再力花地下部水浸提液对几种水生植物幼苗的化感作用

采用砂培法研究了不同浓度再力花地下部水浸提液对荇菜、苦草、水田芥、芦苇和黄菖蒲幼苗的生长、光合速率、根系活力、叶绿素含量以及抗氧化保护酶活性的影响,并采用气相色谱-质谱(GC-MS)联用技术对再力花地下部水浸提液的化学成分进行了分析。结果表明:再力花地下部水浸提液对荇菜、苦草、水田芥、芦苇和黄菖蒲5种水生植物幼苗生长有明显的影响,其中使用50mg干重/mL再力花水浸提液处理5种水生植物幼苗,对其生长指标有着极显著的抑制作用(P<0.01),苦草、水田芥和黄菖蒲的净光合速率分别降低69.0%、63.7%和73.5%,荇菜、苦草、水田芥和黄菖蒲幼苗根系活力分别降低67.3%、65.4%、52.2%和46.7%,5种水生植物幼苗叶绿素含量分别下降59.7%、71.2%、35.2%、50.0%和76.5%。当处理浓度为5mg/mL时,对5种水生植物幼苗体内过氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)活性有显著的促进作用;当浓度为50mg/mL时,对5种水生植物幼苗体内POD、SOD和CAT有显著的抑制作用,丙二醛(MDA)含量增加。分析显示,再力花地下部水浸提液中主要含有愈创木酚(78.93%)、邻苯二甲酸二丁基酯(7.13%)、邻苯二甲酸二乙氧基乙酯(1.48%)、香豆满(1.09%)、邻苯二甲酸二乙酯(0.98%)、松油醇(0.70%)、吲哚(0.65%)、二丁基羟基甲苯(0.64%),合计占到总量的91%以上。     

大孔吸附树脂分离纯化地黄中梓醇工艺的研究

利用大孔吸附树脂分离提取地黄中梓醇。以地黄粗提液中梓醇含量为指标,高效液相色谱(HPLC)为含量测定方法,考察九种不同极性大孔吸附树脂对梓醇的吸附和解吸附性能,筛选出最佳树脂D101进行分离实验。结果表明,D101大孔吸附树脂的静态吸附容量为69.2mg/g干树脂,其吸附等温线符合Langmuir和Freundlich吸附等温式。采用5%乙醇作为洗脱剂,洗脱液减压浓缩后进行硅胶柱层析分离,氯仿：甲醇（8：2）梯度洗脱得到梓醇单体,纯度达90%以上,梓醇得率为6%。     

阿魏菇醇提物抗肿瘤功效及三萜类成分的提取

为探究阿魏菇醇溶性物质(PFECs)抗肿瘤功效,优化阿魏菇醇提物三萜类化合物(PFTPs)提取条件,获取最大提取率。采用MTT法检测PFECs对5种肿瘤细胞生长抑制活性;对两种正常细胞无明显抑制作用;采用超声辅助、微波辅助热水浸提法、单因素试验与响应曲面法相结合,对阿魏菇三萜类化合物提取工艺优化。结果显示,PFECs具有显著的抗肿瘤活性;PFTPs提取的最佳工艺参数为:料液比1∶19(g/mL)、提取温度75℃、提取时间22 min(超声40 min后),提取率为4.42%。     

喜树果多糖的理化性质和抗氧化活性研究

本文采用热水浸提、微波辅助、超声波辅助提取喜树果多糖,使用傅里叶变换红外光谱(FTIR)、差示量热扫描仪(DSC)对多糖进行初步的理化性质和组成分析,通过体外试验评价其抗氧化能力。结果表明,微波辅助提取多糖(CAP-M)得率显著高于热水浸提(CAP-H)和超声波辅助提取多糖(CAP-U),为7.25%;初步的理化性质和组成分析显示三种多糖差异不显著,且均为含有少量蛋白的酸性多糖;在羟基自由基和DPPH自由基清除能力中CAP-H活性均高于CAP-M和CAP-U,IC_(50)值为0.775 mg/mL和0.648 mg/mL,总还原力也显著高于CAP-M和CAP-U;而在铁离子螯合能力中CAP-M表现最佳,IC_(50)值为1.745 mg/mL。     

