肌酸激酶在低浓度脲溶液中失活也非二聚体解聚所致

本文用兔肌肌酸激酶(MM)和兔脑肌酸激酶(BB)杂化的方法;研究了肌酸激酶在脲溶液中的解聚情况.结果表明在低浓度的脲溶液中二聚体没有或者很少解聚,而此时酶已经失去大部分或全部活性.因此可以认为在低浓度脲溶液中酶的失活也非二聚体解聚所致,进一步支持了酶分子活性部位柔性的观点.     

肌酸激酶胍变性与失活的关系

肌酸激酶(CK2.7.3.2)催化磷酸肌酸与ATP相互转化的反应。姚启智等曾对其在盐酸胍中的构象变化与失活动力学进行了比较研究,发现在低浓度变性剂中,失活的速度与程度都远大于构象变化。此酶为球蛋白,由两个可以解离的相同亚基组成,分子量82,600。本文在最适pH附近(pH9.0)测定了不同浓度盐酸胍中酶的沉降系数,对其解聚与构象变化进行了研究,以探讨快失活、慢构象变化与解聚的关系。 兔肌肌酸激酶的提取、活力测定、盐酸胍的纯化方法与文献[1]相同。沉降系数用日立282-型分析超速离心机于20℃左右测定,Schlieren光学系统,标     

胍和脲溶液对氨基酰化酶活性和构象的影响

 本文研究了不同浓度盐酸胍和脲溶液对猪肾氨基酰化酶活性和构象的影响。研究结果表明,在低浓度的胍和脲溶液中(小于2mol/L),酶分子的整体构象变化的程度与活力变化的程度基本是平行的;而在高浓度的胍和脲溶液中(2mol/L以上),失活程度稍大于构象变化的程度。这些结果与分子量和亚基组成基本相同,但不含金属配基的肌酸激酶的结果,以及小分子量的胰凝乳蛋白酶和牛胰核糖核酸酶的结果相比较来看,可以认为配基锌离子的存在对酶分子的活性部位区域构象的稳定作用有一定的贡献,致使氨基酰化酶的活性部位的构象状态不象后三种酶那样脆弱。同时,我们还发现锌离子的存在对酶分子整体构象的稳定性上贡献很小。     

腺苷酸激酶的脲激活及构象变化

用紫外吸收、圆二色、ANS结合外源荧光和小角X 射线散射等方法研究了腺苷酸激酶 (AK)的脲变性去折叠过程 .实验发现 :低浓度脲对酶有激活作用 ,最大激活的脲浓度是 1mol/L ;伴随着激活 ,酶分子的二级结构发生了微小的变化 ,但此时观察不到其整体结构的明显变化 .对照分析AK的晶体结构和催化反应机制 ,激活作用被认为是低浓度脲增加了酶分子活性部位的柔性 .AK与ANS结合荧光与脲浓度关系的研究支持了上述推论     

毛竹脱氧辛糖酸-8-磷酸合酶的原核表达、纯化及酶的特性

脱氧辛糖酸-8-磷酸合酶(3-Deoxy-D-manno-octulosonate 8-phosphate synthase,KDO8PS)是一种参与细胞壁八碳糖(KDO)合成代谢的关键酶之一。为了解该酶催化特性和功能,本实验采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)方法首次分离得到毛竹Pe KDO8PS基因。序列分析表明该基因CDS区全长876 bp,编码291个氨基酸。通过IPTG诱导,含有该基因的原核表达载体在大肠杆菌中获得了大量可溶性活性蛋白表达;经Ni-NTA亲和层析和分子筛层析(SEC)方法进行酶蛋白的两步分离纯化,得到纯度大于90%以上的高纯度酶;SEC结果发现,纯化后目的蛋白KDO8PS在溶液中主要以二聚体形式存在。戊二醛交联实验证实该酶具有形成二聚体/四聚体的可能性,进一步通过超速离心(AUC)分析,发现水溶液中KDO8PS在高浓度时二聚体会聚合转化形成四聚体。推测形成二聚体/四聚体可能是保持酶稳定性的一种机制。通过测定毛竹KDO8PS酶学性质,发现该酶催化反应的p H值范围在4.0-9.0,最适p H值为8.0;热稳定性范围25-65℃,最适作用温度为55℃;各种二价金属阳离子在低浓度下均对酶活性存在不同程度的抑制作用,其中以Fe3+对酶活性的抑制作用最强,而低浓度EDTA可通过螯合作用消除金属离子的抑制作用。以上研究结果为植物KDO8PS蛋白结构与功能及其在新型抗生素领域中的工业化应用提供了重要理论基础。     

