多聚唾液酸转移酶研究进展

多聚唾液酸(polysialic acid,PSA)是一类线性、均一多聚α2,8连接唾液酸的独特碳水化合物,它主要通过典型的N-连接糖苷键附着在脊椎动物神经系统神经黏附分子(neural cell adhesion molecule,NCAM)上。PSA通过改变NCAM的黏附性调节神经细胞发育、神经导向以及突触形成,从而在神经发育中起关键作用。PSA表达的调节具有时间和结构依赖性,NCAM的唾液酸化是由两种多聚唾液酸转移酶(polysialyltrans ferases)-ST8Sia II(STX)和ST8Sia IV(PST)所催化,它们都属于6个基因编码的α2,8唾液酸转移酶家族。STX和PST都可将多个唾液酸残基转移到含有NeuNAcα2-3(或6)Galβ1-4GlcNAcβ1-R结构的N糖链受体上;两种酶共同作用时远远大于一种酶形成的PSA量。总之,多聚唾液酸转移酶可调节PSA的合成并参与了脊椎动物的神经发育。     

多聚唾液酸与多聚唾液酸转移酶

多聚唾液酸（PSA）是一种在神经细胞黏附分子（neural cell adhesion molecule,NCAM）上表达的唾液酸聚合物,在神经发育过程中起重要作用.PSA的聚合程度会影响PSA-NCAM的功能.多聚唾液酸酶主要用于合成PSA-NCAM,两种高度同源的多聚唾液酸转移酶ST8SiaⅡ和ST8SiaⅣ都属于唾液酸转移酶家族.多聚唾液酸转移酶中NCAM的识别域和多聚唾液酸化域是截然不同的,且一些异构酶在NCAM多聚唾液酸化中起明显的负作用.多聚唾液酸酶与很多疾病都有关系,以多聚唾液酸转移酶为标靶设计的药物也将成为神经系统及肿瘤治疗的新型药物.     

铁皮石斛的鉴定研究

综述了组织、显微、光谱、色谱及分子生物学技术等鉴定方法在铁皮石斛鉴定中的研究与应用,以期为铁皮石斛的有效鉴定提供科学依据。     

福建冠豸山野生铁皮石斛的显微鉴定

对福建连城冠豸山开展野生铁皮石斛Dendrobium officinale实地调查,发现当地有铁皮石斛分布。对其茎、叶组织构造及茎的显微粉末特征等进行观察,结果表明,铁皮石斛茎维管束外侧的纤维群呈帽状,草酸钙针晶束于近表皮处多见,粉末中含针晶束的黏液细胞以及纤维束外具有含硅质块的细胞等特征可作为该药正确鉴别的依据。     

人胎肝唾液酸转移酶基因的克隆及测序

根据已克隆的唾液酸转移酶的保守区的序列,以人胎肝ｍＲＮＡ为模板扩增出１５０ｂｐ的片段并测序。其中一个片段（ｓ３８）与已克隆的唾液酸转移酶的活性中心有５７％～９７％的同源性。根据ｓ３８的序列合成寡核苷酸并标记后用作探针筛选人胎肝ｃＤＮＡ文库。从文库中分离了一个编码α２,３唾液酸转移酶的ｃＤＮＡ。该ｃＤＮＡ序列含一个编码３４０个氨基酸的开放读框,推导的氨基酸序列与人颌下腺Ｇａｌβ１,３ＧａｌＮＡｃα２,３唾液酸转移酶相同,与猪颌下腺α２,３唾液酸转移酶有８３２％的同源性。表明从人胎肝ｃＤＮＡ文库中分离的ｃＤＮＡ所编码的蛋白为Ｇａｌβ１,３ＧａｌＮＡｃα２,３唾液酸转移酶     

铁皮石斛M型硫氧还蛋白基因的分子特征

利用RT-PCR和RACE技术,从珍稀濒危兰科药用植物铁皮石斛中分离到1个编码M型硫氧还蛋白(TRX)基因cDNA全长,命名为Do TRXm1(GenBank注册号KC178573).序列分析结果表明,DoTRXm1基因长850 bp,ORF(570 bp)编码1条由189个氨基酸组成的肽链,分子量20.32 kD,等电点9.44;DoTRXm1蛋白具有保守的硫氧还蛋白结构域(第87～187位氨基酸)和催化位点(106～124).多序列比对和系统进化分析结果显示,DoTRXm1与植物M型TRXs基因有较高相似性(53％～70％),与水稻、玉米以及高梁等单子叶植物TRXs聚在1个分支,隶属于M型TRXs基因进化系统的Ⅱ类群.实时定量PCR分析显示,DoTRXm1基因为组成型表达,其转录本在石斛根中的相对表达量较高,为叶中的5.63倍,茎中次之(2.35倍),叶中最低.该研究为进一步解析DoTRXml在铁皮石斛生长发育、逆境胁迫等过程中的生物学功能奠定基础.     