高压热水浸提法提取金针菇中游离氨基酸的优化研究

研究了采用高压热水浸提法从金针菇中提取游离氨基酸的最适条件。通过单因素试验和正交试验,探讨了料液比、高压热水浸提时间及高压热水浸提温度对金针菇中游离氨基酸提取率的影响。试验结果表明,此法提取金针菇中游离氨基酸的最适条件为：料液比为1∶35（g/mL）、高压热水浸提温度为108℃、高压热水浸提时间为50min。在此条件下,金针菇中游离氨基酸的提取率为3.37%。     

几种牧草幼苗对冷蒿茎叶水浸提液化感作用的生理响应

采用沙培法对草木樨、披碱草、冰草和羊草进行幼苗生长试验,研究了不同浓度冷蒿茎叶水浸提液处理对4种牧草幼苗生长、根系活力、叶绿素含量以及抗氧化保护酶活性的影响,并采用气相色谱-质谱(GC-MS)联用技术对冷蒿茎叶水浸提液的化学成分进行了分析。结果表明:冷蒿茎叶水浸提液对草木樨、披碱草、冰草和羊草4种牧草幼苗生长有明显的影响,这种影响效应与牧草的种类及冷蒿茎叶水浸提液浓度显著相关。其中,25mgDw·mL-1的冷蒿茎叶水浸提液均表现出对4种牧草幼苗生长指标有极显著的抑制作用(P0.01),4种牧草幼苗根系活力分别降低了46.7%、65.9%、59.3%和66.7%,草木樨、披碱草和羊草幼苗叶绿素含量分别下降了47.3%、56.6%和46.7%。当冷蒿茎叶水浸提液浓度为10mgDw·mL-1时,对4种牧草幼苗体内超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)活性有显著的促进作用;当浓度为25mgDw·mL-1时,对4种牧草幼苗体内SOD、POD和CAT活性有显著的抑制作用,同时使幼苗体内丙二醛(MDA)的含量显著增加。冷蒿茎叶水浸提液有30种化感类次生代谢化合物,主要成分是樟脑(27.6%)、龙脑(10.1%)、蓍草苦素(9.8%)、桉树脑(8.7%)、喇叭烯醇(4.1%)和对-1-薄荷烯-4-醇(4.1%),占总量的60%以上。     

山药水浸提物对alpha- 葡萄糖苷酶抑制作用的初步研究

目的:通过研究山药水浸提物对α-葡萄糖苷酶的抑制作用,初步探索山药对2型糖尿病的预防和治疗作用。方法:对山药进行热水浸提,采用1:5的料液比,浸提温度90℃,时间2小时,超滤获得山药水浸提物,利用α-葡萄糖苷酶对淀粉降解反应建立酶活检测体系,通过检测酶反应产物分析山药水浸提物对α-葡萄糖苷酶的抑制作用,并计算IC50。结果:山药水浸提物对α-葡萄糖苷酶的抑制率大于46%,IC50值为1.9 g/ml。结论:山药水浸提物对α-葡萄糖苷酶的抑制作用提示山药可以作为肥胖或者2型糖尿病患者有效的一种药食同源食材,本实验结果为2型糖尿病高危人群及患者合理选择膳食结构提供新的科学依据。     

