FLT-1启动子在血管内皮细胞中特异生物活性的检测及其意义

目的:构建带有组织特异性 FLT-1 启动子的真核表达栽体,检测其在转染的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)中对荧光素酶报告基因表达的驱动能力.方法:采用PCR扩增FLT-1启动子,插入到pGL3-Basic-luc载体中,构建携带FLT-1启动子的真核表达载体pGL3-FLT-Basic-luc,经脂质体法转染HUVEC、HepG2、NIH3T3和HEK293 细胞,于转染48h后采用双荧光报告系统检测荧光素酶表达活性.结果:酶切及测序证实构建的pGL3-FLT-Basic-luc栽体中含有序列正确的FLT-1基因启动子,双荧光报告系统检测显示,转染的HUVEC细胞其荧光素酶活性明显高于HEK293细胞(P<0.01),而转染的HepG2和NIH3T3细胞中未检测出荧光素酶表达.结论:克隆的FLT-1启动子具有较高的血管内皮特异性转录活性,可作为血管疾病靶向基因治疗的启动子来源.     

TALEN质粒转染HEK-293T细胞的条件优化

本研究探讨了TALEN质粒转染HEK-293T细胞的最佳转染条件。以TALEN质粒右臂中的绿色荧光蛋白为报告基因,分别研究转染试剂、质粒DNA的量、转染试剂与质粒DNA的比例对转染效果的影响,转染24 h后荧光显微镜下统计具有代表性视野的绿色荧光细胞,计算绿色荧光细胞/总细胞数的比例得出转染率,并利用CCK-8试剂盒检测细胞存活率。实验结果表明,TALEN质粒转染293T细胞,采用Fugene HD转染试剂比Lipofectamine 2000转染试剂细胞存活率高;以6孔板为例,转染质粒DNA量为4μg时转染效率最高(49.0±8.0)%;Fugene HD与质粒DNA比例(μg/μL)为3:1时转染效率最高。本研究建立TALEN表达质粒转染HEK-293T细胞的最佳转染条件,可作为相关研究或应用提供参考。     

一种在哺乳动物细胞中研究蛋白分子转录激活活性系统的建立

为了在哺乳动物细胞中建立一套用于研究蛋白分子转录激活活性的系统,首先以质粒pTe-Off和真核表达载体pCDNA3.1B(-)/myc-his为基础,分别构建重组质粒pZHO1(用于插入待测基因并作为该系统的阴性对照）,pZHO2（用于作阳性对照）,此外,该系统还包括质粒pTRE-luc(编码Firefly荧光素酶报道基因）和质粒pRL-TK(编码Renilla荧光素酶基因,用作内参对照）,为验证该系统的可行性,分别将质粒pZHO1,pZHO2,pZHO3(编码p53分子N端转灵激活区73个氨基酸片段,作为实验组）与质粒pTRE-luc和pRL-TK共轨染至C4－2,MCF－7,COS7 3种不同的细胞株中,通过检测各转染组细胞中Firefly荧光素酶相对活性的大小来判断该系统的可行性,结果表明,所构建的系统可以在哺乳动物细胞中检测目的分子的转录激活活性。     

FLT-1启动子在血管内皮细胞中特异生物活性的检测及其意义

目的:构建带有组织特异性FLT-1启动子的真核表达载体,检测其在转染的人脐静脉内皮细胞（HUVEC）中对荧光素酶报告基因表达的驱动能力。方法：采用PCR扩增FLT-1启动子,插入到pGL3-Basic-luc载体中,构建携带FLT-1启动子的真核表达载体pGL3-FLT-Basic-luc,经脂质体法转染HUVEC、HepG2、NIH3T3和HEK293细胞,于转染48h后采用双荧光报告系统检测荧光素酶表达活性。 结果:酶切及测序证实构建的pGL3-FLT-Basic-luc载体中含有序列正确的FLT-1基因启动子,双荧光报告系统检测显示,转染的HUVEC细胞其荧光素酶活性明显高于HEK293细胞（P<0.01）,而转染的HepG2和NIH3T3细胞中未检测出荧光素酶表达。结论:克隆的FLT-1启动子具有较高的血管内皮特异性转录活性,可作为血管疾病靶向基因治疗的启动子来源。图     

