Construction of shRNA of fulminant hepatitis related gene <Emphasis Type="Italic">mfgl2</Emphasis> and investigation of its biological effects <Emphasis Type="Italic">in vitro</Emphasis>

This study was designed to explore the RNA interference technique in inhibition of the expression of the mouse fibrinogen like protein 2 (mfgl2), which has been reported to be involved in the development a variety of diseases including fulminant viral hepatitis. A plasmid named p-mfgl2shRNA, complementary to the sequence of mfgl2 was constructed, while another short hairpin RNA (shRNA) which was a mutated form of the mfgl2shRNA sequences was used as a control. A plasmid named pEGFP-mfgl2 expressing the mfgl2-EGFP fusion protein was also constructed for the screening of the effect of p-mfgl2shRNA on mfgl2 expression. By cotransfection of p-mfgl2shRNA and pEGFP-mfgl2 or pcDNA3.1-mfgl2 expression construct into CHO cells or HeLa cells, the inhibition of mfgl2 expression by mfgl2shRNA was analyzed by direct observation through fluorescent microscopy, FACS, RT-PCR and immunohistochemistry staining. The experiments showed the significant inhibitory effect of p-mfgl2shRNA on mfgl2 expression at 48h post-transfection in both CHO and Hela cell lines with the inhibitory efficiency as high as 80.1%. The study demonstrated that the construct of p-mfgl2shRNA successfully interfered with the mfgl2 expression in vitro. These authors contributed equally.     

Construction of mTNFR1shRNA Plasmid and its Biological Effects on MHV-3 Induced Fulminant Hepatitis in BALB/cJ Mice

Previous study on TNFR1-mediated hepatocyte apoptosis has been implicated in the development of fulminant viral hepatitis.To interfere with the potentially effective target,plasmid named p-mTNFR1shRNA complimentary to the sequence responsible for mTNFR1 was also constructed and further confirmed by sequence analysis.To investigate the effect of mTNFR1shRNA plasmid on mTNFR1 expression in vivo and the disease progress in MHV-3 induced fulminant hepatitis mice model.By hydrodynamic injection of mTNFR1shRNA pl...     

Construction of mTNFR1shRNA plasmid and its biological effects on MHV-3 induced fulminant hepatitis in BALB/cJ mice

Previous study on TNFR1-mediated hepatocyte apoptosis has been implicated in the development of fulminant viral hepatitis. To interfere with the potentially effective target, plasmid named p-mTNFR1shRNA complimentary to the sequence responsible for mTNFR1 was also constructed and further confirmed by sequence analysis. To investigate the effect of mTNFR1shRNA plasmid on mTNFR1 expression in vivo and the disease progress in MHV-3 induced fulminant hepatitis mice model. By hydrodynamic injection of mTNFR1shRNA plasmid, the survival rate of mice, hepatic pathological change were examined and compared between mice with/without mTNFR1shRNA plasmid intervention. The expression of mTNFR1 was detected by Real-time PCR, immunohistochemistry staining. The mTNFR1shRNA plasmid significantly reduced mTNFR1 expression in vivo, markedly ameliorates inflammatory infiltration, prolonged the survival time period and elevated the survival rate from 0 up to 13.3% in Balb/cJ mice with MHV-3 induced fulminant hepatitis. This study was designed to explore the opportunity of RNA interference technique in inhibiting TNFR1 expression, which has been reported to be involved in the development of a variety of diseases including fulminant viral hepatitis and severe chronic hepatitis B.     