鸡眼草水浸提液对4种草坪草的化感作用

为探讨鸡眼草(Kummerowia striata)不同部位、不同浓度水浸提液对高羊茅(Festuca arundinacea)、黑麦草(Lolium perenne)、狗牙根(Cynodon dactylon)、白三叶(Trifolium repens)等4种草坪草的化感效应和作用规律,采用培养皿纸床法,以蒸馏水为对照,研究鸡眼草剪碎的植株、未剪碎的植株、叶、茎、根、地上部分0.012 5、0.025、0.05 g/mL 3个不同浓度的水浸提液对高羊茅、黑麦草、狗牙根、白三叶的种子发芽率、发芽速率、幼根长、幼苗高的化感作用。结果表明,鸡眼草水浸提液对高羊茅、黑麦草、狗牙根、白三叶4种受体植物种子的萌发及幼苗生长均有较强的化感抑制作用,且对种子发芽率作用强弱顺序为:狗牙根白三叶黑麦草高羊茅,对种子发芽速率作用强弱顺序为:黑麦草高羊茅狗牙根白三叶,对幼苗苗高作用强弱顺序为:黑麦草白三叶狗牙根高羊茅,对幼苗根长作用强弱顺序为:白三叶黑麦草狗牙根高羊茅。对4种受体植物的综合化感效应以高羊茅最弱,黑麦草、狗牙根、白三叶较为相近。4种受体植物所受到的抑制作用均随着水浸提液浓度的增加而增强,在同一浓度不同部位水浸提液处理下,叶、整株(剪碎)水浸提液对4种受体植物抑制作用比根、茎、整株(未剪碎)及地上部分水浸提液强。高羊茅、黑麦草、狗牙根3种草坪草受0.05 g/mL鸡眼草叶水浸提液的化感抑制作用最强,白三叶则受0.05 g/mL鸡眼草整株(剪碎)水浸提液的化感抑制作用最强。     

山药水浸提物对α-葡萄糖苷酶抑制作用的初步研究

目的:通过研究山药水浸提物对α-葡萄糖苷酶的抑制作用,初步探索山药对2型糖尿病的预防和治疗作用。方法:对山药进行热水浸提,采用1:5的料液比,浸提温度90℃,时间2小时,超滤获得山药水浸提物,利用α-葡萄糖苷酶对淀粉降解反应建立酶活检测体系,通过检测酶反应产物分析山药水浸提物对α-葡萄糖苷酶的抑制作用,并计算IC50。结果:山药水浸提物对α-葡萄糖苷酶的抑制率大于46%,IC50值为1.9 g/ml。结论:山药水浸提物对α-葡萄糖苷酶的抑制作用提示山药可以作为肥胖或者2型糖尿病患者有效的一种药食同源食材,本实验结果为2型糖尿病高危人群及患者合理选择膳食结构提供新的科学依据。     

稻曲病菌厚垣孢子中cAMP提取条件优选

探究稻曲病菌(Ustiloginoidea virens(Cooke.) Takahashi)黑色(休眠)与黄色(非休眠)厚垣孢子中的环磷酸腺苷(cAMP)最佳提取条件,为进一步的研究cAMP功能奠定基础.采用超声-水浴法对cAMP进行浸提,按3因素3水平正交设计,用高效液相色谱法检测cAMP含量;在设定V(甲醇)∶V(0.05 mol/L KH2PO4)=20∶80、流速为0.8 mL/min、检测波长为254 nm、进样量为20 μL的条件下,以黄绿色厚垣孢子为提取样品,其提取cAMP效果最佳组合条件:超声破碎时间10 min(功率400 W、间歇时间2 s),水浴温度80℃,物料比为1∶100,提取的cAMP为6.827 6 μg/mL.在此最佳条件下,测定出黄色厚垣孢子的cAMP为12.805 0±0.533 2μg/mL,黑色厚垣孢子的cAMP为4.171 7±0.097 1μg/mL.此结果表明,由黄色转换为黑色,其厚垣孢子的cAMP含量显著降低.     

Cyclic nucleotide activity in gastrointestinal tissues and fluids.

Published values of adenosine 3′,5′-monophosphate (cAMP) and guanosine 3′,5′-monophosphate (cGMP) in gastrointestinal tissues and fluids have varied depending upon extraction and purification methods and assay procedures. Cyclic nucleotide levels in a variety of gastrointestinal tissues and fluids from several animal species were measured by the Gilman protein kinase assay for cAMP, and by a radioimmunoassay for cAMP and cGMP. The neutral alumina/Dowex-1-formate column was the most accurate for the preparation of bile and gastric juice samples for the measurement of cAMP and cGMP, as verifled by the use of column blanks, spiked samples, phosphodiesterase treatment, and serial sample dilution. Tissue samples gave consistent results regardless of the various column procedures employed.     

