一个小麦丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶基因的克隆和分析

用mRNA差异显示技术在含有抗白粉病基因Pm21的小麦(Tri ticum aestivum L.) -簇毛麦(Haynaldia villosa) 6VS /6AL易位系92R137中分离与抗白粉病相关的基因,获得一个命名为TaPK1的全长cDNA克隆.序列分析表明,它与大豆(Glycine max (L.) Merr.)蛋白激酶基因GmPK6高度同源.经推测,TaPK1 编码416个氨基酸的多肽,属丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶家族,并具酪氨酸激酶特性.TaPK1是从小麦中分离的新基因.     

小麦TaEDR1基因dsRNAi表达载体的构建及遗传转化

从抗白粉病小麦(TriticumaestivumL.)品系99/2439中分离到一个编码促分裂原蛋白激酶激酶激酶的新基因TaEDR1。为了研究TaEDR1基因在小麦抗白粉菌(Blumeriagraminis(DC.)E.O.Speerf.sp.triticiEm.Marchal)反应中的作用,以单子叶植物高效表达载体pAHC25为基础载体,选择TaEDR1基因编码胞外结构域的、保守性低的cDNA区域作为RNA干扰的目标区段,将这个区段连接成一个反向重复序列(3′→5′//5′←3′),插入到玉米泛素高效启动子Ubi1的下游,构建成双链RNA干扰表达载体pAH-R-TER。利用花粉管通道技术,以高产小麦新品种“周麦18”为受体进行了遗传转化。T0代植株经PPT抗性鉴定、PCR扩增检测,获得了7个转基因植株,为研究小麦TaEDR1基因的功能奠定了基础。     

小麦耐盐种质的筛选鉴定和耐盐基因的标记

通过对 40 0份材料的芽期、苗期鉴定 ,筛选出 11份耐盐性较强的普通小麦 (TriticumaestivumL .)、小麦和黑麦 (SecalecerealeL .)、小麦和延安赖草 (Leymuschinensis (Trin .)Tzvel.)杂交后代材料 ,其中耐盐性突出的材料有 :普通小麦品种“红蚂蚱”、“科遗 2 6”、“希望”(Hope) ;小麦与黑麦杂交后代材料 98_46、98_113、98_131;小麦与延安赖草杂交后代材料 98_16 0、98_16 1、98_16 3。耐盐性表现最突出的材料是 98_113和 98_16 0。细胞学鉴定和原位杂交及醇溶蛋白酸性聚丙烯酰胺凝胶电泳 (A_PAGE)分析和低分子量谷蛋白SDS_PAGE分析 ,证明 98_113是稳定的小麦 黑麦二体附加系 ,但具体附加的是黑麦的哪条染色体还不清楚 ;98_131是小麦 黑麦 1B/ 1R易位系。结合其他 1B/ 1R材料的耐盐表现 ,提出了黑麦 1R染色体短臂上存在耐盐基因的可能性。对 (98_16 0×BanacakaMska)F2 代分离群体苗期抗盐鉴定分析 ,表明在这一杂交组合中的耐盐性状可能由一个主效基因控制。应用SSR标记技术 ,筛选到了与 98_16 0耐盐性状连锁的SSR标记WMS6 7和WMS2 13,它们与耐盐基因的遗传距离分别为 13.9cM (centMorgan)和 31.0cM。结合小麦SSR图谱分析 ,将该主效抗性基因定位在 5BL上。     

