传染性法氏囊病病毒五个抗原表位短肽的鉴定与序列分析

以5株传染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus,IBDV)单克隆抗体HNF1、HNF7、B34、2B1和2G8作为筛选分子,对噬菌体展示12肽库进行3轮"吸附-洗脱-扩增"淘洗,从每株单克隆抗体筛选到的噬菌斑中随机挑取12个单克隆蓝色噬菌斑,合计60个,用间接ELISA检测,A值大于1.00;用竞争抑制ELISA分析,单克隆抗体和IBDV抗原均能竞争抑制筛选12肽与固相包被单克隆抗体的反应,抑制率大于40%,表明在该12肽内含有IBDV抗原表位。选取35个单克隆噬菌斑,测定噬菌体gIII部分基因的核苷酸序列,确定了这5个含有不同IBDV抗原表位12肽的核苷酸和氨基酸序列。进一步将其与GenBank中IBDV基因组编码蛋白的氨基酸序列进行比较,发现2B1筛选肽有4个连续氨基酸残基Leu-Ala-Ser-Pro与IBDV基因组A片段编码多聚蛋白的第536-599氨基酸残基一致,推测2B1为线性表位;而HNF1、HNF7、B34和2G8筛选肽均没找到有3个以上连续氨基酸残基与IBDV蛋白序列相同之处,推测可能是构象依赖性表位。     

传染性法氏囊病病毒多表位模拟肽串联基因的表达与免疫原性分析

用5株传染性法氏囊病病毒(IBDV)单克隆抗体(mAb)从噬菌体随机肽库中得到了5个含有不同IBDV抗原表位的模拟肽序列。在此基础上,将5个抗原表位用GGGS四肽连接构建多表位基因5epis。将该基因合成、克隆后,构建原核表达质粒pET-5epis,在大肠杆菌中表达重组多表位蛋白r5EPIS,经SDS-PAGE分析,r5EPIS占菌体总蛋白的15%、分子量10kDa。用IBDV单克隆抗体和多克隆抗体对r5EPIS进行免疫印迹对比分析,结果表明,r5EPIS具有IBDV特异性和免疫反应性。将r5EPIS经皮下注射免疫兔,400μg/只/次,免疫2次,间隔7d,用IBDV间接ELISA检测血清抗体,第一次免疫7d后抗体效价为1∶4000,第二次免疫14d后抗体效价升高到1∶256000,说明r5EPIS可诱导机体产生IBDV特异性抗体。用r5EPIS加免疫佐剂经肌肉注射免疫鸡,50μg/只/次,免疫2次后,血清抗体效价可达到1∶12800,用200个ELD50IBDV超强毒株GX8/99攻击实验鸡,r5EPIS免疫组全部存活,而单用佐剂对照组的死亡率为86.7%(13/15),证明r5EPIS可诱导机体产生抗IBDV感染的保护性免疫应答,预示构建的5epis可作为IBD多表位疫苗研究的候选基因。     

传染性法氏囊病病毒VP3抗原表位的鉴定

利用肽扫描技术对4株IBDV VP3的单克隆抗体(HRB-3F、HRB-7B、HRB-7C和HRB-10E)的抗原表位进行了研究.通过Western blot和ELISA鉴定,将HRB-3F和HRB-7B的抗原表位定位于VP3 109～119 aa(位于IB-DV聚合蛋白的864～874 aa),HRB-7C和HRB-10E的抗原表位定位于VP3 177～190 aa(位于IBDV聚合蛋白的932～945 aa).进一步检测其反应原性及免疫原性,结果表明,这两个表位均能与抗IBDV阳性血清反应.将这两个表位短肽免疫BALB/c小鼠,其血清可以和IBDV反应,具有较好的免疫原性.与D6948、HK46和UK661等多株IBDV相应区域的同源性进行了比较,结果显示,这两个表位在多种毒株中同源性为100%.通过IBDV VP3抗原表位的研究,筛出两个新的保守线性表位并进行精确定位,对进一步分析IBDV结构与功能以及建立以表位为基础的抗原抗体诊断方法具有重要的意义.     