A novel endoribonuclease from the marine sponge Tethya aurantium specific to 2',5'-phosphodiester bonds

In the marine sponge Tethya aurantium a novel endoribonuclease was found which specifically catalyzed the degradation of 2′,5′-phosphodiester linkages and was therefore named endo-2′,5′-ribonuclease. This enzymatic reaction yielded 2′,3′-cyclic phosphate and 5′-OH products similarly to the 3′–5′ bond cleavage in RNA, catalyzed by metal-independent ribonucleases. The partially purified enzyme preparation was used for its biochemical characterization. The enzyme did not require the presence of metal ions for its activity. The novel nuclease exhibited a preference for 5′-phosphorylated 2′,5′-oligoadenylates, but 2′–5′ linkage in 5′-triphosphorylated hetero-oligomers or homo-dimers comprising guanylate or uridylate residues instead of adenylate was cleaved as well. The enzyme was also able to catalyze the degradation of 5′-unphosphorylated 2′,5′-oligoadenylates, except for 2′,5′-diadenylate, which were weaker substrates for the enzyme than the respective 5′-triphosphorylated forms. The observed substrate specificity may refer to the specific role of the enzyme in the degradation of natural 2′,5′-oligoadenylates (2-5A) that function in the interferon-induced mammalian 2-5A system as allosteric regulators of ribonuclease L. They are produced by 2-5A synthetases (OAS) that are also present in sponges, the most ancient phylum of Metazoa. We suggest that the newly discovered endoribonuclease found in the marine sponge T. aurantium could be a representative of the group of 2′,5′-specific ribonucleases that primarily control the cellular levels of 2′,5′-oligoadenylates.     

2′-氟取代对T7 DNA连接酶连接效率的阻滞

为更好地理解连接酶的接合机制,研究了2′-氟取代核苷酸（2′-fluorinated nucleotide, FN）对T7 DNA连接酶接合特性的影响。利用分子信标的荧光信号变化来检测连接酶接合活性。结果显示,在连接酶作用的分子信标缺口处的5′端和3′端分别进行F取代时,对T7 DNA连接酶的接合效果分别阻滞（48.7±6.7）%和（70.6±4.0）%。在取代同时发生在5′端和3′端时,接合效果被阻滞（76.6±1.3）%。动力学参数的回归显示,FN取代会导致连接反应最大速率（Vmax）降低,同时导致米氏常数Km增大,说明酶和底物之间的亲和力在取代后减小。缺口两端的碱基错配也对酶接合反应效果产生一定的阻滞效应。本研究的结果和结论使对氟取代后,T7 DNA连接酶的接合特性有了更进一步的认识,为更好地应用T7 DNA连接酶接合活性提供有力的实用依据。     

Characterization of human phosphodiesterase 12 and identification of a novel 2'-5' oligoadenylate nuclease - The ectonucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterase 1

The vertebrate 2-5A system is part of the innate immune response and central to cellular antiviral activities. Upon activation by viral double-stranded RNA, 5′-triphosphorylated, 2′-5′-linked oligoadenylate polyribonucleotides (2-5As) are synthesized by one of several 2′-5′ oligoadenylate synthetases. The 2-5As bind and activate RNase L, an unspecific endoribonuclease, resulting in viral and cellular RNA decay. Given that most endogenous RNAs are degraded by RNase L, continued enzyme activity will eventually lead to cell growth arrest and cell death. This is averted, when 2-5As and their 5′-dephosphorylated forms, the so-called 2-5A core molecules, are cleaved and thus inactivated by 2′-5′-specific nuclease(s), e.g. phosphodiesterase 12, thereby turning RNase L into its latent form. In this study, we have characterized the human phosphodiesterase 12 in vitro focusing on its ability to degrade 2-5As and 2-5A core molecules. We have found that the enzyme activity is distributive and is influenced by temperature, pH and divalent cations. This allowed us to determine V_max and K_m kinetic parameters for the enzyme. We have also identified a novel 2′-5′-oligoadenylate nuclease; the human plasma membrane-bound ectonucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterase 1, suggesting that 2-5A catabolism may be a multienzyme-regulated process.     

