著差异.结论:IL-18基因多态性与EV71感染相关,IL-18-607AA基因型、A等位基因携带儿童更易感染EV71病毒,且AA基因型患儿易并发脑炎,-607AA基因型可能为EV71感染的易感基因型.-137C/G位点基因多态性与EV71感染无相关性.     

应用GSEA和WGCNA方法分析细菌性败血症宿主关键差异基因及意义

【目的】采用生物信息学方法分析公共数据库来源的细菌性败血症患者全血转录组学表达谱,探讨细菌败血症相关的宿主关键差异基因及意义。【方法】基于GEO数据库中GSE80496和GSE72829全血转录组基因数据集,采用GEO2R、基因集富集分析(GSEA)联用加权基因共表达网络分析(WGCNA)筛选细菌性败血症患者相比健康人群显著改变的差异基因,通过R软件对交集基因进行GO功能分析和KEGG富集分析。同时,通过String 11.0和Cytoscape分析枢纽基因,验证枢纽基因在数据集GSE72809(Health组52例,Definedsepsis组52例)全血标本中的表达情况,并探讨婴儿性别、月(胎)龄、出生体重、是否接触抗生素等因素与靶基因表达谱间的关系。【结果】分析GSE80496和GSE72829数据集分别筛选得到932个基因和319个基因,联合WGCNA枢纽模块交集得到与细菌性败血症发病相关的10个枢纽基因(MMP9、ITGAM、CSTD、GAPDH、PGLYRP1、FOLR3、OSCAR、TLR5、IL1RN和TIMP1);GSEA分析获得关键通路(氨基酸糖类-核糖代谢、PPAR信号通路、聚糖生物合成通路、自噬调控通路、补体、凝血因子级联反应、尼古丁和烟酰胺代谢、不饱和脂肪酸生物合成和阿尔兹海默症通路)及生物学过程(类固醇激素分泌、腺苷酸环化酶的激活、细胞外基质降解和金属离子运输)。【结论】本项研究通过GEO2R、GSEA联用WGCNA分析,筛选出与细菌性败血症发病相关的2个枢纽模块、10个枢纽基因以及一些关键信号通路和生物学过程,可为后续深入研究细菌性败血症致病机制奠定理论依据。     

MEK1/2抑制剂U0126抑制肠道病毒71型的复制

为了揭示肠道病毒71型(enterovirus71,EV71)的复制与宿主细胞Raf/MEK/ERK信号通路(简称ERK通路)的相互关系,本研究应用临床诊断为手足口病的患儿疱疹液,通过易感细胞分离培养、RT-PCR及序列测定,以及Western印迹技术等方法,成功分离到EV71临床株.进一步用该分离株感染易感细胞,通过观察宿主细胞p-ERK1/2蛋白磷酸化水平、病毒特异性衣壳蛋白VP1水平、病毒半数组织培养感染量(50%tissue culture infectious dose,TCID50),以及感染细胞的CPE等指标,以期揭示ERK通路在EV71复制的作用.结果表明,EV71的复制可引起细胞ERK通路的活化;而用MEK1/2特异性的抑制剂U0126预先抑制ERK通路的活化,可显著地降低受染细胞上清液中的病毒的感染滴度(以TCID50表示)、受染细胞中EV71VP1蛋白水平、受染细胞中EV71核酸水平,以及受染细胞的细胞病变效应(cytopathic effect,CPE).提示ERK信号通路的活化对EV71的复制具有重要的作用.本研究为进一步阐明EV71在宿主细胞内的复制机制、寻找新型抗病毒靶标等研究奠定了良好的基础.     

抗肠道病毒71型的药物研究进展

肠道病毒71型（Enterovirus 71,EV71）是引起重症手足口病（Hand,Foot and Mouth Disease,HFMD）的主要病原体。重症HFMD进展迅速,可表现为严重的神经系统并发症,甚至危及生命。目前临床上防治EV71感染缺乏特异、高效的药物,其残疾率和死亡率很高。随着研究的深入,已经发现了大量具有抗EV71能力的化合物,人们探索的药物机制和药物靶点各不相同。因此,本文从药物靶向病毒、宿主等角度出发,针对抗EV71感染的天然药物、合成药物及常见中药中活性成分作用机制的最新进展进行综述与讨论。此外,对抗病毒药物筛选技术进行简要概述,以期为抗EV71药物的筛选与研发设计等相关研究提供参考。     