小鼠Dppa2基因shRNA载体的构建及干扰效果的检测

目的:构建有效的针对小鼠Dppa2基因的shRNA(short hairpin RNA)干扰载体。方法:设计合成2对针对小鼠Dppa2基因的shRNA序列以及1对与哺乳动物基因组无同源性的shRNA序列作为对照,构建pSUPER.Retro.puro干扰载体并进行PCR,酶切和测序验证。进一步将各干扰载体分别转染小鼠胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESCs),RT-PCR检测干扰效率。结果:PCR,酶切和测序验证均表明各shRNA载体构建成功。将空载体及各重组载体分别转染小鼠ESCs发现,干扰组Dppa2基因表达水平相对于空载体对照组和阴性shRNA载体对照组明显下调。结论:成功构建了有效的针对小鼠Dppa2基因的shRNA干扰载体,为进一步研究Dppa2基因在维持小鼠ESCs不分化过程中的作用提供了基础。     

抑制Dicer基因对shRNA功能发挥的影响

本文将Dicer基因的RNA酶III结构域作为靶区,设计并构建了两个抗Dicer基因的小发夹样RNA(shRNA)表达载体,将其转染2215、结肠癌TC细胞和基因组中整合有绿色荧光蛋白基因(GFP)的HepG2A9细胞,通过RT-PCR评价RNA干扰抑制Dicer基因表达的效率;当HepG2A9细胞Dicer基因表达被上述RNA干扰抑制时,再转染抗GFP的shRNA表达载体,通过RT-PCR和荧光显微镜观察GFP表达水平。结果显示,在不同细胞系中,这两个抗Dicer基因shRNA表达载体,均能明显抑制Dicer基因的表达;当Dicer基因受抑时,后续转染抗GFP的shRNA表达载体不能有效抑制GFP的表达。结果表明,抗Dicer基因shRNA表达载体,能够明显抑制Dicer基因的表达;shRNA表达载体的功能发挥需要Dicer酶的直接参与。     

靶向增殖细胞核抗原shRNA的构建及其对HepG2细胞增殖与凋亡的影响

为了探讨抑制增殖细胞核抗原(PCNA)基因表达对人肝癌HepG2细胞增殖及凋亡的影响,将前期筛选出的最佳siRNA序列转化为能表达其小发夹结构RNA(smallhairpinRNAs,shRNA)的DNA序列,并与pSilencer2.0-U6质粒定向连接,构建靶向PCNA基因的siRNA真核表达载体pShPCNA,经DNA测序证实与设计完全一致.随后采用WST法及克隆形成抑制观察细胞增殖抑制情况、划痕实验来观察细胞迁移能力,流式细胞术、Hoechest33258染色、细胞线粒体膜电位改变检测细胞凋亡.在转染HepG2细胞48h后,pShPCNA组细胞PCNAmRNA表达明显下调,并出现明显的增殖抑制作用,明显抑制细胞克隆的形成和细胞的迁移力,且呈剂量-效应关系.流式细胞术检测发现:pShPCNA组细胞明显阻滞于G0/G1期,并出现明显的亚二倍体凋亡峰,出现明显的早期凋亡细胞群.荧光显微镜检测表明,细胞线粒体膜电位降低,并且细胞出现核固缩、凋亡小体等凋亡形态学变化.上述结果表明,成功构建了靶向PCNA基因的siRNA真核表达载体pShPCNA,pShPCNA转染HepG2细胞48h后,能够显著抑制细胞的生长增...     

neuronatin shRNA真核表达载体的构建及其生物学功能

目的:获得能持续干扰neuronatin（nnat）基因表达的细胞,观察nnat基因沉默对神经细胞发育与分化的影响,为研究基因功能奠定基础。方法:构建含nnat基因短发夹RNA(shRNA)表达质粒,将质粒转染大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞PC12,RT-PCR方法筛选出最有效干扰质粒,稳定转染PC12细胞后观察细胞表型变化,免疫荧光检测nnat蛋白表达,NGF诱导观察nnat表达下调对细胞分化的影响。结果:成功构建并筛选出有效的靶向nnat基因的shRNA真核表达载体;载体稳定转染PC12细胞之后能特异性沉默nnat基因的表达,PC12细胞长出突起,向神经元方向分化,加入诱导因子NGF后能促进突起生长。结论:nnat可能是作为神经分化抑制因子在神经发育与成熟过程中发挥作用。     

