GUS在植物基因功能研究中的应用和优化

β-葡糖醛酸酶(GUS)报告系统是现代分子生物学研究领域中被广泛使用的一种重要工具,在解析基因时空表达调控的研究中发挥着重要作用.本文概述了报告基因GUS的生化特性及检测手段,从启动子元件鉴定、基因诱捕、无标记转基因技术等方面论述GUS的应用现状和优势,并针对内源GUS、GUS抑制因子等问题和改进优化手段进行了分析,为该技术在植物功能基因研究中进一步拓展提供新线索和思路.     

GUS报告系统在植物基因功能研究中的应用和优化

β-葡糖醛酸酶(GUS)报告系统是现代分子生物学研究领域中被广泛使用的一种重要工具,在解析基因时空表达调控的研究中发挥着重要作用.本文概述了报告基因GUS的生化特性及检测手段,从启动子元件鉴定、基因诱捕、无标记转基因技术等方面论述GUS的应用现状和优势,并针对内源GUS、GUS抑制因子等问题和改进优化手段进行了分析,为该技术在植物功能基因研究中进一步拓展提供新线索和思路.     

荧光素酶及其应用

介绍了细菌荧光素酶基因(lux)和萤火虫荧光素酶基因(luc)的结构特点和二者的差异,概述了该酶作为报告基因在基础研究和实践(污染物监测、急性毒性和遗传毒性监测、微生物监测等)中的应用,肯定了该酶作为报告基因的广阔应用前景。     

报告基因的选择及其研究趋向

报告基因是一种编码某种易于检测蛋白质或酶的基因,通过它的表达产物来标定目的基因的表达调控。由于具有灵敏度高,检测方便等特点,报告基因技术在转基因,启动子分析以及药物筛选等领域有了广泛的应用。近年来,随着荧光分析方法和技术的进步,荧光素酶和绿色荧光蛋白成为众多报告基因中的后起之秀,本文以这两个报告基因为重点,综述了报告基因的特点,应用,近年来的进展以及未来发展方向。     

雄激素应答元件假冒DNA对PSA基因启动子的抑制作用

研究雄激素应答元件假冒DNA(AREdecoy)对前列腺特异抗原 (PSA)基因启动子的抑制作用 .联合运用报告基因和假冒DNA策略 ,构建了含PSA基因 5′侧启动子区 6 40bpDNA的萤光素酶表达载体pGL3 PSA ,与人工合成的双链硫代ARE假冒DNA共转染前列腺癌细胞株PC3 M并作用不同的时间 (2 4h、4 8h、72h) .应用双萤光素酶测定系统 ,检测萤光素酶的表达活性 .结果显示 :AREdecoyDNA显著抑制报告基因萤光素酶的表达 ,抑制率可达 95 % ,而对照decoyDNA无此作用 .作用不同的时间对萤光素酶活性的抑制无显著性差异     

萤光素酶报告基因在病毒学研究中的应用

萤光素酶是一类在氧气存在下能催化其底物特异性发光的酶,检出灵敏度高、特异性强。萤光素酶催化底物发光因无须外源光的激发,避免了非特异性干扰,具有其他报告基因不可替代的优势。萤光素酶基因作为报告基因已成为医学科学研究领域的重要标记工具,具有良好的应用前景。我们简要综述了萤光素酶报告基因在病毒学研究中的应用进展。     

CKLFSF1基因与CKLFSF2基因间存在的顺式作用元件

探讨趋化素样因子超家族成员 1,2基因 (CKLFSF1基因与CKLFSF2基因 )间的短序列对其下游基因表达的调控作用 .运用PCR技术扩增CKLFSF1基因与CKLFSF2基因间的序列 ,将此片段插入含有萤光素酶 (luciferase)报告基因载体上 .以磷酸钙介导基因转染技术 ,将重组质粒以及阴性和阳性对照组质粒转染到HeLa细胞 ,进行瞬时表达分析 .在pGL3 Basic质粒中的报告基因萤光素酶无表达 ,但将CKLFSF1与CKLFSF2基因间的序列插入到启动子上游或下游后 ,显著抑制其下游基因的表达 ,萤光素酶活性明显降低 .结果提示 ,CKLFSF1与CKLFSF2基因间的序列不具有启动子活性 ,但是该序列对其下游基因表达具有负调控作用     