普通小麦中一个类受体激酶基因的克隆、鉴定和表达分析

为研究抗白粉病小麦（Triticum aestivum L．）品系在小麦白粉病菌（Blumeria graminis f. sp．tritici）侵染后有无LRK10同源基因表达,依据小麦蛋白激酶LRK10和其它植物蛋白激酶第6亚结构域设计了一个5’-RACE兼并性引物。以接种小麦白粉病菌后的小麦抗白粉病品系“99—2439”幼苗叶片cDNA为模板进行5’-RACE扩增,获得了一个1551bp长的蛋白激酶基因cDNA片段（S1125,GenBank登录号：AY584533）。此后,通过RACE技术成功地获得了该基因的全长cDNA克隆。该克隆编码637个氨基酸组成的多肽。同源性查寻表明,该基因属于先前命名为wfrk（wheat leaf rust kinase）的小麦类受体蛋白激酶基因家族。与LRK10相似,这个新的小麦类受体蛋白激酶有5个明显的功能域：位于氨基端的疏水信号序列、推测的胞外结构域、跨膜域、高荷电序列和位于羧基端的丝氨酸／苏氨酸激酶域,因此被命名为TaLRK（Triticum aestivum LRK）。以小麦肌动蛋白基因为对照,通过半定量反转录PCR（semi—QRT—PCR）技术对叶片中TaLRK基因在小麦白粉病菌接种后的转录水平表达谱进行了研究。结果表明,小麦白粉病菌的侵染使TaLRK基因的转录显著增强。组织特异性表达分析证明,这一基因仅在小麦的绿色部分表达。研究结果提示TaLRK可能参与了小麦的抗白粉病反应。     

利用小麦微卫星标记定位一个来自野生二粒小麦的抗白粉病基因

培育抗病品种是控制小麦白粉病危害最经济有效而又安全的手段.寻找和创造新抗源是抗病育种的基础工作,是解决抗源单一化问题的有效途径.来自以色列的野生二粒小麦G-305-M对北京地区小麦白粉菌流行小种15号表现免疫,用G-305-M与小麦品种781杂交并用京411回交(G-305-M/781//京411*3),成功地将G-305-M的抗白粉病基因转入普通小麦中.遗传分析表明转入小麦中的抗病性苗期表达受一对显性基因控制,该基因暂定名为MlG.用96对小麦微卫星引物对一个167株的抗性分离家系进行了SSR分析,发现引物WMS570扩增产物在抗感个体间存在多态性.经分离群体验证,抗病基因MlG与小麦染色体6AL上的微卫星位点Xgwm570连锁,遗传距离为14.9±3.0cM,据此将MlG定位于6AL.根据系谱和基因位点分析,推断MlG基因是不同于已知抗白粉病基因的一个新基因.     

用半定量RT-PCR方法分析小麦TaMlo-A1c基因的表达

以小麦稳定表达的肌动蛋白基因(Actin)作为对照,利用半定量反转录聚合酶链式反应(Semi-QRT-PCR)技术,对与抗白粉病有关的小麦(TriticumaestivumL.)TaMlo-A1c基因的表达进行了研究。结果发现:TaMlo-A1c基因在小麦的叶、茎、根中均表达,穗中不表达,在白粉菌(Blumeriagraminis(DC.)E.O.Speerf.sp.triticiEm.Marchal,Bgt)诱导不同时间后小麦叶片中的表达稍微有所增强。研究表明,用半定量RT-PCR技术研究小麦基因表达,具有特异性高、操作简便和可靠性强的优点。     

小麦主栽品种中的1RS分布和兰考90(6)系列白粉病新抗源

利用黑麦染色体臂1RS的特异性PCR标记,对黄淮麦区138个小麦主栽品种、系进行了PCR扩增,结果表明：有42．0%的小麦品种、系携带1RS染色体臂。以六倍体小黑麦Mzalenod Beer为黑麦染色体供体,培育的兰考90(6)系列小麦品系是新的小麦-黑麦1BL／1RS易位系。这些品系对小麦白粉病具有很高的抗性,是小麦抗白粉病育种的新抗源。对兰考90(6)系列品系白粉病抗性进行了研究,结果表明,兰考90(6)系列品系的抗谱与许多已经知道的小麦抗白粉病基因的抗谱不同,并具有数量抗性特点。     

人工合成小麦抗白粉病未知基因的SSR标记

YAV-2/TEZ//A.SQ(895)是硬粒小麦与粗山羊草杂交获得的抗白粉病人工合成小麦。本研究利用人工合成小麦YAV-2/TEZ//A.SQ(895)与感白粉病的普通小麦品系品资50098杂交和自交获得的F2代群体及F3家系,在温室条件下鉴定群体的白粉病抗性。遗传分析结果表明,该抗白粉病基因为显性单基因遗传。利用647对小麦SSR引物进行了白粉病抗性基因的分子标记分析,结果表明该白粉病抗性基因与2A染色体的6个SSR标记连锁,与标记Xcfa2086的遗传距离最近,为11.8cM。     