HBV通过增强DNAJB4启动子活性调节其在HepG2．2．15细胞中的表达

目的初步探讨HBV与DNAJB4基因的转录调节作用机制。方法用RT-PCR及Real—timePCR检测HepG2．2．15细胞和HepG2细胞中DNAJB4在mRNA水平上的表达差异。构建DNAJB4启动子虫荧光素酶报告质粒,分别与HBV、HBs、HBp、HBc、HBx表达质粒共转染HepG2细胞,比较虫荧光素酶活性。结果在mRNA水平上,DNAJB4在HepG2．2．15细胞中的表达量是其在HepG2细胞中表达量的2．59倍,且二者有显著性差异（P〈0．01）。DNAJB4启动子虫荧光素酶报告质粒与HBV表达质粒共转染组的相对荧光素酶活性是其对照组的2．28倍。转染HBs和HBc表达质粒组的相对荧光素酶活性分别是其对照组的2．11倍和1．77倍,而HBx、HBp表达质粒对荧光素酶活性没有影响。结论在HepG2．2．15细胞中,HBV能通过增强DNAJB4启动子活性增加DNAJB4转录水平的表达,其中HBs和HBc蛋白起主要作用。     

乙型肝炎病毒HBx蛋白抑制TTRAP启动子活性的体外研究

旨在探讨体外培养条件下HBx蛋白对TTRAP(TRAF and TNF receptor-associated protein)基因转录水平表达的影响。用RT-PCR及Real-time PCR检测TTRAP在HepG2细胞和HepG2.2.15细胞中的表达;构建TTRAP启动子虫荧光素酶报告质粒;分别与HBV、HBs、HBp、HBc、HBx表达质粒共转染HepG2细胞,比较虫荧光素酶活性。RT-PCR和Real-time PCR结果显示,TTRAP在HepG2.2.15细胞中的表达量分别是其在HepG2细胞中表达量的44.9%和27.8%(P0.05)。TTRAP启动子虫荧光素酶报告质粒与HBV表达质粒共转染组的相对荧光素酶活性,与对照组相比下降了43.8%。转染HBx表达质粒组的相对荧光素酶活性与其对照组相比下降了35%,而转染HBc、HBs及HBp表达质粒组对相对荧光素酶活性没有影响。因此证实HBx蛋白能抑制TTRAP启动子活性。     

探讨穿心莲内酯对HIV-1感染辅助受体CXCR4启动子作用机制的研究

穿心莲内酯具有明显的抗病毒作用,对HIV-1(Human immunodeficiency virus type 1)具有明显的抑制作用,本研究探讨了穿心莲内酯影响CXCR4启动子活性的作用机制。首先构建双荧光素酶报告基因载体pFireRlucCXCR4(C-X-C chemokine receptor 4),并转染入人HEK293T细胞;利用CCK8法检测穿心莲内酯对人HEK293T细胞细胞毒性作用;双荧光素酶报告基因技术检测穿心莲内酯对CXCR4启动子活性的影响;MTT法检测穿心莲内酯对人T淋巴细胞Jurkat细胞活性影响;实时荧光定量PCR检测穿心莲内酯对人T淋巴细胞Jurkat细胞表面CXCR4 mRNA和蛋白表达的影响。PCR分别扩增了CXCR4启动子（777 bp）和Rluc(1 997 bp)表达单元,通过测序和酶切鉴定双荧光素酶报告基因载体插入正确;穿心莲内酯作用于转染pFireRluc-CXCR4HEK293T细胞,双荧光素酶结果显示：穿心莲内酯能够下调CXCR4启动子活性,差异具有显著性（P<0.05）。穿心莲内酯作用于人T淋巴细胞Jurkat细胞后,qPCR...     

丙型肝炎病毒5’非翻译区不同结构域对其启动子活性的影响

在前期工作已证实HCV基因组5’UTRDNA序列具有启动子活性的基础上,分别构建5’UTR不同结构域的DNA序列驱动虫荧光素酶基因表达的质粒pGL3-5’UTR,转染HepG2细胞以及用全长的5’UTRcDNA构建质粒分别转染HepG2、Hela、HEK293、L02细胞,用双荧光素酶检测系统检测虫荧光素酶的表达水平,逆转录聚合酶链反应检测虫荧光素酶基因mRNA水平,并与相应对照作比较。结果显示当四个结构域都具备时,荧光素酶相对活性为5.91±0.65,为SV40启动子的18.7%;失去结构域I以后,荧光素酶相对活性为9.52±0.32;失去结构域I和II以后,荧光素酶相对活性为2.64±0.25;失去结构域III和IV以后,荧光素酶相对活性为0.32±0.09;失去结构域IV以后,荧光素酶相对活性为2.72±0.45,逆转录聚合酶链反应结果与之相符;全长5’UTRcDNA在L02、hepG2、HEK293、Hela细胞中荧光素酶相对活性分别为0.75,0.49,0.23,0.14。结果提示结构域III是HCV5’UTRDNA序列具备启动子活性的核心结构,结构域I对其5’UTRDNA序列的启动子活性具有抑制效应,而结构域II和IV可增强5’UTRDNA序列的启动子活性;HCV5’UTRcDNA的启动子功能无组织特异性,但在正常的肝细胞(L02)中表达最高。     