传染性法氏囊病病毒野毒株的致病性及其vp2基因比较

对4个IBDV野毒株的致病性和它们的vp2基因高变区序列同时做了比较分析.结果表明,4个IBDV毒株在致病性程度上存在较大差异.其中有一个是真正的超强毒,即GX8/99,其他几个虽然达不到真正超强毒的毒力,但也比经典的标准毒的致死性高得多.在vp2基因高变区,这4个IBDV野毒株与超强毒参考株HK46同源性很高,在DNA水平为96.8%～99.5%,在氨基酸(aa)水平为96.6%～100%.而与疫苗毒D78有很大差异,分别只有91.7%～93.6%和91.8%～93.2%.说明IBDV毒株的vp2基因高变区确实与其致病性有一定关系.特别是SD-1/97、SD-3/98、JS-30/99株之间及其与HK46在DNA和aa水平的同源性高达98.4%和98.6%以上,SD-3/99、JS-30/99株之间及其与HK46的氨基酸同源性为100%.然而,致病性特别高的GX8/99株病毒与其他3个野毒株及HK46在DNA和氨基酸水平的同源性相对较低,在DNA和aa水平的同源性只有96.8%～97.2%和96.6%～97.9%.相对于国内的流行毒株和香港超强毒参考株HK46,GX8/99株在致病性和VP2高变区都已发生了一定的变异.     

传染性法氏囊病病毒不同分离株vp2基因部分核酸序列分析

根据已报告的传染性法氏囊病病毒（Infectious bursd disease virus,IBDV)cDNA序列,设计引物,用RTPCR扩增CH（鸡）,DU（鸭）,GE（鹅）和SP（麻雀）四种不同源IBDV分离株的vp2基因高变区。核酸序列测定分析表明,四种不同源IBDV分离株vp2基因高变区的同源性为97％,推导编码蛋白氨基酸序列的同源性98％,两个亲水区和七肽区的氨基酸序列完全一致。本研究结果提示,自然感染IBDV的鸭,鹅和麻雀不仅可成为病毒携带者或传染源,而且在病毒变异中起一定作用。     

鸡传染性法氏囊病病毒研究进展

传染性法氏囊病(Infection bursal disease, IBD)是由鸡传染性法氏囊病毒(Infectious bursal disease virus, IBDV)引起的鸡和火鸡的一种高度接触性传染病,给世界各国的禽养殖业带来了巨大损失。自IBDV发现至今新的变异株不断出现,分子结构的改变导致病毒致病力的改变及宿主对疫苗应答的改变,使得传统的疫苗已不能控制其流行,因此各国学者对其基因组结构和功能进行了广泛深入的研究,并积极研制新型有效的疫苗以达到防治的目的。 1 基因组结构和功能 IBDV基因组由A(3.2kb)、B(2.8kb)两个双链RNA节段构成。A编码形成VP2蛋白(37-40k…     

鸡传染性法氏囊病上海超强毒株NH99的分离与鉴定

通过对上海近郊某鸡场数群10日龄左右的病鸡的临床症状、病理变化、病毒分离、纯化、动物回归、血清学检测及病毒核酸纯化、VP2基因序列的测定与分析,确认上海地区以发病日龄早,发病率、死亡率高为特征的鸡传染病为超强毒型鸡传染性法氏囊病,病原具有鸡传染性法氏囊病病毒超强毒 (vvIBDV)的分子特征,为vvIBDV.     

鸡传染性法氏囊病上海超强毒株NH99的分离与鉴定

通过对上海近郊某鸡场数群 10日龄左右的病鸡的临床症状、病理变化、病毒分离、纯化、动物回归、血清学检测及病毒核酸纯化、VP2基因序列的测定与分析 ,确认上海地区以发病日龄早 ,发病率、死亡率高为特征的鸡传染病为超强毒型鸡传染性法氏囊病 ,病原具有鸡传染性法氏囊病病毒超强毒 (vvIBDV)的分子特征 ,为vvIBDV。     

传染性法氏囊病病毒分子生物学研究进展

传染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disense virus,IBDV)是引起鸡的最严重的传染病之一,给养鸡业造成了巨大的经济损失,其危害除了直接引起临床症状外,更为重要的是破坏机体的免疫器官,主要是破坏B淋巴细胞前体,引起严重的免疫抑制,使鸡对其他病原的免疫力丧失,结果导致死亡。 IBDV最初被认为是呼肠孤病毒科的成员,主要是因为其在鸡胚肾细胞上培养出现     

