α-D-甘露糖残基在猪透明带中的分布及其在受精中的作用

为证明α-D-甘露糖残基在猪透明带中的分布及其在受精中的作用,用异硫氰酸荧光素络合小扁豆凝集素(fluorescein isothiocyanate-labelled Lens culinaris,FITC-LCA,一种D-甘露糖特异结合植物凝集素)标记去除卵丘细胞的体外成熟猪卵母细胞,用于观察LCA的标记情况及体外受精,并用甘露聚糖进行体外受精的竞争抑制实验及检测对精子顶体反应的影响.结果显示,LCA均匀标记于整个透明带且呈强荧光反应;LCA标记能够显著减少透明带表面精子结合数量并几乎完全阻断卵母细胞的受精能力;甘露聚糖能够显著降低透明带精子结合数量和卵母细胞的受精率;甘露聚糖在精子培养的不同时间段上都能明显增加顶体反应的精子数量.这些结果表明,猪透明带糖蛋白上的α-D-甘露糖残基是精子受体的重要组成部分,它能够诱导精子发生顶体反应,促进精子侵入透明带.     

重组猪卵透明带-3α抗原及其抗体的制备

目的:制备重组猪卵透明带-3α(rpZP3α)抗原及其抗体供发展避孕疫苗研究。方法:在2L发酵罐中接种毕赤酵母GS115-pZP3α工程菌,高密度发酵表达rpZP3α蛋白,表达的蛋白经螯合镍离子的亲和柱纯化后,用SDS-PAGE和Western blot进行鉴定,以Quantity One软件对rpZP3α进行定量分析。rpZP3α免疫家兔,间接免疫荧光法检测抗血清对rpZP3α和猪卵透明带的抗体反应。IVF试验体外检测抗rpZP3α抗体对猪、小鼠精卵结合的影响作用。结果:工程菌高密度发酵产物经分离纯化后获得能与抗pZP3抗体反应的46kD成分,平均产量为8mg/L,用其免疫家兔获得抗rpZP3α抗血清,间接免疫荧光法分析显示此抗血清能与猪卵透明带反应,产生亮绿荧光。体外精卵结合试验中,随着兔抗rpZP3α抗血清浓度的加大,其对猪、鼠精卵结合的抑制作用也增强。ELISA结果显示抗rpZP3α抗体与rpZP3α蛋白以及天然pZP3蛋白两种抗原反应的强度和趋势基本一致。结论:通过酵母体系制备的rpZP3α及其抗体具有免疫学活性。     

猪精子凝集素在精卵结合中的作用机制

猪精子凝集素（ＢＳＬ）位于精子头部,既与精子蛋白结合,亦与透明带糖蛋白ＺＰ３结合。并且ＢＳＬ自身分子间亦会聚合。与ＺＰ３结合的片段亦结合于岩藻素－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ亲和柱,但不与胎球蛋白－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ柱结合。该片段具有较强的抑制精卵结合的活性。ＢＳＬ经ＮＢＳ修饰后,血凝活力大大下降,同时推动与精子结合的活性,但不影响它与ＺＰ３的结合。修饰后的ＢＳＬ亦显著抑制精卵结合。表明ＢＳＬ以两个不同的部     

卵母细胞透明带异常及其对助孕结局影响的研究进展

人类透明带(zona pellucida,ZP)是在卵泡发生过程中由卵母细胞和颗粒细胞共同分泌的由ZP1-ZP4四种糖蛋白分子组成的高度有序结构,它与卵母细胞的成熟、受精、胚胎发育及妊娠结局等预后紧密关联。许多生殖中心实验室发现有些患者的卵出现全部或部分的透明带异常,而且不同实验室发现的透明带异常类型各异。研究发现这些透明带异常与卵母细胞受精、胚胎发育及临床结局有一定的相关性。本文综述了关于透明带异常及其对卵母细胞受精、胚胎发育潜能和临床结局的影响的研究进展。     

猪精子中与卵透明带糖蛋白ZP3结合的蛋白质

依次经ＰＳＬ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ亲和层析柱和纤维素ＣＭ－５２离子交换层析柱,从猪精子的ＣＨＡＰＳ抽提液分离得４个蛋白质组分。用固相透明带精蛋白结合试验（ＩＺＰＧＢＡ）检测;表明精子蛋白ＳＰ１和ＳＰ２具有结合透明带糖蛋白ＺＰ３的活性,ＳＰ２并显示凝集血球的活性。精子蛋白ＳＰ１与卵预温育明显抑制精卵结合,抑制活性与加入的精子蛋白的浓度呈正相关。用生物素标记的ＺＰ３和蛋白质印迹技术,证明ＳＰ１中的６８ｋＤ精子蛋白与ＺＰ３结合,提示６８ｋＤ精子蛋白参与精卵结合。     