人肌肌酸激酶胍变性时的失活与构象变化的比较研究

应用二阶导数光谱、紫外差吸收光谱和荧光光谱等监测手段,研究了人肌肌酸激酶在盐酸胍溶液中的构象变化。二阶导数光谱结果表明,若以6M盐酸胍中肌酸激酶酪氨酸残基的暴露程度为100％,则天然酶酪氨酸残基的暴露程度只有2％。而紫外差吸收光谱和荧光光谱的变化与兔肌肌酸激酶的结果相似。比较不同胍浓度下人肌肌酸激酶的失活与构象变化,表明酶的失活先于构象变化。同时还测定了不同浓度胍溶液中人肌酶的失活与构象变化的速度常数。结果表明以几种方法测定的构象变化均为单相的一级过程,而酶的失活却呈现了由快慢两相组成的一级反应过程。比较同浓度胍溶液中的失活速度与构象变化速度,发现酶失活的快相反应速度常数比构象变化的速度常数大1—2个数量级,慢相速度常数与构象变化速度常数相近。上述结果进一步支持了酶的活性部位构象柔性的观点。     

功率超声方法对蛋白质包涵体的解聚

用低频功率超声波辐照方法,实现了在低浓度变性剂(4mol/L尿素)中对大肠杆菌体系表达产物缩短的人巨噬细胞集落刺激因子(hM-CSF)包涵体的解聚,以期改进普遍采用的强烈变性剂(8mol/L尿素)溶解包涵体方法,超声处理后的SDS-PAGE在分子量17000上显示了与8mol/L尿素溶解结果相同的条带.表现出功率超声方法在基因工程包涵体解聚中的应用前景.     

胍变性肌酸激酶复性复活过程中构象与活力的比较研究

本文讨论了经3M盐酸胍变性的兔肌肌酸激酶复性和复活的动力学过程,对二者进行了比较,以期从量的关系上研究酶的构象与催化活力之间的关系。从萤光和紫外差吸收光谱的变化看,复性过程基本上是变性过程的逆转。变性肌酸激酶复性遵循一级反应方程,以萤光强度变化为标志的速度常数k=2.2×10~(-3)秒~(-1)。酶复活过程却表明由两个一级反应所组成,其速度常数分别为k_1=0.97×10~(-3)秒~(-1),k_2=0.17×10~(-3)秒~(-1)。可见构象变化速度与复活过程中较快的反应速度相近。这说明在反映色氨酸及酪氨酸微环境的构象变化基本完成之后,活力恢复的过程还没有终结。可以认为兔肌肌酸激酶的构象与活力密切相关,酶的构象完整是催化活力的基础。     

胍变性肌酸激酶复性复活过程中构象与活力的比较研究

本文讨论了经3M盐酸胍变性的兔肌肌酸激酶复性和复活的动力学过程,对二者进行了比较,以期从量的关系上研究酶的构象与催化活力之间的关系。从萤光和紫外差吸收光谱的变化看,复性过程基本上是变性过程的逆转。变性肌酸激酶复性遵循一级反应方程,以萤光强度变化为标志的速度常数k=2.2×10~(-3)秒~(-1)。酶复活过程却表明由两个一级反应所组成,其速度常数分别为k_1=0.97×10~(-3)秒~(-1),k_2=0.17×10~(-3)秒~(-1)。可见构象变化速度与复活过程中较快的反应速度相近。这说明在反映色氨酸及酪氨酸微环境的构象变化基本完成之后,活力恢复的过程还没有终结。可以认为兔肌肌酸激酶的构象与活力密切相关,酶的构象完整是催化活力的基础。     

病毒蛋白的解离和聚合作用 Ⅱ.甲酰胺和硫酸十二酯钠对烟草花叶病毒降解作用的动力学研究

研究反应的动力学是了解反应机制的有效途径之一。在烟草花叶病毒(TMV)的研究中,Buzzel通过脲对TMV解聚的动力学研究认为解聚是分阶段进行的;由此还推测了酰胺所形成的氢键在聚合中的作用。在前文中,我们也注意到破坏氢键的试剂——     