传染性法氏囊病病毒中国强毒株A节段cDNA基因的克隆和序列分析

以来自哈尔滨传染性法氏囊病病毒（ＩＢＤＶ） 强毒株（Ｈａｒｂｉｎ 毒株,Ｈ） 的基因组ＲＮＡ为模板,用反转录聚合酶链反应（ＲＴ－ ＰＣＲ） 的方法得到了其Ａ 节段的全长ｃＤＮＡ 片段,分５＇端（１ ６５９ｂｐ） 和３＇端（１ ４４４ｂｐ） 上下两段分别克隆到ｐＧＥＭＢ○Ｒ － Ｔ 载体上,测定了其核苷酸顺序,在长为３ １０１ ｂｐ 中含有两个阅读框ＯＲＦＡ１ 和ＯＲＦＡ２ ,分别编码１ ０１２ 个氨基酸的前体蛋白（ＶＰ２ － ４ －３） 和１４５ 个氨基酸的ＶＰ５,ＯＲＦＡ１ 和ＯＲＦＡ２ 有部分的重叠。将核苷酸序列及推测出的氨基酸序列与已报道的ＩＢＤＶ 血清Ⅰ型和Ⅱ型毒株的相应序列进行了比较,结果表明：Ｈ 毒株与其它血清Ⅰ型毒株之间,在核苷酸水平上存在２５ｂｐ － ２６７ｂｐ 的差异;在氨基酸水平上存在１７ ～４０ 个氨基酸的差异。在ＶＰ２ － ４ － ３ 内比较显示,Ｈ 毒株与Ｐ２ 、Ｃｕ－ １ 之间氨基酸的差异最小为１ ．７％ ,Ｈ 毒株与ＵＫ６６１ 之间氨基酸的差异最大为３ ．９ ％ 。变异主要发生在ＶＰ２ 的可变区（２０６ － ３５０ 位氨基酸） ,在Ｈ 毒株所特有的１２ 个氨基酸当中,该区就占５ 个,代表１ ．７６ ％ 的变异。ＶＰ４、ＶＰ３ 和ＶＰ５区各有     

传染性法氏囊病不同代次细胞毒免疫效果的研究

将从山东省东营分离到的1株传染性法氏囊病病毒(IBDV)野毒(暂命名 IBDV SDDY株,经鉴定该株与 IB DV STC株具有较高的同源性)经 SPF 鸡胚传代,然后转为细胞培养,取第 20 代、21 代、25 代毒,以 1 倍剂量(3000TCID50/0.2mL )和5倍剂量不同的免疫剂量,分别在7日龄、14日龄对商品代海蓝褐蛋鸡进行免疫,并于免疫前用 IBD ELISA试剂盒检测 IBDV母源抗体水平,于 35 日龄用传染性法氏囊病病毒超强毒 (very virulent In fectious Bursal Disease Virus, vvIBDV )GX 8/99攻毒,在攻毒前再次检测IBDV的抗体水平,攻毒后观察记录各分组鸡的致病率和死亡率,并计算免疫器官体重指数,观察免疫器官的组织损伤情况。试验结果表明:3 代毒都具有较高免疫原性,但是20代毒仍具有较大的毒性,7 日龄接种会引起法氏囊的萎缩,造成持续的组织损伤;21 代毒、25代毒保护率高,无免疫抑制,是比较理想的疫苗来源;7日龄免疫较14日龄免疫更易造成组织损伤和免疫抑制,14日龄免疫较为合适。     

传染性法氏囊病超强毒山东分离株SD0210的致弱研究

本研究将鸡传染性法氏囊病超强毒(vvIBDV)SD0210株经SPF鸡胚培育及鸡胚成纤维细胞(CEF)传代培养,获得了对CEF适应的细胞毒,并对细胞毒进行了致病性、回归动物的稳定性试验及免疫原性方面的试验,结果表明已成功获得了具有高免疫原性且安全无毒力返强的致弱株,并初步揭示了vvIBDV在适应细胞、从超强毒力向弱毒力转化过程中,VP2高变区氨基酸序列的变化情况.SD0210株培养至18代开始适应细胞,出现细胞病变.21代细胞毒已对SPF鸡失去了致病性,在鸡体内连续传代15代毒力不返强,而且具有较高的免疫原性.     