透明带的精子受体在ZP3的O—糖链上

哺乳动物的受精过程主要包括几个步骤 ,精子与卵子相遇后 ,精子结合到卵透明带上 ,引起精子的顶体反应 ,随后精子穿透透明带与卵细胞融合受精。精卵结合具有种属特异性 ,这种特异性结合是由精子表面的特异蛋白和卵透明带糖蛋白通过受体配体模式进行的。但是 ,卵透明带上的什么物质与精子识别和结合呢 ?近 30年来 ,这一领域的研究很活跃 ,也取得了很大的进展。1 .小鼠透明带糖蛋白ＺＰ3作为精子受体透明带是卵细胞膜外的一层特殊的非细胞结构 ,是精子与卵细胞识别和结合的部位。小鼠和其它研究过的哺乳类的透明带都是由少数几种糖蛋白组成 ,…     

猪卵透明带ZP3α真核表达载体的构建及体外瞬时表达

目的：构建猪卵透明带zP3α真核表达栽体,为探讨卵透明带DNA疫苗避孕疫苗奠定基础。方法：采用PCR法获得了去除N端信号肽序列和C端跨膜区序列的猪卵透明带ZP3α的cDNA序列片段,以专门用于发展DNA疫苗的质粒pVAX1为载体构建了真核细胞表达质粒pvAX1-pZP3α。通过脂质体转染将之导入HeLa细胞进行体外瞬时表达,然后采用RT—PGR和间接免疫荧光技术(IIF)检测pZP3α在mRNA水平的转录和蛋白质水平上的表达。结果：真核细胞表达质粒pVAX1-pZP3α构建成功,用RT-PCR和IIF技术检测到了pZP3α在HeLa胞中的转录与表达。结论：真核表达载体pVAX1—pzP3aα的成功构建和表达为研制开发有效的人用卵透明带DNA避孕疫苗奠定了基础。     

哺乳动物透明带糖蛋白及其生物活性

透明带在哺乳动物的受精过程中发挥着重要作用,透明带化学成分及其生物活性的研究对于了解精卵识别、顶体反应的诱导等过程的分子机理具有重要意义．近10年来的研究表明透明带主要由糖蛋白（ZPGPs）组成,是在细胞质内合成后转移至透明带的.大多数动物的ZPGPs为4～5种,不同种类动物的ZPGPs的氨基酸序列存在高度同源性.在受精过程中,ZPGPs具有精子受体和诱导顶体反应的双重作用,ZPGPs含有N－连接和O－连接寡聚糖,这些寡糖链是ZPGPs行使生物活性不可缺少的部分．     

链霉菌来源D-甘露糖异构酶的性质及其在制备D-甘露糖中的应用

[背景]D-甘露糖具有多种功能活性,在食品、医药、饲料等行业应用广泛.D-甘露糖异构酶可以催化D-果糖与D-甘露糖之间的相互转化,在D-甘露糖的酶法制备中具有应用潜力.[目的]克隆一个链霉菌(Streptomyces sp.)来源的D-甘露糖异构酶基因(sssMIaseA)并在大肠杆菌中表达,研究其酶学性质,并用于制备...     

卵透明带ZP3的研究及其应用

卵透明带蛋白围绕在卵母细胞外,在受精过程中起着重要作用。ZP3蛋白是卵透明带蛋白家族中的重要成员,在功能上,ZP3作为初级精子受体,起始精卵结合和顶体反应。由于ZP3在受精中的重要作用,它成为免疫避孕的有效靶点。ZP3蛋白疫苗和DNA疫苗可以诱导机体产生较强的免疫反应,导致生育降低,同时带来一定程度的副作用。本文重点介绍了ZP3的免疫特性及其应用。     

重组猪卵透明带抗原pZP3α在毕赤酵母中的分泌表达

为制备rpZP3α蛋白供发展避孕疫苗研究,将编码天然提取pZP3α上的DNA序列(446~1423)插入至毕赤酵母分泌型表达载体pPICZαA上,重组质粒pPICZαA-pZP3α线性化后通过电穿孔转入毕赤酵母GS115,经抗生素Zeocin筛选获得工程菌。在2L发酵罐中,用甲醇诱导工程菌进行高密度发酵生产rpZP3α。分离浓缩发酵上清液,通过螯合铜离子的亲和柱纯化rpZP3α,用SDS-PAGE和Western blot进行鉴定,以Quantity One软件对rpZP3α进行定量分析并计算纯度和回收率。用rpZP3α免疫家兔,以ELISA法和间接免疫荧光法检测抗血清对rpZP3α和猪卵透明带的抗体反应。获得了分泌表达rpZP3α的工程菌,其高密度发酵产物经分离纯化后获得能与抗pZP3抗体反应的46kD成分,命名为rpZP3α,平均产量为8mg/L,纯度达92%,回收率为63%。用其免疫家兔获得抗rpZP3α抗血清,ELISA测定显示能与rpZP3α和天然提取pZP3反应。间接免疫荧光法分析显示抗rpZP3α抗血清能与猪卵透明带反应,产生亮绿荧光。用酵母表达系统成功表达了rpZP3α,该蛋白保留有天然pZP3的免疫活性。     