乙型肝炎病毒蛋白对纤维介素基因的激活作用

纤维介素基因（fgl2）在人和小鼠的重型肝炎的发病机制中发挥重要作用.为探讨乙型肝炎病毒（HBV）编码蛋白对人纤维介素基因（hfgl2）的激活作用, 构建了HBV编码蛋白C、 S和X的真核表达质粒pcDNA-HBc、pcDNA-HBs和pcDNA-HBx, 分别与hfgl2启动子荧光素酶报告基因质粒及β半乳糖苷酶基因质粒（βGal ）共转染到CHO细胞和HepG2 细胞, 采用免疫组织化学和免疫印记方法(Western blotting)鉴定病毒蛋白的表达.通过检测报告基因荧光素酶（LUC）及β半乳糖苷酶的表达活性, 反映病毒蛋白对hfgl2启动子的转录激活作用.结果显示, 转染了真核表达质粒的细胞均能瞬时表达相应的肝炎病毒蛋白, 在CHO细胞, 转染pcDNA-HB组和pcDNA-HBx组相对荧光素酶的活性是对照组的5.4和6倍, 在hepG2细胞, 转染pcDNA-HBc组和pcDNA-HBx组相对荧光素酶的活性是对照组的8.7和11倍.研究表明, CHO和HepG2细胞中表达的HBV C蛋白和X蛋白均具有激活hfgl2的功能, 而S蛋白则不能激活.进一步揭示了HBV病毒蛋白与宿主基因的相互作用机制.     

β- 萘黄酮能抑制荧光素酶活性

目的:研究β-萘黄酮对荧光素酶活性的影响。方法:利用人GCLC基因调控序列驱动的GCLC-PGL3-enhancer-Luciferase报道载体(PL45)转染人肺腺癌细胞A549,人肝癌细胞HepG2,人子宫颈癌细胞HeLa,人乳腺癌细胞MCF-7,人肝癌细胞Bel-7402,人支气管上皮细胞16HBE,β-萘黄酮刺激后,双荧光素酶报告基因检测系统分析其对GCLC基因表达的影响。wester blot检测β-NF刺激16HBE细胞后GCLC蛋白水平的变化。β-萘黄酮刺激转染了表达Luciferase的真核表达载体pRC/CMV2-luc+的A549和HepG2细胞后,双荧光素酶报告基因检测系统分析其对Luciferase基因表达的影响。PL45转染A549和HepG2细胞,裂解细胞后用β-NF刺激,双荧光素酶报告基因检测系统分析其对Luciferase基因的影响。结果:在各种细胞中,转染PL45报道载体后,β-NF处理组荧光素酶相对活性值与DMSO对照组相比均明显下降(P<0.01)。wester blot结果显示β-NF处理组GCLC蛋白的表达较DMSO对照组明显升高。在A549和HepG2细胞中,转染pRC/CMV2-luc+载体后,β-NF处理组荧光素酶相对活性值与DMSO对照组相比均明显下降(P<0.01)。PL45转染A549和HepG2细胞,裂解细胞后用β-NF刺激,β-NF处理组荧光素酶相对活性值与DMSO对照组相比均明显下降(P<0.01)。结论:β-萘黄酮直接抑制了荧光素酶的活性     