IBDVvp2基因高变区序列测定与进化分析

本实验采用来源于江苏地区的六株不同鸡传染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus,IBDV)毒株,应用RT-PCR法对vp2基因高变区进行了扩增,构建重组质粒pMD18T-vp2,测序.与有代表性的IBDV毒株VP2基因高变区序列进行比较分析,以ClustalX软件进行序列比对,得到基因序列及氨基酸序列同源性,IBDVY3、P2G、P8G、SZ、Y5和W04(6株)IBDV与D6984(荷兰)的同源性达到99.0%以上,与其它一些超强毒株(very virulentIBDV,vvIBDV)的同源性也达到了97.8%以上,并在关键氨基酸位点符合vvIBDV特征,采用Phylip3.5软件分析作出进化树,其结果从分子水平说明六个毒株均为vvIBDV,与欧洲和日本的超强毒株有较近的亲缘关系,而与美洲株的较远,从而为IBDV分子流行病学研究和疫苗的研制提供了科学依据.     

鸡传染性法氏囊病病毒超强毒株GX8/99株的致病性

鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)超强毒株GX8/99,系1999年从广西一自然发病鸡群采集到.用原始病鸡法氏囊悬液连续3次人工感染SPF鸡后,再取其法氏囊制备悬液,分装,在-70℃保存.以此悬液经卵黄囊接种10日龄SPF鸡胚,测定鸡胚的半数致死量(ELD50).随着鸡的日龄和接种剂量的不同,其致死率有很大差异.对28～30日龄SPF鸡,病毒接种量为200个ELD50时,感染后7日内死亡率最高可达73%～90.5%(11/15和19/21);感染量为20个ELD50时,死亡率亦可达53%～92%(8/15和23/25).以500个ELD50感染28～104日龄的SPF鸡,死亡率均在55.1%～67.2%;甚至113～120日龄的SPF鸡,感染后仍有10%～15%致死率.但128日龄的SPF鸡感染后既不引起死亡也不表现任何症状,但抗体全部转阳.人工接种发病死亡的鸡,其法氏囊的出血程度也随感染量和年龄而异.50日龄鸡接种2000个ELD50后,死亡的鸡100%(12/12)法氏囊严重出血;而40日龄鸡感染200个ELD50后,死亡鸡中仅17%(3/18)发生出血.在2、3、4周龄带有母源抗体的商品代蛋鸡,以2000个ELD50病毒接种后,只引起10%(2/20)、35%(7/20)和35%(7/20)的死亡率.但在5周龄商品代蛋鸡,仅接触感染的致死率可达61.3%(98/160).另一批商品代蛋鸡,在4周龄和5周龄人工接种200个ELD50病毒后,死亡率分别是81.6%～94.3%(62/76～33/35)和93.9%～94%(31/33～47/50).通过总共1200多羽鸡的试验表明,GX-8/99株是一个超强毒IBDV毒株,表现为高死亡率(最高可达94%),易感年龄延长至4月龄,中枢性免疫器官法氏囊出血严重和胸腺明显萎缩.     

IBDVvp2基因高变区序列测定与进化分析

本实验采用来源于江苏地区的六株不同鸡传染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus,IBDV)毒株,应用RT-PCR法对vp2基因高变区进行了扩增,构建重组质粒pMD18T-vp2,测序。与有代表性的IBDV毒株VP2基因高变区序列进行比较分析,以ClustalX软件进行序列比对,得到基因序列及氨基酸序列同源性,IBDV Y3、P2G、P8G、SZ、Y5和W04(6株)IBDV与D6984(荷兰)的同源性达到99．0％以上,与其它一些超强毒株(very virulent IBDV,vvIBDV)的同源性也达到了97．8％以上,并在关键氨基酸位点符合vvIBDV特征,采用Phylip3．5软件分析作出进化树,其结果从分子水平说明六个毒株均为vvIBDV,与欧洲和日本的超强毒株有较近的亲缘关系,而与美洲株的较远,从而为IBDV分子流行病学研究和疫苗的研制提供了科学依据。     

传染性法氏囊病病毒弱毒株对Vero细胞的适应性研究

传染性法氏囊病病毒疫苗的传统生产工艺是利用鸡胚纤维细胞增殖ＩＢＤＶ,但易被外源病原污染,且生产成本很高,借鉴国内外流行性乙型脑炎疫苗生产的经验,使用Ｖｅｒｏ细胞增殖ＩＢＤＶ弱毒株,从病毒高峰出现时间、滴度峰值的高低、对细胞代谢的影响等方面研究了ＩＢＤＶ对Ｖｅｒｏ细胞的适应性,敏感性以及适应后的种毒的长期保存过程中发现病毒滴度有下降趋势,试用了不同试剂对病毒进行保护。