RNA干扰抑制乙型肝炎病毒复制及基因表达研究进展

RNA干扰(RNAinterference,RNAi)是指由21～23个核苷酸组成的双链RNA(dsRNA)所引发的生物细胞内同源基因转录后沉默的现象,是生物体在进化过程中普遍存在的一种基因调控机制。目前对由乙型肝炎病毒(HBV)引起的病毒性肝炎尚无令人满意的治疗效果,而RNA干扰技术的出现为各类慢性HBV感染的治疗开辟了新的途径。本文对RNA干扰抑制HBV复制及基因表达的研究现状、存在问题及应用前景进行了综述。     

RNA干扰抑制人乙型肝炎病毒复制的研究

采用表达shRNA的载体构建了表达针对病毒HBsAgmRNA保守区的shRNA的质粒psiHBs,利用细胞模型和高压注射小鼠模型评价RNA干扰对HBV复制和基因表达的抑制作用。通过Western印迹检测细胞内的HBsAg,用ELISA检测细胞培养上清和血清中的HBsAg,采用Southern印迹检测HBV的复制中间体,最后通过免疫组化的方法检测肝组织切片中HBcAg的表达情况。结果显示pHBV1.3和psiHBs共转染HepG2后,与对照组相比病毒HBsAg和HBeAg的表达和病毒复制中间体的水平下降了90%以上,并且shRNA的作用效率存在序列特异性和剂量依赖性。在高压注射小鼠模型中,psiHBs表达的shRNA使小鼠血清中HBsAg的水平下降了80%以上,免疫组化检测显示,小鼠肝组织内HBcAg阳性细胞数减少了75.1%,而且shRNA的抑制作用至少能持续4d。研究显示载体表达的shRNA无论是在细胞或是在小鼠模型中都能对HBV的复制和基因的表达发挥序列特异性的抑制作用。本研究为我们下一步实现由RNAi介导的基因治疗提供了理论和技术支持。     

大鼠Pael -R基因shRNA干扰载体的构建及功能筛选鉴定

目的:构建并筛选针对大鼠Pael -R基因的有效shRNA干扰载体并鉴定其干扰效果.方法:构建三个针对大鼠Pael-R基因的shRNA表达载体,利用脂质体转染大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞PC12,以G418筛选抗性细胞克隆并利用RT-PCR和Western Blotting鉴定Pael -R基因的表达.结果:在构建的3个干扰载体中,转染pRNA-U6/PaelR -3的细胞克隆中Pael -R表达在mRNA水平为29％,与对照组相比下降了45.3％,在蛋白质水平为32％,下降了27.3％ (P＜0.05).结论:构建了Pael -R基因的有效干扰载体pRNA-U6/PaelR -3,并得到了Pael -R基因表达下调型PC12细胞克隆,为研究Pael -R基因表达下调在帕金森病的发病机制及其治疗中的作用奠定了基础.     

DPC4／Smad4基因RNA干扰靶点设计和慢病毒载体制备

目的：DPC4／Smad4基因RNA干扰靶点的设计和RNA干扰靶点慢病毒载体制备。方法：针对DPC4／Smad4基因序列,并利用网站设计程序,依据RNA干扰序列设计的原则,设计多个RNA干扰靶点序列。根据设计经验和设计软件将其进行评估测定,选择最佳动力学参数靶点进入其后续的实验流程;生工生物合成含干扰序列的DNAoligo,具有严格的检测体系（PAGE纯化体系）,其两端含酶切位点粘端,直接连入酶切后的RNA干扰载体上。将连接好的产物转入制备好的细菌感受态细胞,并且对长出的克隆进行酶切鉴定。然后挑选出阳性克隆测序,进行测序比对后,鉴定阳性的克隆即为构建成功的目的基因RNA干扰慢病毒载体。将构建的慢病毒载体以及辅助包装载体质粒共转染到293T细胞。收获含有病毒的细胞培养上清,浓缩后进行滴度测定,并检测其感染性。另外应用荧光实时定量PCR检测在感染的293T细胞中敲减效果。结果：成功构建DPC4／Smad4shRNA的慢病毒载体LVshSmad4,并成功制备DPC4／Smad4shRNA慢病毒,三株病毒感染细胞后均具有有效的敲减效应,其中SHl最为显著。结论：DPC4／Smad4基因RNA干扰靶点的成功设计和RNA干扰靶点慢病毒制备,为以后探讨DPC4／Smad4基因与肿瘤的相关性治疗提供了实验基础。     

