微载体上依赖于整合蛋白α2亚基的细胞与细胞外基质的粘附(英文)

Ｖｅｒｏ细胞是肾上皮细胞,合成并分泌层粘连蛋白和ＩＶ型胶原,从而在细胞外形成对细胞生长、迁移等有重要影响的细胞外基质膜。已知影响细胞与细胞外基质相互作用的蛋白质分子是整合蛋白。微载体所提供的三维立体培养条件与细胞在体内的生长、迁移条件相似,为在体外研究体内类似过程提供了很好的模型。通过蛋白质印迹法可以检测到：正常培养条件下,在微载体上培养４８小时,Ｖｅｒｏ细胞表达整合蛋白α２亚基（Ｆｉｇ．１ａ）;如果同时加入层粘连蛋白,α２亚基的表达量显著提高（Ｆｉｇ．１ｂ）。正常培养条件下,培养１０天,Ｖｅｒｏ细胞在微载体上形成密集的多层生长,α２亚基表达量明显高于培养初期（Ｆｉｇ．１ｃ）。间接免疫荧光标记（Ｆｉｇ．２）和免疫电镜观察（Ｆｉｇ．３）证实：在层粘连蛋白作用下,α２亚基大量表达,并定位于细胞“附着斑”位置的细胞膜上。此时,如果再用抗层粘连蛋白抗体处理,可观察到原“附着斑”消失,α２亚基在细胞内呈散布状（Ｆｉｇ．４）。整合蛋白α２亚基的表达和与层粘连蛋白形成的“附着斑”提供了Ｖｅｒｏ细胞在微载体上附着和迁移的基础。可能,不同的细胞外基质可以通过不同的整合蛋白来调节细胞活动。     

Vero细胞在微载体上的附着研究

本文着重考查了Vero细胞在几种不同微载体表面的附着情况。发现Vero细胞在Cytode x1微载体系列上附着快于在明胶微载体系列上的附着,试验力求寻得一种更加适合于Vero细胞附着,生长的微载体,实验证明化工自制Ⅰ号微载体与CytodeX1无明显差别,为国产化微载体打下了基础。     

组成型过量表达hTERT对Vero细胞体外培养生物学特性的影响

目的：考察组成型过量表达人端粒酶催化亚单位（hTERT）对Vero细胞在无血清培养体系中的细胞形态、生长和代谢的影响。方法：以组成型过量表达hTERT的Vero细胞系T1为研究对象,以活细胞密度和细胞活力为主要观察指标,结合细胞形态和贴附伸展动态,考察T1细胞和野生型Vero细胞在静止贴附培养、微载体固定化培养和悬浮培养体系中的细胞生长;以葡萄糖比消耗速率（qglc）、乳酸比生成速率（qlac）、乳酸转化率（Ylac/glc）和谷氨酰胺比消耗率（qgin）为反映细胞代谢的主要观察指标,考察T1细胞和野生型Vero细胞在静止贴附培养、微载体固定化培养的细胞代谢。结果：hTERT组成型过量表达在降低Vero细胞的贴附伸展能力和对血清的依赖程度的同时,提高了细胞无血清批次培养后期的细胞活力和活细胞密度,并赋予了T1非贴附依赖性生长的能力。hTERT组成型过量表达未对Vero细胞的代谢产生明显的影响。结论：hTERT组成型过量表达可降低Vero细胞的贴附生长依赖性和对血清的依赖程度,是有应用潜力的改良哺乳动物细胞体外培养性状的技术途径。     

模拟微重力条件下 WB-F344细胞的三维培养

与传统的单层平面培养相比,细胞三维培养可更好地模拟生物体内细胞的生长状态和微环境.以Cytodex-3微载体为支持物,利用旋转式细胞培养系统（RCCS）模拟微重力条件,悬浮培养法构建大鼠WB-F344细胞微重力三维培养模型.并通过细胞计数、光学显微镜、透射电镜、逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）和流式细胞术等方法分析了细胞增殖、显微结构、粘附分子及钙粘蛋白（E-cadherin）表达情况.结果表明,模拟微重力三维培养条件下WB-F344细胞增殖块,呈紧密多层排列、可见丰富的微绒毛和线粒体、胞间有桥粒和紧密连接形成,细胞粘着力加强、表现出良好的三维生长特征;与静置三维培养相比,纤粘连蛋白（Fn）mRNA表达呈上调趋势,细胞内E-cadherin表达量增加,这可能是微重力效应下细胞粘附力增强的部分机制.该培养体系可能有利于细胞之间,细胞与胞外基质之间相互作用及其作用机制的研究.     