铁皮石斛SPL膜结合(STM)转录因子的全基因组鉴定及表达分析

SPL转录因子广泛参与植物生长发育、胁迫响应等过程。目前,没有关于铁皮石斛SPL膜结合(SPL with transmembrane motif)转录因子即STM转录因子的研究。为了探究STM转录因子在铁皮石斛生长发育及胁迫响应等方面的作用,该文在铁皮石斛全基因组水平鉴定出4个STM转录因子,并对DoSTM基因家族成员进行生物信息学分析,又利用逆转录PCR研究了DoSTM在不同组织部位及不同逆境处理下的表达情况。结果表明:(1)DoSTM1-4为亲水蛋白,均具有SBP保守结构域和一些激素响应位点。(2)4个DoSTM在根茎叶中均有表达,DoSTM2在叶中的相对表达量最低; DoSTM1/3/4的相对表达水平均无明显差异。(3)DoSTM1-4在低温、高温、干旱胁迫下的相对表达水平都有显著变化,DoSTM1/3/4的表达量降低最为明显,故推测DoSTM与植物体内激素响应、温度变化响应及抗旱性有关。这些结论为后续进一步开展铁皮石斛STM转录因子的研究提供了参考。     

铁皮石斛WOX转录因子的鉴定和分析

为了解铁皮石斛(Dendrobium officinale)WOX转录因子的功能,采用全基因组分析技术对铁皮石斛WOX家族成员进行鉴定,并进行生物信息学和表达模式分析.结果表明,铁皮石斛基因组中有9个WOX转录因子(DoWOX 1～DoWOX 9),大部分的DoWOXs含有2～3个外显子,启动子含有与激素诱导、逆境胁迫...     

人胎肝唾液酸转移酶基因的克隆及测序*

根据已克隆的唾液酸转移酶的保守区的序列,以人胎肝mRNA为模板扩增出150bp的片段并测序。其中一个片段(s38)与已克隆的唾液酸转移酶的活性中心有57％～97％的同源性。根据s38的序列合成寡核苷酸并标记后用作探针筛选人胎肝cDNA文库。从文库中分离了一个编码α2,3－唾液酸转移酶的cDNA。该cDNA序列含一个编码340个氨基酸的开放读框,推导的氨基酸序列与人颌下腺(Galβ1,GalNAc。Α2,3－唾液酸转移酶相同,与猪颌下腺α2,3－唾液酸转移酶有83.2％的同源性。表明从人胎肝cDNA文库中分离的cDNA所编码的蛋白为Galβ1,3GalNAcα2,3－唾液酸转移酶。     

铁皮石斛DORCA基因的克隆及表达分析

为了研究铁皮石斛的光合特性,根据Rubisco活化酶(RCA)基因的保守序列设计兼并引物,采用RT-PCR和RACE方法从铁皮石斛叶中分离到一个RCA基因,命名为DORCA(GenBank登录号KT205841)。DORCA基因cDNA全长为1 724bp,包含1 317bp开放阅读框(ORF),编码438个氨基酸。系统进化分析显示,DORCA与马蹄莲ZaRCA(AAK25801.1)亲缘关系最近。生物信息学分析表明,DORCA与其他植物的RCA蛋白具有较高一致性,属于RCA的β亚基。DORCA蛋白具有定位于叶绿体的N端转运肽,2个保守的ATP结合结构域和多个磷酸化位点。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析表明,DORCA基因在茎、叶中表达;在自然光周期条件下,DORCA基因在8:30时表达量最高,20:30时表达量最低,具有明显的光诱导表达特性。     