LCRG1基因启动子关键顺式调节元件的鉴定

LCRG1基因(laryngeal carcinoma related genel,LCRG1)是一个新的喉癌候选抑瘤基因,其转录调控机制一直未被阐明.通过限制性内切酶酶切介导对LCRG1基因(-169～+127)区域进行剪切体分析,将LCRG1基因最小启动子定位于-169～-57.应用连接体扫描突变体分析,将关键顺式作用元件确定在-137～-122.生物信息学提示该区存在SP1、E2F1/DP1、EKLF和ZF9转录因子结合位点.利用已知反式作用因子与报告基因质粒进行共转染,提示Sp1为有效的反式作用因子,且能上调LCRG1基因的表达.凝胶迁移阻滞实验确定LCRG1基因关键的顺式作用元件区域具有Sp1结合位点.LCRG1基因启动子-137～-122片段在该基因表达过程中可能起重要作用,为LCRG1基因功能研究提供了新的证据.     

基因捕捉及其在植物基因分离和功能基因组学上的应用

基因捕捉是一种报告基因的随机整合技术。基因捕捉系统已成为分离基因、鉴定基因功能的重要手段。基因捕捉(gene traps)包括增强子捕捉(enhancer trap)、启动子捕捉(promoter trap)和基因捕捉(gene trap),通称为基因捕捉(gcne traps)。在增强子捕捉中,报告基因与一个基本启动子融合,这个启动子不能使报告基因表达,但可被临近的增强子激活。在启动子捕捉和基因捕捉中,报告基因的启动子被去除,融合基因只有以正确的方向插入到转录单元内才能表达。对基因捕捉系统的结构特征、构建方法、应用范围、研究现状和应用前景等作了系统论述,并对有关问题进行了讨论。     

粘质沙雷氏菌几丁质酶基因的研究进展

几丁质酶具有降解几丁质的作用,其降解产物氨基寡糖和几丁低聚糖在农业、食品、医药等领域具有重要的应用价值和广泛的应用前景。自然界中多种微生物可以产生几丁质酶,而其在细菌体内的合成受精密调控。粘质沙雷氏菌作为一种高产几丁质酶的菌种,在农业生防领域具有很大的应用潜力。本综述从粘质沙雷氏菌几丁质酶基因的分类和结构特征、几丁质酶基因克隆、表达和调控以及几丁质酶的应用等方面论述了粘质沙雷氏菌几丁质酶基因的研究进展,为粘质沙雷氏菌几丁质酶基因和功能蛋白的利用提供理论基础。     

植物抗病基因同源序列及其在抗病基因克隆与定位中的应用

近10年来已有20多个植物抗病基因被克隆,测序,这些抗病基因所编码的蛋白中大多含有核苷酸结合位点,富含亮氨酸重复序列,蛋白激酶,亮氨酸拉链结构,跨膜结构域,Toll白介素－1区域等保守结构域。利用这些保守结构域合成PCR引物,已扩增出大量的植物抗病基因同源序列（RGA）。对RGA与抗病基因的关系进行了分析,讨论了RGA在研究抗病基因进化中的作用,指出RGA在抗病基因定位和转基因中具有重要意义。     

学习记忆相关基因研究进展

学习记忆是脑的重要功能之一,与学习记忆相关的基因很多,它们通过影响突触功能、信号转导、转录和翻译控制、能量代谢等途径进行学习记忆行为的调控。研究相关基因可为阐明学习记忆的分子机制和遗传机制奠定基础。     

鲜切花保鲜相关调控基因研究进展

对切花保鲜相关调控基因：ACC氧化酶基因（CAO）,ACC合成酶基因（ACS）,ert-1基因和切花保鲜相关调控因子;乙醇、乙醛、DPSS和钴等做一综述。     

USP22基因克隆及其融合蛋白真核表达载体的构建

目的克隆人类泛素水解酶22（ubiquitin—specific processing enzyme22,USP22）基因,构建与绿色荧光蛋白融合表达的真核载体。方法利用RT—PCR技术以HeLa细胞总RNA为模板分别扩增USP22基因cDNA序列两片段,依次插入真核表达载体pEGFP—N1;重组质粒转染HEK293T细胞,观察融合蛋白表达及绿色荧光的分布。结果测序结果显示USP22序列与GenBank收录数据一致,酶切显示重组质粒pEG—FP—USP22构建无误,质粒转染后有80％左右HEK293T细胞表达绿色荧光,且在胞质与胞核中广泛分布。结论成功克隆USP22基因并构建与GFP融合表达的真核载体,为进一步深入研究USP22基因的生物学功能奠定了基础。     

通用真核质粒表达载体的构建

利用真核基因表达调控的原理,以pSV2-dhfr为起始材料,构建了两个通用的真核质粒表达载体pMAML1-dhfr和pMAML2-dhfr,它们包含人巨细胞病毒立即早期启动子/增强子调控元件,由两个转录方向相同或相反的表达单元组成.以荧火虫荧光素酶基因为报道基因,β-半乳苷酶基因为内对照,借助COS-7短暂表达系统,研究了它们对荧光素酶表达的影响,并比较了它们与出发载体pSV2-dhfr的相对强弱.     