DPC4/Smad4基因RNA干扰靶点设计和慢病毒载体制备*

摘要目的：DPC4/Smad4 基因RNA干扰靶点的设计和RNA 干扰靶点慢病毒载体制备。方法：针对DPC4/Smad4基因序列,并利 用网站设计程序,依据RNA干扰序列设计的原则,设计多个RNA干扰靶点序列。根据设计经验和设计软件将其进行评估测定, 选择最佳动力学参数靶点进入其后续的实验流程;生工生物合成含干扰序列的DNA oligo,具有严格的检测体系（PAGE 纯化体 系）,其两端含酶切位点粘端,直接连入酶切后的RNA干扰载体上。将连接好的产物转入制备好的细菌感受态细胞,并且对长出 的克隆进行酶切鉴定。然后挑选出阳性克隆测序,进行测序比对后,鉴定阳性的克隆即为构建成功的目的基因RNA 干扰慢病毒 载体。将构建的慢病毒载体以及辅助包装载体质粒共转染到293T 细胞。收获含有病毒的细胞培养上清,浓缩后进行滴度测定,并 检测其感染性。另外应用荧光实时定量PCR 检测在感染的293T细胞中敲减效果。结果：成功构建DPC4/Smad4 shRNA的慢病毒 载体LVshSmad4,并成功制备DPC4/Smad4 shRNA慢病毒,三株病毒感染细胞后均具有有效的敲减效应,其中SH1 最为显著。结 论：DPC4/Smad4 基因RNA干扰靶点的成功设计和RNA 干扰靶点慢病毒制备,为以后探讨DPC4/Smad4 基因与肿瘤的相关性治 疗提供了实验基础。     

shRNA慢病毒表达载体对肝癌细胞HepG2中CXCR7表达的影响

目的:探讨趋化因子受体7(Chemokine receptor7,CXCR7)的短发夹RNA(a small hairpin Ribonucleic acid,shRNA)慢病毒表达载体对人肝癌细胞HepG2中CXCR7表达的影响.方法:合成4个针对CXCR7靶基因序列的shRNA,分别与Age Ⅰ和EcoRl酶切后的pGCSIL-RFP载体连接,构建CXCR7的shRNA慢病毒表达载体pGCSIL-RFP-CXCR7-shRNA;构建含有CXCR7互补DNA(complementary DNA,cDNA)的真核过表达载体pEGFP-N1-3FLAG-CXCR7,与pGCSIL-RFP-CXCR7-shRNA共转染HEK293T细胞,筛选具有显著敲减作用的CXCR7-shRNA;将具有显著敲减作用的pGCSIL-RFP-CXCR7-shRNA与慢病毒包装质粒共转染人胚肾细胞(Human embryonic kidney cells,HEK293T)产生慢病毒颗粒LV-CXCR7-shRNA,并将纯化的慢病毒颗粒感染人肝癌HepG2细胞,以逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和免疫印迹(Western blot)分别检测CXCR7信使核糖核酸(mRNA)和蛋白的沉默效果.结果:聚合酶链反应(Polymerasechain reaction,PCR)鉴定及测序结果表明成功构建4个CXCR7的shRNA慢病毒表达载体,并筛选出具有显著敲减作用的pGCSIL-RFP-CXCR7-shRNA2;包装含有CXCR7一shRNA2的慢病毒颗粒LV-CXCR7-shRNA2(病毒滴度为3x 109TU/ml),感染HepG2细胞,CXCR7mRNA和蛋白的表达水平下调.结论:成功构建靶向CXCR7基因的shRNA慢病毒表达载体,可有效抑制人肝癌HepG2细胞CXCR7 mRNA和蛋白的表达.     