The wheat protein kinase gene,TaPK3/, of the PKABA1 subfamily is differentially regulated in greening wheat seedlings

We have identified a new wheat PKABA1/-like protein kinase gene, TaPK3/, that is expressed in greening wheat seedlings. TaPK3 has high sequence homology (97% similarity with some sequence diversity at the 3' end) to the wheat PKABA1 protein kinase mRNA, which is upregulated by cold-temperature treatment, dehydration and abscisic acid (ABA). Use of a TaPK3 gene-specific probe has revealed that TaPK3 is differentially expressed with respect to PKABA1. TaPK3 mRNA accumulates in greening shoot tissue of wheat, but is not affected by dehydration, cold-temperature treatment or ABA. Based on sequence and expression differences, we conclude that expression of the PKABA1/-like protein kinases is not limited to stress responses.     

小麦Beclin1类似基因的分子克隆与鉴定

以小麦 簇毛麦 (Triticumaestivum Haynal diavillosa) 6VS/6AL易位系 92R1 3 7为材料 ,应用mRNA差异显示和快速扩增cDNA末端 (rapidam plificationofcDNAends,RACE)技术对在白粉菌(Blumeriagraminis)诱导后表达增强的基因进行了克隆。分离到一个与拟南芥Beclin1类似基因同源的全长cDNA克隆 ,暂定名为小麦Beclin1类似基因。它编码 441个氨基酸组成的多肽。二级结构推导显示与人类Beclin相似 ,具有螺旋结构。Northern杂交分析表明 ,小麦Beclin1类似基因在白粉菌诱导后表达增强。Southern分析证明 ,小麦Beclin1类似基因为单拷贝基因     

小麦EDR1基因的克隆、鉴定和表达

为了研究普通小麦(Triticum aestivum L.)中是否有EDR1途径存在,根据拟南芥EDR1基因及其同源物设计了一对兼并性引物,用来分离小麦的EDR1同源物.以用小麦叶片RNA合成的cDNA为模板进行RT-PCR扩增,获得了代表小麦EDR1基因(命名为TaEDR1)的627 bp长的cDNA片段(GenBank登录号:AY743662).此后,通过RACE技术成功地获得了编码959个氨基酸的全长TaEDR1基因的cDNA序列.TaEDR1的氨基酸序列与大麦EDR1(标记为HvEDR1)有92%的相同.在TaEDR1的羧基末端有一个高度保守的丝氨酸/苏氨酸激酶催化功能域.因为存在一个推测的核定位基序,这个蛋白可能在细胞核中起作用.首次提供了证明普通小麦中存在EDR1同源物的分子生物学证据.用半定量RT-PCR方法研究了接种小麦白粉病菌[Blumeria graminis(DC.)E.O.Speer f.sp.tritici Em.Marchal,Bgt]后叶片中TaEDR1基因的转录谱.结果表明,在接种白粉病菌后TaEDR1基因在叶片中的转录水平提高.组织特异性表达谱分析证明,小麦TaEDR1基因在叶片、茎、穗、根中均有表达.研究提示TaEDR1可能在小麦防卫应答反应中起作用.     

小麦类Mla基因的分离与特征分析

根据大麦MLa基因的保守区域设计了4对家族性引物.通过用家族性引物对小麦(Triticum aestivum L.)抗白粉病品系TAM104R在接种和未接种两种条件下的基因差异表达进行RT-PCR分析,获得了一个在接种条件下特异表达的基因片段RJ-3-3L,并用RACE方法获得了其cDNA全长,命名为TaMla1.序列比对显示:TaMlal与大麦MLa位点的基因家族成员具有高度同源性,TaMla1编码的氨基酸功能基序扫描表明其为一个CC-NBS-LRR型抗病蛋白.用一套中国春缺-四体材料将TaMla1定位到了小麦的1A染色体上,这正是大麦MLa基因位点在小麦中的同源区段所在的染色体.这些结果表明,TaMla1为一个类MLa抗白粉病基因.同时我们还获得了一个在不接种条件下特异表达的基因片段RW-2-3L,序列分析表明它与MLa基因也高度同源,推测其可能是一个小麦白粉病的敏感基因或抗性负调控因子.