铁皮石斛蔗糖磷酸合成酶基因的克隆与原核表达

应用同源序列克隆法克隆了铁皮石斛蔗糖磷酸合成酶(SPS)基因cDNA全长,并进行了原核表达分析,为进一步研究该基因的时空表达、功能分析及多糖合成机理提供理论依据。结果表明:(1)铁皮石斛SPS基因cDNA全长3 502bp,编码区3 186bp,GenBank登录号JF423929。该基因编码1 061个氨基酸,与文心兰的SPS基因氨基酸序列的一致性最高为93%,与其他科植物SPS基因的氨基酸序列的一致性均高于60%。(2)原核诱导表达结果显示,SPS基因在大肠杆菌中的重组蛋白分子质量约为118.7kD,其表达与序列分析推测的结论一致。(3)生物信息学分析表明,铁皮石斛SPS基因的二级结构包括了螺旋、β-折叠和无规则卷曲,是非跨膜结构的亲水性不稳定蛋白,有2个功能结构域,分别是蔗糖合成功能域及糖基转移功能域。     

铁皮石斛钙网蛋白基因DoCRT1的分子克隆与表达研究

该研究采用RACE克隆铁皮石斛钙网蛋白(calreticulin,CRT)基因DoCRT1,进行生物信息学分析,并借助定量PCR检测基因表达模式,为揭示该基因在铁皮石斛生长发育及逆境生理中的分子作用奠定基础。结果表明:(1)DoCRT1基因(GenBank登录号KT957551)cDNA全长1 672bp,ORF长1 275bp,编码一条由424个氨基酸组成的多肽,分子量49.05kD,等电点4.42,具有CRT蛋白保守的钙网蛋白/钙联接蛋白P结构域(205~320)和类伴刀豆球蛋白凝集素/葡聚糖酶结构域A(20~222)以及多个基序;蛋白N端含有一个信号肽(1~23)和一个跨膜区域(8~24),预测结果显示主要定位于细胞液泡、胞外,与多种植物CRT蛋白一致性很高(80%~87%)。(2)DoCRT1蛋白与OsCRT1/2、ZmCRT1亲缘关系近,聚在CRT进化树的CRT1/2分支。(3)qRT-PCR检测结果显示,DoCRT1基因转录本在石斛根中表达量较高,为叶中的2.23倍,且茎与叶中表达量无显著差异。     

铁皮石斛DoSMT2基因的克隆与表达分析

为了解SMT2基因在铁皮石斛（Dendrobium officinale）甾醇代谢过程中的作用,利用RACE技术克隆到1个DoSMT2基因,开放阅读框为1 089 bp,编码362个氨基酸,DoSMT2相对分子量为40.345 kD,理论等电点为8.13,属于稳定的亲水性蛋白。经BLAST P检索,DoSMT2蛋白属于AdoMet-MTases超级家族,含有4个S-腺苷蛋氨酸结合位点、1个甲基转移酶保守结构域和1个甾醇甲基转移酶C末端保守结构域。系统进化分析表明,DoSMT2与深圳拟兰（Apostasia shenzhenica）的SMT2亲缘关系最近,确定其属于SMT2家族。qRT-PCR分析结果表明,DoSMT2基因在茎和叶都能表达,10月份的表达量最高,叶片的表达量显著高于茎,推断叶片的甾醇代谢比茎活跃。构建了pET-29a-DoSMT2原核表达载体,并转化大肠杆菌BL21（DE3）,IPTG诱导表达出预期大小的蛋白。这为铁皮石斛DoSMT2的甲基化机制及甾醇化合物代谢研究奠定基础。     

兰科菌根真菌对铁皮石斛光合性能及pepc基因表达的影响

为了阐明兰科菌根真菌对铁皮石斛光合作用的影响及机制,采用盆栽方式研究了兰科菌根真菌对铁皮石斛幼苗生长的影响,并分析了叶片中叶绿素含量、光合参数、叶绿素荧光参数以及pepc基因表达的变化。结果表明：（1）兰科菌根真菌促进了铁皮石斛幼苗生长,接种兰科菌根真菌的铁皮石斛的株高、根重、茎叶重和总生物量分别是未接种对照组的1.21、1.54、1.71和1.68倍;而且可显著提高叶片中叶绿素含量、叶片净光合速率（P_n）、蒸腾速率（G_s）和气孔导度（T_r）。（2）接种兰科菌根真菌的铁皮石斛叶片潜在光化学效率（F_v/F₀）、最大光化学效率（F_v/F_m）、光化学猝灭系数（q_P）、非光化学猝灭系数（q_N）、实际光化学反应量子效率（Yield）和表观光合电子传递速率（ETR）均高于未接种对照组。（3）菌根真菌能促进pepc基因的表达,增强PEPC活性,提高铁皮石斛叶片的光合碳同化能力。研究表明,菌根的形成可以提高铁皮石斛叶片光合性能和pepc基因的表达水平,促进铁皮石斛幼苗的生长。     