shRNA慢病毒载体稳定抑制LRP16 表达的HepG2 细胞的构建及鉴定

目的:构建LRP16基因抑制表达的Hep G2稳定细胞系,鉴定其LRP16基因抑制表达的效果。方法:构建LPP-HSH008357-LVRH1GP-200短发卡RNA(sh RNA)慢病毒表达载体,用该抑制表达慢病毒感染Hep G2细胞系,通过荧光筛选及药筛,获得LRP16基因稳定抑制表达细胞系;最终运用Q-PCR和Western blot鉴定该稳定细胞系中LRP16的表达。结果:构建了LRP16基因抑制表达及抑制表达对照的Hep G2稳定细胞系,并通过Q-PCR和Western blot进行了鉴定。Q-PCR结果显示相对于对照稳转株(LPP-CSHCTR001-LVRH1GP-100),抑制表达稳转株(LPP-HSH008357-7-LVRH1GP-200)LRP16基因的抑制效率是4组抑制表达细胞中效果最理想的一组,其抑制效率高达98%;Western blot结果也显示该抑制表达稳转株(LPP-HSH008357-7-LVRH1GP-200)的LRP16蛋白表达量明显低于野生型Hep G2细胞及对照稳转株(LPP-CSHCTR001-LVRH1GP-100),其结果与Q-PCR一致。结论:构建并鉴定了人LRP16基因抑制表达Hep G2稳定细胞系及其相应的对照稳转株。     

体外针对X基因的小干扰RNA的抗乙型肝炎病毒效应研究

目的：探讨体外针对乙型肝炎病毒（HBV）X基因的小干扰RNA（siRNA）对HBV复制和抗原表达的抵制作用。方法：利用siRNA表达框架法设计针对HBVX基因的siRNA,转染HepG2．2．15细胞,RT-PCR半定量检测转染前后X基因的表达;ELISA法测定各组24、48、72hHBsAg和HBeAg的含量;荧光定量PCR检测48h时HBVDNA的变化。结果：制备了HBVX基因的siRNA,转染后24、48和72h,HBVX基因mRNA的量分别减少了57％、78％和40％;siRNA能抑制HBsAg和HbeAg的分泌,抑制高峰在48h,抑制率分别为42％和43％;荧光定量PCR证实HBVDNA的复制亦受到抑制。结论：针对HBVX基因的siRNA在体外具有抑制HBV复制和抗原表达的作用。     

AKT2基因短发夹结构RNA慢病毒载体的构建及鉴定

目的：构建丝/苏氨酸蛋白激酶2（AKT2）基因RNA干扰（RNAi）慢病毒载体。方法：利用公用网站按照RNAi序列设计原则,设计RNAi靶点序列并合成靶序列的Oligo DNA,退火形成双链DNA,与经MluI和ClaI进行酶切后的PLVTHM载体连接产生shRNA慢病毒载体。应用shRNA慢病毒载体转染293T细胞及U87细胞,测定病毒滴度,流式细胞仪测定U87细胞的转染效率,PCR及Western blot鉴定AKT2基因在U87细胞中的下调作用。结果：成功构建了shRNA-AKT2慢病毒载体,经测序与设计合成的靶向链完全一致。荧光显微镜下观察293T细胞感染效率大于90%,病毒滴度为3.59×107TU/ml;流式细胞仪测定对AKT2细胞的转染效率为86.93%。PCR测定shRNA载体感染U87细胞后AKT2的干扰效率为68%。Western Blot结果显示该慢病毒载体对AKT2的表达有较为显著的敲减作用。结论：成功构建了人胶质瘤细胞株AKT2基因RNAi慢病毒载体,为后续的体内外功能学试验创造了条件。     