牛痘病毒感染人巨噬细胞基因表达谱的RNA-Seq分析

[目的] 利用RNA-Seq,分析人巨噬细胞在牛痘病毒（VACV）感染前后基因表达的变化,探索牛痘病毒与宿主细胞相互作用的机制。[方法] 用牛痘病毒感染人巨噬细胞,采用RNA-Seq比较感染组和对照组的差异表达基因,并进行KEGG、GO以及STRING网络分析。[结果] 感染组与对照组相比,筛选出显著性差异表达基因4796个,其中上调表达2416个,下调表达2380个。KEGG富集分析表明差异基因主要参与新陈代谢、信号转导、免疫系统和感染疾病等通路。GO功能注释显示这些基因富集在细胞功能调控、物质代谢和免疫调控等生命过程。运用STRING在线蛋白互作数据库,对NOD样信号通路进行分析,鉴定出以JUN、CHUK、IL1B和PYCARD 为核心的调控基因。[结论] 牛痘病毒感染可以诱导人巨噬细胞基因差异性表达,涉及的生物学过程有很多,对免疫相关的信号通路进行深入的分析,发现C型凝集素受体信号通路（C-type lectin receptor signaling pathway）、Toll样受体信号通路以及NOD样通路等多条通路可能参与调控牛痘病毒感染引起的炎症反应,该研究为解析牛痘病毒的感染机制和免疫逃逸机制以及其在临床上治疗感染性疾病和癌症提供了新思路。     

肠道病毒71型与天然免疫系统相互作用的研究进展

肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71)为小RNA病毒科肠道病毒属成员,是引起手足口病的主要病原体之一。EV71流行广泛,其感染可引发中枢神经系统疾病,并造成重症手足口病,给公共卫生安全带来极大挑战。EV71的致病机制与病毒和宿主天然免疫系统的相互作用关系密切,涉及病毒逃逸干扰素反应、病毒抑制核因子κB(nuclear factorκB,NF-κB)信号通路及病毒与天然免疫细胞相互作用等多个环节。本文就近年来EV71与宿主天然免疫系统相互作用的研究进展进行综述。     

白木香 3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶 A 合酶(AsHMGS)基因的克隆与表达分析简

以白木香（Aquilaria sinensis(Lour.) Gilg）茎cDNA为模板,采用反转录PCR及RACE技术分离得到HMGS基因cDNA全长。序列分析表明该基因序列全长1 831 bp,共编码465个氨基酸,推导的蛋白质分子量为51.4 kD,理论等电点6.25,命名为AsHMGS。推导的AsHMGS蛋白质序列具有植物HMGS酶的典型结构,并预测出HMGS酶的活性中心。系统进化树分析表明,AsHMGS蛋白与拟南芥、琴叶拟南芥、芥菜的相应蛋白相似度最高,其次为人参、喜树和野茶树。荧光定量PCR结果显示,茉莉酸甲酯能诱导白木香AsHMGS的表达。     

A network-based gene-weighting approach for pathway analysis

Classical algorithms aiming at identifying biological pathways significantly related to studying conditions frequently reduced pathways to gene sets, with an obvious ignorance of the constitutive non-equivalence of various genes within a defined pathway. We here designed a network-based method to determine such non-equivalence in terms of gene weights. The gene weights determined are biologically consistent and robust to network perturbations. By integrating the gene weights into the classical gene set analysis, with a subsequent correction for the "over-counting" bias associated with multi-subunit proteins, we have developed a novel gene-weighed pathway analysis approach, as implemented in an R package called "Gene Associaqtion Network-based Pathway Analysis" (GANPA). Through analysis of several microarray datasets, including the p53 dataset, asthma dataset and three breast cancer datasets, we demonstrated that our approach is biologically reliable and reproducible, and therefore helpful for microarray data interpretation and hypothesis generation.     