Vero细胞在不同微载体固定化培养中的生长和代谢

目的:比较Vero细胞在不同的商品化微载体中固定化培养的生长和代谢。方法:以Vero细胞在含1%新生牛血清的DMEM/F12中培养的细胞形态、活细胞密度和细胞活力为指标,考察Vero细胞在2D MicroHex、Biosilon、Cytodex1和Cytopore1微载体固定化培养的细胞生长;以葡萄糖比消耗速率(qglc)、乳酸比生产速率(qlac)、谷氨酰胺比消耗速率(qgln)和谷氨酸比生产速率(qglu)为指标,考察Vero细胞在不同微载体固定化培养的细胞代谢。结果:Vero细胞在2DMicroHex、Biosilon、Cytodex1和Cytopore1微载体固定化培养7d的活细胞密度分别为18.4×105cells/ml、21.9×105cells/ml、23.9×105cells/ml和16.2×105cells/ml,生长在Cytodex1表面的Vero细胞分布均匀、形态清晰;Vero细胞在不同微载体固定化培养的代谢指标基本相同。结论:Vero细胞在Cytodex1微载体固定化培养的效果优于其它商品化微载体,可作为目前用于病毒疫苗生产的Vero细胞固定化培养的首选微载体。     

N-乙酰氨基葡萄糖转移酶-V过表达对人肝癌细胞迁移及粘附分子表达的影响

为了探讨转染N-乙酰氨基葡萄糖转移酶Ⅴ(GnT-V)正义cDNA后对7721细胞迁移影响及其机制,我们研究了GnT-V/7721和pcDNA3/7721(对照组)两株细胞的迁移力及其与侵袭转移能力密切相关的细胞表面重要粘附分子整合蛋白和E-钙粘蛋白的表达情况.通过琼脂滴法检测两株细胞的迁移力;间接免疫荧光法测定细胞表面整合蛋白α5和β1的含量及用RT-PCR方法检测细胞整合蛋白α5和β1的mRNA水平;免疫细胞化学ABC法检测了细胞E-钙粘蛋白表达水平;Western杂交方法检测β-连环蛋白含量.结果发现,7721细胞经转染GnT-V cDNA后,迁移力明显增高;整合蛋白α5亚基的含量比对照组增加2.9倍;β1亚基未见明显变化.α5亚基mRNA水平为对照细胞的2.1倍,β1亚基的mRNA含量无明显改变.GnT-V/7721细胞E-钙粘蛋白及β-连环蛋白表达也有不同程度的升高.本文结果提示与N-糖链加工有关的GnT-V过表达,可促进7721细胞表面整合蛋白的表达以及E-钙粘蛋白β-连环蛋白的表达,从而增加肿瘤细胞的迁移能力.     

用环境扫描电子显微镜研究Vero细胞在微载体上的生长

使用环境扫描电子显微镜(ESEM), 通过观察Vero细胞在Cytodex-3微载体表面上贴附铺展及增殖生长过程中的形态变化, 分析了细胞在微载体上的贴附与铺展的过程和行为; 考察了外源的层/纤粘连蛋白对细胞铺展形貌的影响, 发现细胞在微载体上的增殖生长以细胞群落延伸扩展的形式进行. 用ESEM图像计数法和结晶紫细胞核计数法获得细胞生长过程的细胞密度变化和生长曲线, 研究了接种密度对细胞生长过程的影响, 随着接种密度的增大, 细胞延迟期缩短, 表观生长速率增大, 细胞长满微载体表面所用的时间缩短. 在实验的血清浓度范围内(5%~10%), 血清浓度影响细胞的贴附, 随着血清浓度的增大, 细胞的贴附率增加, 从而影响整个生长过程.     