拟南芥阿拉伯糖-5-磷酸异构酶的原核表达、纯化及酶催化特性

阿拉伯糖-5-磷酸异构酶(Kds D)是2-酮-3-脱氧辛糖酸(KDO)生物合成途径的第一个关键限速酶,通过无缝克隆技术将拟南芥Kds D基因构建至原核表达载体p ET-HTT,经过IPTG诱导,在大肠杆菌BL21(DE3)中获得了大量重组蛋白的可溶性表达;表达产物经Ni-NTA亲和层析和分子筛层析(SEC)方法进行酶蛋白的分离纯化步骤,得到纯度85%以上的高纯度酶;分子筛层析结果发现纯化后的目的蛋白Kds D在溶液中主要以多聚体、二聚体和单体形式存在,这同微生物来源Kds D酶在溶液中以四聚体形式存在很大差异;进一步使用Western blotting和MALDI-TOF MASS技术对纯化的蛋白进行鉴定;测定了拟南芥Kds D酶学性质,证明该酶催化反应的最适p H值为8.0,最适作用温度为37℃,各种金属离子在低浓度均对酶活性存在不同程度的抑制作用,其中以Co~(2+)、Cd~(2+)对酶活性的抑制作用最强,而5 mmol/L金属螯合剂EDTA对酶有激活作用。此外,以阿拉伯糖-5-磷酸(A5P)为底物时,拟南芥Kds D酶动力学常数Vmax和Km值分别为0.18 mmol/(L·min)、0.16 mmol/L,比较发现该酶与底物的亲和性高于大肠杆菌Kds D。以上研究结果为Kds D蛋白结构与功能及其在新型抗生素研制领域中的工业化应用奠定了基础。     

底物对LDS变性肌酸激酶的修复作用

本文报导了底物能够诱导变性肌酸激酶活力和构象部分恢复的实验事实.92μm免肌酸激酶用47mMLDS在pH9.0的甘氨酸缓冲液中变性半小时,取1μl变性酶至2ml底物系统中,10分钟后可观察到酶活力的再现:半小时可达对照酶活力的10%.当把此变性酶液按同样倍数稀释至与测活系统相同的缓冲液中,不同时间取样测活,则观察不到活力再现.可见,前述活力再现来自底物对变性酶的作用.底物对变性酶修复后的活力随着变性程度的减小而增大.底物可使低浓度LDS变性酶活力恢复至天然酶水平.ATP对构象修复起着主要作用.     

α-胰凝乳蛋白酶在胍溶液中的变性、失活、复性、复活

前已报导,在脲或胍的作用下,肌酸激酶失活速度远快于酶分子整体构象变化的速度.本文报导利用在变性剂存在下研究底物反应的方法对分子较小,由单亚基组成,并有五个二硫键使分子结构更加稳定的胰凝乳蛋白酶,在盐酸胍作用下的变性,失活以及相应的复性,复活进行动力学的比较.结果表明失活仍快于构象变化速度,复活慢于构象的恢复速度.实验结果还表明已经充分复活的酶和未经变性的酶在溶液中的构象存在着某些差别.     

中华仓鼠二氢叶酸还原酶的酶学性质研究

测定中华仓鼠二氢叶酸还原酶（ＤＨＦＲ,Ｅ．Ｃ．１．５．１．３．）催化反应的各个动力学常数,对其反应机制进行了研究。测定了不同浓度脲溶液中酶与底物的解离常数Ｋｄ和表观米氏常数Ｋｍ,结果表明酶与底物二氢叶酸（ＤＨＦ）和还原型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（ＮＡＤＰＨ）的结合能力相差很小,都随脲浓度增加而减弱,而且一种底物的结合会削弱酶与另一底物的结合能力。研究了ＤＨＦＲ在脲变性过程中活力和构象的变化,结果表明低浓度脲可使稳态酶活力增强,此时酶的内源荧光发射光谱和ＣＤ谱变化很小;随脲浓度的增加,酶逐渐失活,同时荧光光谱的最大发射峰位红移,荧光强度和椭圆率也明显下降,说明酶活力的变化先于酶分子整体构象的变化,酶活性部位位于比酶分子整体更易受变性剂影响的有限区域,而且酶分子这种相对的和一定限度内的柔性是其表现生物活性所必需的     

人β神经生长因子在大肠杆菌中的高表达

将编码人β神经生长因子(Huβ-HGF)的基因克隆到由T7噬菌体启动子控制的pET11c大肠杆菌表达载体中,重组质粒经鉴定含有Huβ-NGF基因,未解聚的表达产物经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),结果显示出二聚体27kD的蛋白带。而完全解聚的表达产物SDS-PAGE显示出一条13β5kD单体带。经凝胶电泳扫描,表达带占菌体总蛋白的14.5％。用兔抗鼠β—NGF的多克隆抗体进行的Western-Blot的结果表明,二聚体同单体都有免疫原性。在生物活性的鉴定中,菌体表达产物可以使小鸡鸡胚的背根神经节产生神经元突起,由此可以证明该表达产物有较高的生物活性。     

DTNB对人肌肌酸激酶不可逆抑制作用的研究

本文研究了DTNB对人肌肌酸激酶的不可逆抑制作用.研究结果表明,与兔肌肌酸激酶不同,人肌肌酸激酶分子中有四个可反应SH.用邹承鲁作图法定量处理结果表明,在这四个可反应的SH中,有一个快反应SH,两个慢反应SH且这两个慢反应SH是酶的必需基团,此外还有一个反应很慢的SH.用邹承鲁提出的在抑制剂存在条件下,酶活性不可逆改变动力学方法,测定了一系列动力学常数,并对DTNB的作用机制进行了探讨.     