铁皮石斛内生真菌研究进展

目前已经从不同生境的铁皮石斛(Dendrobium officinale Kimura et Migo)中分离到内生真菌252株,这些内生真菌涵盖了真菌门（Eumycota;Mycobionta）5个亚门中的半知菌亚门(Deuterornycotina)、担子菌亚门(Basidiomycotina)和子囊菌亚门（Ascomycotina）等3个亚门,已经鉴定的内生真菌分属于48个属。有些内生真菌对铁皮石斛的种子萌发和植株生长均有促进作用。对铁皮石斛内生真菌的多样性和分类、铁皮石斛内生菌与宿主的关系进行了综述,探讨研究中存在的问题, 并对今后研究方向提出建议。     

铁皮石斛DoSMT2基因的功能分析

为了揭示铁皮石斛(Dendrobium officinale)甾醇C-24甲基转移酶2基因(DoSMT2)在甾醇代谢过程的功能,该研究通过根癌农杆菌介导法将来源于铁皮石斛的DoSMT2基因转化烟草(Nicotiana tabacum),并采用qRT-PCR技术检测DoSMT2基因在转基因烟草叶片中的表达,采用气相色谱质谱法分析菜油甾醇和谷甾醇的含量。结果显示:(1)成功获得DoSMT2基因的开放阅读框(1 119 bp),并成功构建正义植物表达载体质粒pCXSN-DoSMT2,经农杆菌介导的烟草叶盘转化法转化烟草并鉴定,获得4株阳性转基因烟草植株。(2)Southern blot结果表明,4株转基因烟草植株都有1条杂交信号带,而非转基因烟草植株没有,说明外源DoSMT2基因都以单拷贝整合到4株转基因烟草基因组中。(3)qRT-PCR检测显示,非转基因烟草未检测到外源DoSMT2基因的表达,4株转基因烟草都能检测到DoSMT2基因的表达,且表达水平差异极显著,各株系表达量高低依次为P3P1P2(P4)。(4)气相色谱质谱分析显示,转DoSMT2基因烟草叶片的菜油甾醇含量均极显著低于非转基因烟草叶片,而谷甾醇含量均极显著高于非转基因烟草叶片。研究表明,DoSMT2具有催化24-亚甲基胆甾烯醇转化形成24-亚乙基胆甾烯醇活性。     

兰科菌根真菌对干旱胁迫下铁皮石斛生长和抗氧化能力及相关基因表达的影响

利用盆栽的方式研究了干旱胁迫下接种兰科菌根真菌(OM)对铁皮石斛生长的影响,并分析了铁皮石斛叶片相对含水量、游离脯氨酸含量、电解质渗透率、丙二醛(MDA)含量、活性氧成分、抗氧化酶活性变化,用定量PCR技术分析了相关抗氧化酶基因的表达特性,以探讨菌根真菌对铁皮石斛干旱胁迫的缓解作用及其机制。结果表明：(1)与正常水分条件相比,干旱胁迫显著降低了铁皮石斛幼苗的生物量和叶片相对含水量,提高了叶片电解质渗透率、脯氨酸含量、MDA含量、O-·2产生速率和H2O2水平。(2)菌根真菌能显著提高干旱胁迫下铁皮石斛叶片相对含水量,降低叶片电解质渗透率、脯氨酸含量、MDA含量、O-·2产生速率和H2O2水平;在不同水分条件下,菌根真菌均能有效促进铁皮石斛幼苗生长,其株高、根重、茎叶重和总生物量均大于未接种组。(3)菌根真菌可诱导干旱胁迫下铁皮石斛超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)基因的表达,提高SOD、POD和CAT的活性,有效缓解干旱胁迫对质膜的过氧化伤害。研究认为,菌根真菌能提高干旱胁迫下铁皮石斛的抗氧化酶活性及其相关基因表达水平,增强铁皮石斛抗氧化防御能力,有效缓解干旱胁迫对铁皮石斛幼苗生长的抑制。