Vero细胞微载体培养的化学成分明确无血清培养基的设计

目的：设计适用于Vero细胞微载体培养的化学成分明确无血清培养基。方法：以商品化的DMEM／F12合成培养基为基础培养基,应用Plackett—Burman实验设计和响应面分析法设计支持Vero细胞微载体培养的化学成分明确无血清培养基。结果：以细胞密度为评价指标,在单因素实验的基础上采用Plackett-Burman实验设计考察10种培养基添加成分对Vero细胞生长的影响,确定了3种对Vero细胞生长起明显促进作用的培养基添加成分,为胰岛素、血清素和腐胺。继而利用响应面法分析了这3种添加成分的最佳水平范围,设计了一种支持Vero细胞贴附培养的无血清培养基（VERO—SFM—A）。在Bellco搅拌式培养瓶中采用VERO-SFM．A和Cytodex1微载体培养Vero细胞,细胞密度由接种时的4×10^5cells／ml增加到培养6d后的22．3×10^cells／ml,细胞活力保持在96％以上。结论：VERO—SFM—A能够有效地支持Vero细胞在微载体表面固定化生长并达到较高的细胞密度,具有实际应用于Vero细胞微载体规模化培养的应用潜力。     

层粘连蛋白在Vero细胞分泌物中的免疫电镜定位

本研究采用胶体金间接免疫标记电镜技术证实,Ｖｅｒｏ细胞在微载体培养过程中分泌胶原蛋白纤维．并形成网状结构;Ｖｅｒｏ细胞还分泌层粘连蛋白．与胶原纤维结合,构成细胞外基质;层粘连蛋白分布在基质膜与细胞连接的部位,参与细胞与细胞外基质的粘附。     

组成型过量表达hTERT 对Vero 细胞体外培养生物学特性的影响

目的:考察组成型过量表达人端粒酶催化亚单位(hTERT)对Vero细胞在无血清培养体系中的细胞形态、生长和代谢的影响。方法:以组成型过量表达hTERT的Vero细胞系T1为研究对象,以活细胞密度和细胞活力为主要观察指标,结合细胞形态和贴附伸展动态,考察T1细胞和野生型Vero细胞在静止贴附培养、微载体固定化培养和悬浮培养体系中的细胞生长;以葡萄糖比消耗速率(qglc)、乳酸比生成速率(qlac)、乳酸转化率(Ylac/glc)和谷氨酰胺比消耗率(qgln)为反映细胞代谢的主要观察指标,考察T1细胞和野生型Vero细胞在静止贴附培养、微载体固定化培养的细胞代谢。结果:hTERT组成型过量表达在降低Vero细胞的贴附伸展能力和对血清的依赖程度的同时,提高了细胞无血清批次培养后期的细胞活力和活细胞密度,并赋予了T1非贴附依赖性生长的能力。hTERT组成型过量表达未对Vero细胞的代谢产生明显的影响。结论:hTERT组成型过量表达可降低Vero细胞的贴附生长依赖性和对血清的依赖程度,是有应用潜力的改良哺乳动物细胞体外培养性状的技术途径。     

整合蛋白α5β1过表达诱导人肝癌细胞SMMC-7721“失巢凋亡”机理

为了进一步阐明整合蛋白α5 β1过表达诱导非粘着状态的人肝癌细胞SMMC 772 1失巢凋亡的机理 ,利用poly HEME阻断细胞贴壁 ,诱导失巢凋亡 ,在poly HEME包被的 96孔板中检测细胞生存率 .利用Western印迹法检测了与细胞信号转导密切相关的粘着斑激酶 (FAK)、蛋白激酶B(PKB)及生存蛋白survivin的表达水平 .α5 β1过表达细胞株在去粘附状态下的生存率明显低于对照细胞 .在生长 8d时 ,以整合蛋白不同亚单位转染的α5 β1 772 1、β1 772 1和α5 772 1细胞 ,活细胞数分别降至对照组的 4 0 %、4 5 %和 83% .这说明整合蛋白α5 β1过表达细胞株 ,特别是α5 β1 772 1和 β1 772 1细胞的失巢凋亡明显加快 .细胞悬浮生长 2 4h后 ,α5 β1过表达细胞株都有不同程度的凋亡发生 ;同时粘着斑激酶 (FAK)和蛋白激酶B(PKB)表达量及其磷酸化水平均低于对照细胞 ,而survivin表达水平在α5 β1 772 1中最高 ,在 β1 772 1中最低 .在给予天然细胞外基质纤粘连蛋白的条件下 ,α5 β1 772 1和 β1 772 1细胞的FAK和PKB的磷酸化水平却呈升高趋势 .结果说明 ,FAK和PKB的变化与细胞的粘附状态密切相关 ,并且参与整合蛋白α5 β1过表达细胞在去粘附状态下失巢凋亡的发生 .     