检测miRNA活性的双荧光素酶单载体

本研究报道了微小RNA靶分子鉴定及其活性分析的内参内置型双荧光素酶单载体与其应用.利用非连接酶依赖的基因克隆技术,借助一步式二元搭桥耦联长距离PCR及大肠杆菌体内同源重组方法,将萤火虫荧光素酶基因(Firefly luc)融合到pRL-TK载体的海肾荧光素酶基因(Renilla luc)和氨苄青霉素抗性基因之间,构建为两种荧光素酶基因表达框并置的单载体报告系统,命名为pMiSensor. 在海肾荧光素酶基因的3′非翻译区引入多克隆位点Xba I和Apa I,便于克隆目的基因的3′UTR.海肾荧光素酶为报告基因,萤火虫荧光素酶为内参基因.多种哺乳动物细胞系的转染实验证实,pMiSensor可同时有效表达两种报告基因,其酶活显示出宽广的线性范围.通过构建pMiSensor-CCNE1报告载体,证明pMiSensor能够重现miR16对细胞周期蛋白CCNE1的调控作用.通过转染miR16抑制剂,证明pMiSensor-CCNE1可作为一种灵敏的生物感应器,探测细胞内微小RNA的活性变化.该双荧光素酶单载体具有重复性高、操作简便、定量准确的优点,适用于微小RNA靶分子的筛选、鉴定和确认, 也适用于在细胞水平定量分析微小RNA的活性变化.     

用Rnase Ⅲ制备的小干涉RNA降解SARS冠状病毒基因的细胞内转录物

SARS冠状病毒是引起重症急性呼吸综合症的主要原因,目前尚没有特效药物或疫苗对抗这种新病毒。RNA干涉是指双链RNA可以特异地降解细胞内同源基因的Mrna。在哺乳动物细胞中,<30bp的小双链RNA能引起RNA干涉,又可以避免干扰素反应。通过体外转录得到SARS病毒3种基因RNA依赖的RNA聚合酶、刺突蛋白及核衣壳蛋白部分片段的长双链RNA,然后用Rnase Ⅲ有限切割成长度<30bp的小干涉RNA。同时把上述3种基因片段分别连接到质粒Pgl3-Control中,得到的3个质粒Pgl-R、Pgl-S和Pgl-N可以分别在细胞内转录出荧光素酶RNA依赖的RNA聚合酶、刺突蛋白、核衣壳蛋白的杂合Mrna。上述质粒分别和相应的小干涉RNA共转染HEK293F细胞,测定荧光素酶活性,结果小干涉RNA使相应质粒表达荧光素酶的活性显著下降;用逆转录定量PCR反应测量Mrna丰度,结果表明上述小干涉RNA可以特异地降解相应的病毒基因转录物。     

Nonviral gene transfer into primary cultures of human and porcine mesothelial cells

Due to their abundance and accessibility, mesothelial cells may be suitable tools for recombinant reagent expression by gene transfer. Genetically modified porcine mesothelial cells (PMCs) may have the potential for the treatment of vascular diseases in humans. We studied the effect of various transfection reagents on the primary culture of PMCs and human mesothelial cells (HMCs). The cells were transfected with a plasmid encoding a reporter gene (luciferase or green fluorescent protein [GFP]) under the control of the cytomegalovirus promoter. Transfection was achieved using cationic lipids (DOSPER and DOTAP) or calcium phosphate/deoxyribonucleic acid coprecipitation or Fugene 6. Results showed that Fugene 6 was the most efficient and reproducible transfection reagent with both PMCs and HMCs. With Fugene 6, luciferase activity in PMCs (1.5 x 10(8) relative light units [RLU]/10(6) cells) was at least 2.5-fold higher than with the other transfection reagents, and it was 100-fold higher than in HMCs. However, the proportion of transfected cells expressing GFP was only 1%. These preliminary findings open up new avenues for developing experimental studies on the use of genetically modified PMCs.     

Pitfall of an internal control plasmid: response of Renilla luciferase (pRL-TK) plasmid to dihydrotestosterone and dexamethasone

The thymidine kinase promoter-Renilla luciferase reporter plasmid (pRL-TK) is commonly used as a control for transfection efficiency in the Dual-Luciferase Reporter Assay System. While investigating hormone response elements in the promoters of the androgen-dependent, epididymis-specific EP2 gene, we found that hormone treatment affected the luciferase activity of pRL-TK-transfected cells. In African Green Monkey Kidney (CV-1) cells, cotransfected transiently with a hormone-responsive promoter-firefly luciferase reporter plasmid and with pRL-TK, Renilla luciferase activity increased in response to dihydrotestosterone (DHT) and decreased in response to dexamethasone (DEX). When a thromboxane synthase promoter Renilla luciferase plasmid (pRL-TS) was used in place of pRL-TK, Renilla luciferase activity remained constant in CV-1 cells treated with DHT but decreased in CV-1 cells treated with DEX. In transfection studies, internal control plasmid expression in response to treatment must be carefully monitored to ensure proper interpretation of normalized results.     