鼠卵透明带3在Pichia pastoris酵母中的分泌表达

本研究通过酵母Pichiapastoris表达鼠卵透明带 3(mZP3)蛋白 ,获得控制害鼠生育研究的抗原物质。根据国际基因库已发表的mZP3基因序列设计引物 ,并分别在 5’引物和 3’引物中引入EcoRI和XbaI酶切位点。经PCR扩增 ,将mZP3克隆至穿梭质粒pGAPZαA上 ,获得的重组穿梭质粒pGAPZαA mZP3经线性化后 ,采用LiCl法转入毕赤酵母SMD1 1 68菌株中 ,Zeocin+ 筛选阳性克隆 ,酵母发酵上清液进行SDS PAGE和Western blot检测 ,结果表明mZP3在酵母中得到了特异性表达 ,表达产物的分子量约为 60kDa ,说明mZP3能够在酵母真核系统中成功表达 ,并可以用作mZP3免疫不育控制鼠害的检测抗原。     

植物凝集素及其在抗病虫害分子育种中的应用

文章简要介绍植物凝集素的抗虫特点,并与其他类型的抗虫基因进行了比较;对目前研究较多、应用前景较好的植物凝集素的性质、抗虫性、转基因植物的抗虫性等研究进展作了阐述;并对植物凝集素在抗虫转基因工程中的应用现状和前景进行了讨论。     

内江猪染色体G带及其定量分析

采用外周血淋巴细胞培养技术和胰酶法对内江猪染色体进行了G显带,并运用扫描显微分光光度法对染色体G带进行了系统的定量分析,获得了染色体核型及G带带纹的精确数据。包括每条单倍染色体的着丝粒指数、长度、面积、积分光密度;每条G带深染带纹的宽度、面积、积分光密度、带峰值等,并绘出了带吸收光密度柱形图和消光三维图。     

用凝集素和非同位素标记底物测定核心α－1，6－岩藻糖转移酶及其应用

报道了一个不需同位素和ＨＰＬＣ的α－１,６－岩藻糖转移酶（α１,６ＦｕＴ,又称核心岩藻糖转移酶）的测定法,包括从正常人血浆提纯运铁蛋白,消化成带有天冬酰胺（Ａｓｎ）的二天线Ｎ－糖链,去除外端唾液酸和半乳糖后,用生物素酰胺乙酰基团标记其Ａｓｎ,并以此生物素衍生物标记的Ａｓｎ－七糖的Ｎ－糖链为受体底物,ＧＤＰ－Ｌ－岩藻糖为供体底物,用ＬＣＡ柱吸附法分离岩藻糖化后的产物,再用ＨＲｐ－Ａｖｉｄｉｎ交联物与柱上带有生物素的产物结合,此ＨＲＰ－Ａｖｉｄｉｎ－生物素。岩藻糖化产物从柱上洗脱后测定ＨＲＰ活力可代表α１,６ＦｕＴ活力。此法在较宽的范围内,产物量与酶量和反应时间成正比．人肝细胞癌、亚硝胺诱发大鼠肝癌后期或用佛波酯（ＰＭＡ）处理人肝癌细胞后,α１,６ＦｕＴ增高,而用视黄酸或ｄｂ－ｃＡＭＰ处理人肝癌细胞后,则该酶活力降低。     