模拟微重力条件下WB-F344细胞的三维培养

与传统的单层平面培养相比,细胞三维培养可更好地模拟生物体内细胞的生长状态和微环境。以Cytodex-3微载体为支持物,利用旋转式细胞培养系统(RCCS)模拟微重力条件,悬浮培养法构建大鼠WB-F344细胞微重力三维培养模型。并通过细胞计数、光学显微镜、透射电镜、逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和流式细胞术等方法分析了细胞增殖、显微结构、粘附分子及钙粘蛋白(E-cadherin)表达情况。结果表明,模拟微重力三维培养条件下WB-F344细胞增殖块,呈紧密多层排列、可见丰富的微绒毛和线粒体、胞间有桥粒和紧密连接形成,细胞粘着力加强、表现出良好的三维生长特征;与静置三维培养相比,纤粘连蛋白(Fn)mRNA表达呈上调趋势,细胞内E-cadherin表达量增加,这可能是微重力效应下细胞粘附力增强的部分机制。该培养体系可能有利于细胞之间,细胞与胞外基质之间相互作用及其作用机制的研究。     

Vero细胞微载体不同培养方法的评价

对三种不同培养方法进行细胞生长速度、密度、营养及代谢产物浓度的比较分析,以优化和筛选最佳培养条件与方式。用同体积生物反应罐,基本培养条件相同,采用批培养、再循环培养、灌流培养三种方式进行了Vero细胞微载体（CytodexI）的周期培养。三种培养方法均达到预期效果,最终细胞密度分别为每毫升2.09×10     

佛波酯对NIH3T3细胞整合蛋白α_5亚基表达的影响

１００ｎｍｏｌ／Ｌ佛波酯（１２－Ｏ－ｔｅｔｒａｄｅｃａｎｏｙｌｐｈｏｂｏｌ１３－ａｃｅｔａｔｅ,ＴＰＡ）作用于ＮＩＨ３Ｔ３细胞２４ｈ,流式细胞仪检测到细胞表面整合蛋白α５亚基含量增加５２．３％．Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交方法测定结果亦表明整合蛋白α５亚基ｍＲＮＡ量增加,于２ｈ时达到高峰,为对照的４．１４倍．蛋白激酶Ｃ（ｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅＣ,ＰＫＣ）的活性增加趋势与之基本一致．运用ＰＫＣ的抑制剂鞘氨醇（ｓｐｈｉｎｇｏ－ｓｉｎｅ）和酷氨酸激酶（ｔｙｒｏｓｉｎｅｋｉｎａｓｅ,ＴＫ）抑制剂４,５,７－三羟基异黄酮（ｇｅｎｅｓｔｅｉｎ）进一步研究,发现两者均可抑制佛波酯对整合蛋白α５亚基表达的上调作用．提示佛波酯对ＮＩＨ３Ｔ３细胞整合蛋白α５亚基表达的调控与ＰＫＣ和ＴＫ均有关．     

水分胁迫对小麦幼苗及悬浮培养细胞中诱导蛋白表达的影响

丰抗8号小麦幼苗及成熟胚诱导的悬浮培养细胞在水分胁迫（－1．0MPa PEG6000）下,可溶性蛋白含量与蛋白组分变化有差异,幼苗可溶性蛋白含量高于对照,并随生长的延长呈降低趋势;悬浮培养细胞可溶性蛋白含量低于对照,且略有上升;复水后均可恢复对照水平,SDS－PAGE电泳及薄层扫描分析结果表明,幼苗受水分胁迫诱导,出现44．2kD蛋白亚基,该蛋白亚基含量可随胁迫时间延长上升,复水后消失,在正常条件下悬浮培养细胞中含有44．2kD蛋白亚基表达,轻度胁迫处理时,该蛋白亚基含量上升,对悬浮培养细胞进行水分胁迫,该蛋白则表现下降趋势,复水后又可上升。     