β-萘黄酮能抑制荧光素酶活性

目的：研究β-萘黄酮对荧光索酶活性的影响。方法：利用人GCLC基因调控序列驱动的GCLC．PGL3．enhancer-Luciferase报道载体（PL45）转染人肺腺癌细胞A549,人肝癌细胞HepG2,人子宫颈癌细胞HeLa,人乳腺癌细胞MCF-7,人肝癌细胞Bel-7402,人支气管上皮细胞16HBE,β-萘黄酮刺激后,双荧光素酶报告基因检测系统分析其对GCLC基因表达的影响。westerblot检测β-NF刺激16HBE细胞后GCLC蛋白水平的变化。β-萘黄酮刺激转染了表达Luciferase的真核表达载体pRC／CMV2．1uc＋的A549和HepG2细胞后,双荧光素酶报告基因检测系统分析其对Luciferase基因表达的影响。PIA5转染A549和HepG2细胞,裂解细胞后用p-NF刺激,双荧光素酶报告基因检测系统分析其对Luciferase基因的影响。结果：在各种细胞中,转染PL45报道载体后,β-NF处理组荧光素酶相对活性值与DMSO对照组相比均明显下降（p〈0．01）。westerblot结果显示β-NF处理组GCLC蛋白的表达较DMsO对照蛆明显升高。在A549和HepG2细胞中,转染pRC／CMV2．1uc＋载体后,β-NF处理组荧光素酶相对活性值与DMSO对照组相比均明显下降（P〈0．01）。PIA5转染A549和HepG2细胞,裂解细胞后用β-NF刺激,β-NF处理组荧光素酶相对活性值与DMSO对照组相比均明显下降（P〈0．01）。结论：β-萘黄酮直接抑制了荧光素酶的活性     

人p53启动子萤光素酶报告基因的构建及其活性测定

目的：克隆p53基因的启动子,插入萤光素酶报告基因载体,并检测启动子活性。方法：采用PCR技术从人肝癌细胞系HepG2基因组中扩增人p53启动子,插入萤光素酶报告基因载体pGL4．0-empty,将重组质粒转染293T、ZR75-1、HepG2、A549细胞,测定p53启动子的转录活性。结果：构建了p53启动子的萤光素酶报告基因;通过测序及质粒酶切鉴定,所构建的p53启动子正确;活性实验表明,报告基因在多种细胞中显示构建的p53启动子活性,并呈现一定的剂量效应;转录因子USF能以剂量效应方式提高p53报告基因的转录活性。结论：克隆了人p53启动子,为进一步研究调控p53的转录因子奠定了基础。     

Lipofection of insulin-producing RINm5F cells: methodological improvements

Cationic lipid/DNA-complexes have been widely used as gene transfer vectors because they are less toxic and immunogenic than viral vectors. The aim of the present study was to improve and characterize lipofection of an insulin-producing cell line. We compared the transfection efficiency of seven commercially available lipid formulations (Lipotaxi, SuperFect, Fugene, TransFast, Dosper, GenePORTER and LipofectAMINE) by flow cytometry analysis of GFP-expression. In addition, we have determined the influences of centrifugation, serum and a nuclear localization signal peptide on the lipofection efficiency. We observed that two lipid formulations, GenePORTER and LipofectAMINE, were able to promote efficient gene transfer in RINm5F cells. However, GenePORTER exhibited the important advantage of being able to transfect cells in the presence of serum and with less cytotoxicity than LipofectAMINE. LipofectAMINE-induced RINm5F cell death could partially be counteracted by TPA, forskolin or fumonisin beta(1). Finally, both centrifugation and a nuclear localization signal peptide increased transfection efficiency.     

阳离子脂质体转染人类骨骼肌原代细胞的初步研究

探讨不同脂质体介导基因转染人类骨骼肌原代细胞的转染效率和基因的表达.将含有β-半乳糖苷酶LacZ结构基因的质粒,用三种不同的阳离子脂质体导入人类骨骼肌原代细胞中,通过X-Gal染色观察不同的转染效率.结果发现,Fugene 6转染效率最高,蓝染细胞达10%,其脂质体与DNA的最佳比例为3∶ 2.Fugene 6可有效地将外源基因导入骨骼肌原代细胞,而且外源基因可以长效高效地表达,有望用来作为基因治疗的载体.