猪IFNα基因在毕赤酵母中的高效分泌表达

巴斯德毕赤酵母载体质粒pPICZαA含有强启动子PAOX1和α-MF信号肽序列,构建猪IFNα基因的重组质粒pPICZαA-IFNα,并转入E.coli JM109中,得到转猪IFNα基因工程菌,经酶切鉴定克隆到载体pPICZαA上的外源基因即为猪IFNα基因。通过电击将经SacⅠ酶切后线性化的pPICZαA-IFNα质粒转化到巴斯德毕赤酵母KM71中。SDS-PAGE和Western blot鉴定表达产物的结果表明,分泌于胞外的猪IFNα蛋白分子量比猪IFNα理论值分子量稍大,估计是糖基化的原因。表达的蛋白可发生正确的抗原-抗体反应,表达量为 0.45 mg/mL。将蛋白表达上清经细胞毒性实验检测表达产物的抗病毒活性为2.1×104 IU/mL。Abstract: The porcine alpha interferon gene was inserted into the Pichia pastoris expression vector of pPICZαA which contains AOXⅠpromoter and α-factor signal sequence.The recombinant plasmid was transformed into host cell E.coli JM109 and then was extracted for analysis of restriction enzymes.It was confirmed that heterogeneous gene spliced into vector pPICZαA was IFNα gene. The recombinant plasmid of pPICZαA-IFNα was linearnized by SacⅠand transformed into KM71 by electroporation. SDS-PAGE and Western blot analysis showed that IFNα product was observed in the supernants with a little larger molecular weight size than the natural IFNα.The rIFN gene has the same antigenicity as natural one.The expressed rIFN accumulated up to about 0.45mg/mL.The cytokine activity of the supernants was vertified by WISH/VSV system,which is about 2.1×104IU/mL.     

犬卵透明带3 DNA疫苗在小鼠模型中的避孕效果评价

为了评价犬卵透明带3(CZP3)DNA疫苗的避孕效果,采用6只雌性小鼠Mus musculus肌肉注射50μg pcDNA3-CZP3质粒后30 V电压刺激6次的方法建立实验组,以6只同等注射pcDNA3质粒的雌性小鼠为阴性对照组;初免后每周采血并用ELISA方法检测小鼠的CZP3抗体水平及第6周抗体滴度;第6周与雄鼠合笼,计算产仔数;第24周收集卵巢制成HE染色切片进行观察;最后用小鼠血清进行小鼠及犬卵透明带的间接免疫荧光实验。结果显示,1)实验组小鼠从初免第2周就产生了抗CZP3的抗体,并且与阴性对照组之间的差异有统计学意义(P<0.05);第24周实验组的抗体水平与阴性对照组之间的差异有高度统计学意义(P<0.01)。2)第6周血清中的抗体1∶4 000倍稀释时,实验组与阴性对照组之间的差异有高度统计学意义(P<0.01)。3)小鼠生育率由阴性对照组的100%降低至实验组的50%,平均产仔数由阴性对照组的(6.667±0.422)只降至实验组的(2.500±1.455)只,且实验组的抗体水平与产仔数呈高度负相关。4)卵巢HE染色切片结果显示,CZP3 DNA疫苗...     

人卵透明带蛋白ZP3a和ZP3b肽段的免疫原性及其抗血清体外抑制人精子-半透明带结合

分析大肠杆菌表达的重组人卵透明带-3（r-huZP3）蛋白两个肽段（r-huZP3a^22-176及r-huZP3b^177-348）的免疫原性,比较两者抗血清体外抑制人精子-半透明带结合的能力。以制备性聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）纯化的大肠杆菌表达蛋白为抗原,主动免疫新西兰兔产生抗huZP3a^22-176及huZP3b^177-348抗血清：通过ELISA测定比较两者的抗体应答水平;以蛋白印迹和免疫组化方法测定两者抗血清同重组表达蛋白、大然人卵ZP以及卵巢组织的反应性;通过竞争性半透明带结合试验（hemizona assay,HZA）观察两者抗血清体外抑制人精子-ZP结合能力。结果显示：未与人分子蛋白载体耦联的r-huZP3a^22-176和r-huZP3b^177-348抗原都在免疫兔中产生了较高的抗体滴度,而且它们的抗血清可识别人肠杆菌表达的各自重组ZP3肽以及人卵细胞表面天然ZP,两者抗血清也都能在体外抑制人精子-ZP结合。由此可见,r-huZP3^22-176及r-huZP3b^177-348蛋白具有良好免疫原性,所产生抗血清也都显示出细胞和组织特异性。因此,单一或合并两个huZP3肽段均可作为抗原研制检测不明原因性不孕妇女中是否存在抗自身ZP抗体的诊断试剂盒,另外它们的抗血清也能用于鉴定已知huZP3表位肽段的最小B-细胞表位基序。     

重组猪α干扰素基因定点突变及在大肠杆菌中的表达

用巨引物PCR法介导的定点突变把猪α干扰素（PoIFNα）第86位Cys（TGC）突变为Tyr（TAC）,同时将其成熟蛋白N端第一个密码子TGT同义突变大肠杆菌偏爱的密码子TGC,构建了大肠杆菌融合基因表达载体pGEXIFN,表达产物占菌体总蛋白的20%。将以包涵体形式表达的目的蛋白经变、复性处理,并以FPLC进一步纯化,得到了具有较高生物活性的产物(5200IU/mg)。