微载体规模化培养细胞的研究

通过实验探索使用微载体进行动物细胞规模化培养,以期达到建立规模化生产病毒疫苗的目的。实验研究了Vero细胞的生长曲线,以及对细胞生长过程中影响细胞生长的葡萄糖、氨含量两个主要因素的变化规律以及微载体浓度与细胞密度的关系。通过实验发现微载体规模化培养细胞易于操作,比传统转瓶培养的细胞密度高,封闭式的培养方式不但减少了污染几率,而且可以充分保证疫苗的质量。最终找出适宜疫苗培养的微载体使用浓度为2.5g/L,适宜的细胞接种浓度为:1~5×105cell/m l。     

hTERT基因组成型过量表达的Vero细胞系的建立

目的:建立组成型过量表达hTERT的Vero细胞系。方法:从质粒pCI-neo-hTERT酶切、分离纯化hTERT cDNA,克隆入phEF/chMAR-hyg载体中,构建重组真核表达质粒phEF/chMAR-hyg-hTERT。采用脂质体转染法转染Vero细胞,经潮霉素筛选、克隆分离培养,用RT-PCR检测转染阳性细胞克隆的hTERT mRNA表达丰度,Western blotting验证高丰度表达hTERT mRNA克隆的hTERT表达。用Cedex AS20细胞密度和活力分析系统考察过量表达hTERT Vero细胞在组织培养板中批次培养的生长特性。结果:从phEF/chMAR-hyg-hTERT转染阳性细胞中筛选出hTERT mRNA和蛋白高丰度表达的Vero细胞系(Vero-T1),Vero-T细胞在批次培养中后期的细胞密度和活力均高于野生型Vero细胞。结论:成功建立了hTERT基因组成型过量表达的Vero细胞系,为探索以组成型过量表达hTERT的技术途径改善细胞培养特性、提高病毒疫苗生产工艺水平奠定了基础。     

2型单纯疱疹病毒毒力蛋白ICP34.5的真核表达及其对Ve-ro细胞活性的影响

目的:在非洲绿猴肾细胞(Vero细胞)中表达2型单纯疱疹病毒(HSV-2)毒力蛋白感染细胞多肽34.5(ICP34.5),并检测其对Vero细胞活性的影响。方法:PCR扩增HSV-2的ICP34.5基因,连接至pEGFP-C2载体,并对重组真核表达载体pEGFP-ICP34.5进行双酶切测序验证;将重组子瞬时转染Vero细胞,RT-PCR检测其在mRNA水平的表达,荧光倒置显微镜观察融合蛋白的表达,MTT法检测细胞活性。结果:经双酶切和测序验证表明pEGFP-ICP34.5构建成功,转染细胞后经RT-PCR验证有目的基因的转录,荧光显微镜下观察到融合蛋白在转染的Vero细胞中表达,MTT法检测结果证实重组质粒可以抵消空质粒对细胞的损伤作用。结论:构建了pEGFP-ICP34.5真核表达载体,其能在Vero细胞中高效表达,并能抵消空质粒对细胞的损伤作用。     

应用生物反应器培养Vero细胞制备EV71病毒初探

目的应用生物反应器培养Vero细胞制备EV71病毒。方法以3 L生物反应器采用4 g/L、8 g/L Cytodex-1微载体培养比较Vero细胞比生长率,并以4 g/L微载体培养EV71病毒。结果 4 g/L微载体培养Vero细胞3～4 d微载体细胞密度达2.3×106/mL,按0.001的感染复数(MOI)接种EV71病毒,病毒收获液的滴度最高达7.90 lgPFU/mL,较静置培养平均高出0.92 lgPFU/mL。结论初步建立了3 L生物反应器微载体培养Vero细胞制备EV71病毒的工艺,为进一步放大生产规模奠定了基础。