武夷山不同海拔梯度黄山松土壤有机氮解聚酶活性及其影响因素

土壤有机氮(SON)解聚酶对土壤大分子有机氮的解聚是土壤氮循环的限速步骤,对土壤氮循环至关重要。然而,目前亚热带森林中、高海拔梯度下SON解聚酶活性的动态及其影响因素尚不明确。在武夷山自然保护区海拔1200—2000 m的黄山松林,通过测定5个海拔梯度的土壤环境因子、理化性质和8种SON解聚酶活性的变化,探究了不同海拔梯度下SON解聚酶活性的分布规律及其影响因素。结果表明,除土壤DON含量外,其他测量的土壤环境因子和理化性质在不同海拔梯度下均存在显著的差异。SON解聚酶活性随海拔梯度呈现不同的分布规律：碱性蛋白酶(ALPT)、中性蛋白酶(NPT)、漆酶(Lac)和亮氨酸氨基肽酶(LAP)随海拔升高显著增加,酸性蛋白酶(ACPT)和几丁质酶(Chi)呈现先增后降的趋势,而锰过氧化物酶(Mnp)和谷氨酰胺酶(GLS)在海拔1800 m显著降低(P<0.05)。冗余分析表明,不同海拔梯度下SON解聚酶活性存在明显的聚类,土壤环境因子和理化性质对SON解聚酶活性的解释度高达88.18%。土壤温度(ST),含水率(SM),微生物生物量碳(MBC)和矿质氮(NH~+₄,...     

低浓度乙醇抑制糖尿病大鼠心肌损伤和NF-κB炎症信号通路活化

目的探讨低浓度乙醇对糖尿病心肌保护作用与NF-κB和TNF-α表达的关系。方法选取8周、体重140~160g的健康雄性SD大鼠30只,随机分为对照组、糖尿病组、糖尿病+低浓度乙醇组(每组10只)。通过单次腹腔内注射链脲佐菌素(STZ)制备糖尿病大鼠模型。造模成功后1周给予糖尿病+低浓度乙醇组大鼠2.5%乙醇日常饮用,1周后改为5%的乙醇持续至造模成功后第8周,对照组和糖尿病组大鼠均日常饮水。8周后取大鼠腹主动脉血进行肌酸激酶(CK)及乳酸脱氢酶(LDH)检测,取大鼠离体心肌行HE染色观察心肌细胞的形态学改变,免疫组织化学检测心肌细胞NF-κB蛋白的免疫反应性表达,酶联免疫吸附法(ELISA)检测大鼠心肌细胞中TNF-α含量。结果与对照组相比,糖尿病组大鼠的血液中CK和LDH显著升高,心肌细胞排列紊乱,NF-κB和TNF-α水平增加;糖尿病+低浓度乙醇组CK及LDH水平的升高、心肌细胞排列紊乱及结构损伤程度、NF-κB及TNF-α增加幅度均不如糖尿病组明显。结论低浓度乙醇可能通过调节糖尿病大鼠心肌细胞中NF-κB和TNF-α的表达发挥心脏保护作用。     

C-末端残基Arg缺失的D-海因酶的分子形式与稳定性

报道D-海因酶分子C-末端Arg残基的缺失,导致酶的解聚与稳定性的显著改变。用基因克隆、表达与纯化的方法,制备了重组D-海因酶(P479)及其C-末端残基Arg缺失的D-海因酶(P478)。SDS-PAGE和Native-PAGE分析表明,在完全相同的条件下,两者单体的分子量相同;但天然P479为二聚体,而P478为单体并保持约40%催化底物海因的活性。突变酶P478的pH值稳定性显著增加,抗SDS能力亦有所提高,但热稳定性明显降低。结果预示:D-海因酶的C-末端残基Arg显著影响酶的分子形式及热稳定性,虽也影响酶活性,但非酶活性所必需。     

壳聚糖固定化木瓜蛋白酶的研究

以壳聚糖为载体,成二醛为交联剂将木瓜蛋白酶固定化。5％戊二醛在4-6℃下处理载体5h,加酶液(3.5mg/mL蛋白,pH7.2)固定12h,活力回收达32％,作用于酪蛋白的半衰期为36天,其表观K_m(酪蛋白)值为0.075％(W/V),溶液酶的K_m值为0.086％;最适pH7.0～7.5,溶液酶为7.0～8.5。固定化酶在pH8.5以下,溶液酶在9.0以下活力稳定。固定化酶在45℃以下,溶液酶在75℃以下稳定。用6mol/L脲洗脱固定化酶4次(5.5h)活力仍有54.5％。用固定化酶处理啤酒浊度比对照下降了1.5-3.7倍,蛋白质含量下降了44％,冷藏(4℃)120天无冷混浊现象发生并保持了啤酒原有风味和理化性状。