外切核酸酶Ⅲ介导的DNA分子克隆

DNA克隆技术,作为最基本的现代分子生物学实验技术之一, 已经成为生物医学研究领域的重要研究手段。传统的分子克隆方法需要经过限制性内切酶酶切和DNA连接酶连接的步骤,是否存在合适的酶切位点和DNA连接酶的效率成为影响克隆的重要限制因素。本文描述了一种由外切核酸酶Ⅲ介导的,以3′-5′外切核酸酶活性和细菌细胞内DNA修复机制为理论基础的DNA分子克隆方法,称为不依赖连接酶的分子克隆（ligation-independent cloning, LIC）|证明了该方法的高效性和可靠性,并进一步对酶的用量、反应温度、反应时间、片段载体比例和量等多个参数进行了优化,建立了一种快速、简便和高效的DNA克隆方法。     

鼻咽癌细胞系CNE2中NPCEDRG基因mRNA剪接变异体的分析

NPCEDRG基因是采用基因定位候选克隆策略获得的1个鼻咽癌候选抑瘤基因. NPCEDRG在鼻咽癌细胞和组织中表达下调,重新恢复NPCEDRG基因在CNE2细胞系的表达,可部分逆转CNE2 的恶性表型. 本研究对CNE2细胞所表达的NPCEDRG基因mRNA剪接变异体克隆、鉴定,发现NPCEDRG基因至少有7个转录起始位点,其中NM_032316的TSS位于ATG上游-85 nt处,AF538150和AK094248的TSS位于-25 nt处;AF538150不存在第2外显子中6核苷酸序列（5′-TTGCAG-3′）的缺失,其CDs为516 bp,编码1种由171个氨基酸组成的蛋白质（而非GenBank中公布的CDs为510 bp,1种由169个氨基酸组成的蛋白质）. 本研究成功克隆得到1种新的NPCEDRG基因的mRNA剪接变异体V2,其TSS位于-23 nt处,其CDs为297 bp,编码1种由98个氨基酸组成的蛋白质.     

雌激素受体2（ESR2）mRNA 5′非翻译区内部核糖体进入位点活性的鉴定与分析

真核生物除了传统的帽依赖型翻译机制外,还存在内部核糖体进入位点（internal ribosome entry site, IRES）介导的翻译机制。雌激素受体2（estrogen receptor 2, ESR2）是雌激素受体家族成员之一,其编码的蛋白质在许多肿瘤中发挥重要的作用。ESR2蛋白的异常表达会导致众多肿瘤的发生,但其蛋白质翻译水平的调控机制至今仍不清楚。研究发现,在药物刺激的条件下,乳腺癌细胞MCF7/WT中ESR2蛋白的表达提高,但是其转录水平基本未见发生改变。猜测ESR2 mRNA 5′非翻译区（5′ untranslated region, 5′ UTR）具有IRES活性。为了验证ESR2 mRNA 5′ UTR是否具有IRES元件,将ESR2 mRNA 5′ UTR插入到双顺反子报告基因载体（pRF）中,构建pRL-ESR2-FL重组质粒载体,将其瞬时转染到HEK293细胞。结果发现,ESR2 mRNA 5′ UTR有假定的IRES活性。并且通过3个排除实验验证了ESR2 IRES活性与其5′ UTR中的内部潜在启动子（P<0.0001）、内部剪切位点以及核糖体通读无关。进一步对其序列进行截短研究发现,ESR2 IRES活性发挥的关键区域是3′端的439～468 nt,且ESR2 IRES最大活性的发挥依赖于5′ UTR序列的完整性。并且发现,ESR2 IRES活性的发挥不但需要特定的一级核酸序列,还要有稳定的二级茎环结构。此研究有望为ESR2蛋白调控的相关疾病提供新的药物治疗靶点。     