MEK5基因siRNA重组腺病毒表达载体的构建及其对MEK5的表达抑制

目的 构建人MEK5基因的小干扰RNA（siRNA）重组腺病毒表达载体,观察其在胃腺癌SGC7901细胞中对MEK5的表达抑制.方法 设计并合成针对人MEK5基因3个不同部位siRNA靶点的模板DNA序列,以MluⅠ及XhoⅠ克隆入pRNAT-H1.1/Adeno穿梭载体中,将得到的重组穿梭质粒用PmeⅠ线性化后在大肠埃希菌BJ5183中与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1进行同源重组.将PacⅠ酶切鉴定正确的重组腺病毒质粒经乙醇沉淀后转染293A细胞,包装得到具有感染能力的pAd-MEK5-siRNA重组腺病毒.病毒体外转导人胃腺癌SGC7901细胞,Western印迹法检测其对MEK5表达的抑制.结果 经酶切和测序鉴定均证实pAd-MEK5-siRNA重组腺病毒载体构建成功,其插入序列正确无误.Western印迹检测结果显示pAd-MEK5-siRNA2可抑制MEK5基因的表达,其有效抑制率达75.5 %.结论本研究成功地构建了针对人MEK5基因的siRNA重组腺病毒载体,为进一步深入研究MEK5基因在人胃腺癌细胞中的作用和功能奠定了基础.     

Control of PHERES1 Imprinting in Arabidopsis by Direct Tandem Repeats

Genomic imprinting is an epigenetic phenomenon that causes monoallelic expression of specific genes dependent on the parent-of-origin. Imprinting of the Arabidopsis gene PHERES1 requires the function of the FERTILIZATION INDEPENDENT SEED （FIS） Polycomb group complex as well as a distally located methylated region containing a tandem triple repeat sequence. In this study, we investigated the regulation of the close PHERES1 homolog PHERES2. We found that PHERES2 is also a direct target gene of the FIS Polycomb group complex, but, in contrast to PHERES1, PHERES2 is equally expressed from maternal and paternal alleles. Thus, PHERES2 is not regulated by genomic imprinting, correlating with the lack of tandem repeats at PHERES2. Eliminating tandem repeats from the PHERES1 locus abolishes PHERES1 imprinting, demonstrating that tandem repeats are essential forPHERES1 imprinting. Taking these results together, our study shows that the recently duplicated genes PHERES1 and PHERES2 are both target genes of the FIS Polycomb group complex but only PHERES1 is regulated by genomic imprinting, which is likely caused by the presence of repeat sequences in the proximity of the PHERES1 locus.     

醛固酮对大鼠主动脉bax基因表达的影响

目的研究醛固酮对大鼠主动脉bax基因表达的影响。方法32只SD大鼠随机分为空白对照组、腺瘤组、腺瘤＋依普利酮组和腺瘤＋肼苯哒嗪组。在每只大鼠皮下埋植的微量渗透泵内注入空白溶剂或醛固酮。8周后通过免疫组化、RT—PCR和Western印迹检测主动脉bax基因的表达。结果与对照组相比,腺瘤组大鼠主动脉bax mRNA和蛋白表达都显著上调（P〈0．05）;依普利酮能够抑制醛固酮对bax基因的诱导作用（P〈0．05）;而肼苯哒嗪虽然可以使大鼠收缩压下降,但不能阻止醛固酮对bax基因的作用。结论醛固酮通过诱导bax基因表达,调节血管平滑肌细胞凋亡和干预细胞周期进程,可能是其导致血管重构的机制之一。     

反转录病毒基因治疗载体及其安全性评价

反转录病毒载体是目前基因治疗中应用最广泛的基因运载工具之一,具有能稳定整合入宿主细胞、持久表达目的基因、感染细胞范围广、基因容量较大等优点,但其生物安全性还存在争议。在简要介绍反转录基因治疗病毒载体的基础上,对反转录病毒载体中外源目的基因的表达调控及反转录病毒载体的安全性评价进行了综述。