针对NSP4基因的shRNA抑制牛轮状病毒的体外增殖

本研究根据牛轮状病毒(Bovine rotavirus,BRV)的NSP4基因序列,设计并构建了shRNA重组慢病毒载体RNAi-H1-89,利用脂质体介导法,将RNAi-H1-89与辅助质粒共转染293细胞,包装shRNA重组慢病毒;重组慢病毒感染MA104细胞24h后继续接种BRV,以针对LacZ基因的shRNA重组慢病毒为对照,48h后与LacZshR-NA对照比较,RNAi-H1-89明显抑制MA104细胞病变;RT-PCR检测结果表明,针对NSP4基因的shRNA可特异性抑制牛轮状病毒NSP4基因表达;病毒滴度测定表明,在转染50%、75%、95%RNAi-H1-89质粒的细胞培养上清液中,病毒滴度分别是对照组的50%、20%和10%。上述实验结果表明,针对NSP4基因的shRNA能高效地沉默NSP4基因,并且能阻断牛轮状病毒增殖。     

AKT2 基因短发夹结构RNA 慢病毒载体的构建及鉴定

目的:构建丝/苏氨酸蛋白激酶2(AKT2)基因RNA干扰(RNAi)慢病毒载体。方法:利用公用网站按照RNAi序列设计原则,设计RNAi靶点序列并合成靶序列的Oligo DNA,退火形成双链DNA,与经MluI和ClaI进行酶切后的PLVTHM载体连接产生shRNA慢病毒载体。应用shRNA慢病毒载体转染293T细胞及U87细胞,测定病毒滴度,流式细胞仪测定U87细胞的转染效率,PCR及Western blot鉴定AKT2基因在U87细胞中的下调作用。结果:成功构建了shRNA-AKT2慢病毒载体,经测序与设计合成的靶向链完全一致。荧光显微镜下观察293T细胞感染效率大于90%,病毒滴度为3.59×107TU/ml;流式细胞仪测定对AKT2细胞的转染效率为86.93%。PCR测定shRNA载体感染U87细胞后AKT2的干扰效率为68%。Western Blot结果显示该慢病毒载体对AKT2的表达有较为显著的敲减作用。结论:成功构建了人胶质瘤细胞株AKT2基因RNAi慢病毒载体,为后续的体内外功能学试验创造了条件。     

肌球蛋白X干涉载体的构建与鉴定

肌球蛋白X(Myosin X,Myo X)是近年来发现的在细胞运动中发挥重要功能的非传统型肌球蛋白,但其发挥功能的分子机制目前尚不明确,RNA干扰技术是目前研究基因功能常用的方法。构建针对鼠的Myo X基因mRNA的shRNA真核表达载体,并转染NLT细胞,观察其对Myo X表达的抑制效应。结果显示,shRNA-2能够有效地降低Myo X的蛋白表达水平,而shRNA-1则不能。进一步分析显示,转染shRNA-2的NLT细胞丝状伪足的形成受到抑制,表明shRNA-2是能够抑制Myo X表达的干涉载体,此干涉载体的构建为进一步研究Myo X的新功能,揭示其作用的分子机制奠定基础。     

小鼠肌肉生长抑制素基因短发夹RNA促进MyoD在C2C12细胞中的表达

肌肉生长抑制素(myostatin,MSTN)属于转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)超家族,主要功能为负向调节骨骼肌的生长.肌肉生长抑制素基因敲除小鼠肌肉出现显著增加,而将干涉该基因的短发夹RNA注射并电击转化入大鼠胫前肌则引起肌肉重量、肌纤维以及MHCⅡ表达的增加.通过与小鼠肌肉生长抑制素基因表达载体共转染HEK293细胞,筛选到两条能够高效抑制小鼠肌肉生长抑制素基因表达的小干涉RNA.构建了这两条小RNA的表达载体Mst-shRNA1和Mst-shRNA2,用其分别转染小鼠C2C12成肌细胞,并通过G418药物筛选和流式细胞仪富集整合了短发夹RNA表达载体的阳性细胞.通过采用Real-time PCR和Western blot分析,检测到在分别整合了Mst-shRNA1和Mst-shRNA2的C2C12细胞中,内源性肌肉生长抑制素基因的mRNA水平分别下降了10.2%和35.5%,蛋白质表达则分别下降了29.3%和64.7%.同时,在这两组中MyoD的表达上升了24.4%和40.4%,证明通过RNA干涉实现的肌肉生长抑制素基因的抑制导致了下游MyoD基...