丝状真菌目标基因替换过程中的策略与方法

目标基因替换是基因功能分析的重要手段。随着基因组测序和转化技术的进展, 该技术在丝状真菌功能基因组学中的应用越来越广泛, 新的体系与方法不断建立和完善。文章在转化体系、打靶载体构建、突变体筛选等方面综述了丝状真菌目标基因替换过程中的策略与方法, 并对各方法的优缺点及发展趋势进行了评述。     

水曲柳FmWRKY44基因克隆及表达分析

克隆水曲柳FmWRKY44基因,探究其在非生物胁迫和激素胁迫中的作用。利用水曲柳干旱转录组序列设计特异引物,克隆FmWRKY44基因的完整ORF序列,并对该序列及其编码产物进行生物信息学分析,采用qRT-PCR技术分析FmWRKY44表达模式。克隆了一个水曲柳WKRY基因,编码区长1383bp,编码460氨基酸。对其编码蛋白分析发现其为稳定亲水蛋白,亚细胞定位预测主要在细胞核,进行保守域及同源性分析分析,属于WRKYⅠ类家族,命名为FmWRKY44。qRT-PCR分析发现,FmWRKY44在种子中高度表达,并不同程度响应低温、高温、盐和干旱4种非生物胁迫。同时发现FmWRKY44与NAA、ABA、GA3、JA植物激素响应,水曲柳FmWRKY44基因积极响应低温、高温胁迫。     

鸽源H5N1亚型禽流感病毒株的HA和NA基因特征性分析

本研究自行设计合成两对特异性引物,通过RT-PCR扩增出1株鸽源H5N1亚型禽流感病毒血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）两个基因的cDNA片段,将它们成功克隆于pMD18-T载体上,然后进行序列测定。结果表明,HA基因全长1707bp,编码568个氨基酸, HA基因有7个糖基化位点,在裂解位点附近有连续6个碱性氨基酸（R-R-R-K-K-R）的插入,具有高致病性毒株的分子特征。受体结合位点的氨基酸分别为YWIHELY,左侧壁氨基酸为SGVSSA,右侧壁为NGQSGR;NA基因全长1350bp,编码446个氨基酸,NA基因有3个糖基化位点。     

刺芹侧耳两种保护酶基因的克隆、分析及温度对其表达量的影响

为了探究温度胁迫下刺芹侧耳中过氧化氢酶和铜锌超氧化物歧化酶基因的作用,本研究通过RT-PCR方法对刺芹侧耳转录组数据库检索得到的过氧化氢酶（CAT）和铜锌超氧化物歧化酶（Cu/Zn-SOD）基因进行克隆,并利用荧光定量PCR分析在高低温胁迫下CAT和Cu/Zn-SOD基因的表达量,以探讨刺芹侧耳中这两种保护酶基因在高、低温胁迫下的响应特征。结果表明,克隆得到的CAT和Cu/Zn-SOD基因开放阅读框长度分别为1 581bp和582bp,分别编码526个和193个氨基酸,分子量分别为59.6kDa、19.62kDa,等电点分别为6.35、6.31。在高温（35℃）和低温（4℃）两组处理中,CAT和Cu/Zn-SOD基因的表达量及酶活均在处理48h时达到最高且与对照组呈现显著差异,说明两种基因在刺芹侧耳抵御高低温胁迫的过程中具有重要作用。本研究结果初步研究了温度胁迫下刺芹侧耳中CAT与Cu/Zn-SOD基因的生物学功能,为进一步解析刺芹侧耳抵抗温度胁迫的机理奠定基础。     

西瓜防御素基因ClPDF2.1的克隆及表达分析

该研究从西瓜中克隆了西瓜防御素基因ClPDF2.1(GenBank登录号为KC481267)。序列分析结果表明,ClPDF2.1基因开放阅读框为225bp,编码75个氨基酸,预测蛋白质分子质量为8.237kD,等电点为9.375。蛋白质结构分析表明,ClPDF2.1蛋白含有防御素特有的8个半胱氨酸结构域。进化分析显示,ClPDF2.1与拟南芥PDF2归为一类,与五彩椒的亲缘关系最近(59%)。荧光定量PCR分析表明,ClPDF2.1在西瓜根、茎、叶器官中都有表达,叶中表达量高于根,茎中表达量最低。ClPDF2.1基因的表达也受到外源植物激素水杨酸、茉莉酸甲酯、乙烯利和西瓜枯萎病菌的诱导上调,表明ClPDF2.1基因通过信号传导途径参与对西瓜枯萎病菌株的防御反应。西瓜防御素基因的克隆及表达分析为其功能鉴定奠定了基础。