优雅蝈螽水溶性和类膜结合型海藻糖酶编码cDNA的鉴定及其在体内的表达

海藻糖酶是一种二糖水解酶,催化海藻糖转换为葡萄糖,为昆虫包括发育、壳多糖合成及飞翔代谢在内的多种生理过程所必需。尽管某些昆虫的海藻糖酶基因已被鉴定,但优雅蝈螽的海藻糖酶编码序列尚未见报告。本研究采用RACE结合多重PCR技术,分离鉴定优雅蝈螽的水溶性海藻糖酶（GgTre1）和类膜结合型海藻糖酶（GgTre2-like）的全长编码序列（cDNA）,包括携带不同长度3′-非翻译区（3′-UTR）的3个GgTre1 cDNA 亚型（GenBank：No.KY400001-KY400003）和3个GgTre2-like cDNA 亚型（GenBank：No.KY400004-KY400006）。 3个GgTre1 cDNA序列分别为2 107,2 021和1 914 bp,具有相同长度的5′-UTR（33 bp）,但3′-UTR 长度不同,分别为322,248和129 bp。GgTre1-2 cDNA含1 740 bp,编码579 个氨基酸残基组成的多肽链,分子量为67.29 kD;与之不同,根据cDNA演绎的GgTre1-1和GgTre1-3序列较GgTre1-2多4个氨基酸残基,多肽链的分子量为67.88 kD。3个GgTre2-like cDNA（GgTre2-like-1,-2和-3）序列全长分别为2 491,2 460 和2 381 bp。5′-UTR 均为284 bp,3′-UTR 分别为398,367和285 bp。GgTre2-like cDNA开阅读框为1 809 bp,编码602 氨基酸残基组成的多肽链,分子量为67.88 kD。实时定量PCR, 分析GgTre1和GgTre2-like基因在雌、雄个体（各20个）的组织特异性表达。结果显示,GgTre1 在卵巢和附腺表达量最高;GgTre2-like 主要在卵巢表达,在雄性肌肉和马氏管的表达量高于其他组织。上述结果表明,本研究从优雅蝈螽分离到3′-UTR长度不同的3个水溶性和3个类膜结合型海藻糖酶cDNA序列。结果还提示,GgTre1 在各组织的表达差异较大,而GgTre2-like 在各组织的表达相对稳定。不同长度3′-UTR的GgTre1 和 GgTre2-like 亚型的存在,以及不同长度的3′-UTR在翻译过程中的特殊作用,尚待今后研究证实。     

过表达Dbtnbt基因提高中国红豆杉细胞的紫杉醇含量

本文通过克隆3′-N-去苯甲酰紫杉醇N-苯甲酰转移酶（3′-N-debenzoyltaxol-N-benzoyltransferase,DBTNBT）基因Dbtnbt,构建其表达载体p1303-SDbtnbtN,转化中国红豆杉细胞,经潮霉素抗性筛选获得转基因细胞系. 转基因细胞分析结果表明,T-DNA及其包含的基因与宿主细胞染色体成功整合;转基因细胞中报告基因GusA-mgfp5正常表达;转基因细胞的Dbtnbt mRNA表达量是未转化细胞的1.33 倍;转基因细胞的紫杉醇产量约为27.3 μg/g,是未转化细胞的1.37倍. 本研究结果表明,过表达Dbtnbt基因将中国红豆杉细胞的紫杉醇产量提高约37%.     

芜菁类黄酮3′-羟化酶基因的功能鉴定及启动子初步分析

类黄酮3′-羟化酶（Flavonoid 3′-hydroxylase,F3′H）是细胞色素P450单加氧酶,在花青素合成途径中催化二氢山奈酚生成二氢槲皮素,进而形成矢车菊色素。利用津田芜菁BrF3′H1和赤丸芜菁BrF3′H2基因构建过量表达载体后遗传转化烟草,转基因植株的花色加深。通过染色体步移法克隆了BrF3′H1和BrF3′H2基因上游846和851 bp的启动子序列。生物信息学分析表明,BrF3′H1P和BrF3′H2P均包含TATA box、CAAT box、光调控元件、MRE、ABRE、ATGCAAAT-motif、ERE、O2-site、RY-element、LTR等多个顺式作用元件;二者的核苷酸序列在7个位点存在差异。利用BrF3′H1P和BrF3′H2P序列替换pCAMBIA1301植物表达载体的35S启动子后遗传转化烟草。GUS组织化学染色结果表明,BrF3′H1P和BrF3′H2P序列均能驱动GUS基因表达。通过PCR方法获得了BrF3′H1P和BrF3′H2P的一系列缺失片段,融合GUS基因后转化烟草。染色结果显示,BrF3′H1P和BrF3′H2P系列缺失片段均具有起始GUS基因表达的活性。BrF3′H1和BrF3′H2基因的功能鉴定及启动子的初步分析将为揭示津田芜菁和赤丸芜菁F3′H基因的光诱导表达调控机理奠定研究基础。