重组 E.coli 解旋酶Ⅱ（UvrD）的DNA结合及解螺旋功能分析

E.coli 解旋酶Ⅱ（UvrD）是一种在甲基定向错配修复（methyl-directed mismatch repair, MMR）和核苷酸切除修复（nucleotide excision repair,NER）中起重要作用的3′→5′解旋酶.本研究对大肠杆菌的UvrD进行了重组表达和纯化,并检测其ATP酶比活性（87　U/mg）. 利用表面等离子共振（surface plasmon resonance, SPR）方法实时检测了UvrD与同源双链DNA分子（homoduplex DNA）和异源双链DNA分子（heteroduplex DNA）结合的动态过程以及镁离子对此过程的影响.结果显示,UvrD与DNA的平衡解离常数在10 ^－7mol/L 水平. DNA分子中错配碱基的存在,在一定程度上影响了二者的结合,而镁离子不是两者结合的必要因素.本研究还利用原子力显微镜（atomic force microscopy,AFM）方法在单分子水平上观察到UvrD将双链DNA解链形成单链DNA的中间体.此研究得到的UvrD与DNA结合的动力学信息数据以及解螺旋中间体的单分子可视化,为进一步深入研究UvrD在修复过程中的作用机制奠定了基础.     

大肠杆菌RecQ解旋酶的表达纯化和生物学活性研究

RecQ家族解旋酶是DNA解旋酶中高度保守的一个重要家族,在维持染色体的稳定性中起着重要的作用.人类RecQ家族解旋酶突变会导致几种与癌症有关的疾病.本研究旨在诱导大肠杆菌RecQ解旋酶体外表达,并应用生物化学和生物物理学技术研究大肠杆菌RecQ解旋酶的生物学活性. 体外诱导表达获得纯度达90% 以上并具有高活性的大肠杆菌重组RecQ解旋酶,其可溶性好;经生物学活性分析显示具有DNA结合活性、ATP依赖的DNA解链活性、DNA依赖的ATP酶活性. 较之双链DNA（dsDNA）,大肠杆菌RecQ解旋酶更容易与单链DNA(ssDNA)结合( P<0.01 ),但与长度不同的dsDNA的结合特性有差异(P<0.01)而与ssDNA没有差异(P>0.05);大肠杆菌RecQ解旋酶对3种dsDNA的解链速率不同(P<0.05);大肠杆菌RecQ解旋酶的ATP酶活性与辅助因子ssDNA长度也呈正相关(P<0.01). 这些研究结果将有助于阐明大肠杆菌RecQ解旋酶的分子作用机制,并为研究RecQ解旋酶家族其它成员的结构与功能提供帮助.     

甲磺酸培氟沙星抑制大肠杆菌RecQ解旋酶的体外DNA结合、解链和ATPase活性

RecQ家族解旋酶是DNA解旋酶中高度保守的一个重要家族,参与DNA复制、修复、重组、转录及维持端粒稳定等细胞代谢过程,在维持染色体稳定性与完整性中起着重要作用．甲磺酸培氟沙星(pefloxacin mesylate,PFM)是一种新型氟喹诺酮类抗菌药物,对一些革兰氏阴性菌具有明显的杀菌效果,临床上已广泛使用．本研究利用荧光偏振、自由磷检测技术研究PFM对大肠杆菌RecQ解旋酶的DNA结合活性、解链活性、ATPase活性的影响．结果表明,低浓度PFM可促进大肠杆菌RecQ解旋酶与ssDNA、dsDNA结合,达到一定量后PFM则抑制酶与DNA底物的结合,这种影响与DNA底物有关;PFM对RecQ解旋酶的DNA解链活性和ATP酶活性都具有抑制作用,但其抑制的效果有极显著差异(P<0.01)：比较PFM对两种活性抑制的Ci值(对解链活性抑制的Ci值为(1.5±0.2) μmol/L,对ATP酶活性抑制的Ci值为(0.010±0.005) μmol/L)可知,PFM对大肠杆菌RecQ解旋酶ATPase活性的抑制强于其解链活性. 这些结果可为研究以DNA解旋酶为药物靶标的分子机理奠定相关理论基础．     

大肠杆菌RecQ解旋酶的生物学活性分析

RecQ家族解旋酶是DNA解旋酶中高度保守的一个重要家族,在维持染色体的稳定性中起着重要的作用.人类RecQ家族解旋酶突变会导致几种与癌症有关的疾病.本研究旨在诱导大肠杆菌RecQ解旋酶体外表达,并应用生物化学和生物物理学技术研究大肠杆菌RecQ解旋酶的生物学活性.体外诱导表达获得纯度达90%以上并具有高活性的大肠杆菌重组RecQ解旋酶,其可溶性好;经生物学活性分析显示具有DNA结合活性、ATP依赖的DNA解链活性、DNA依赖的ATP酶活性.较之双链DNA(dsDNA),大肠杆菌RecQ解旋酶更容易与单链DNA(ssDNA)结合(P0.01),但与长度不同的dsDNA的结合特性有差异(P0.01)而与ssDNA没有差异(P0.05);大肠杆菌RecQ解旋酶对3种dsDNA的解链速率不同(P0.05);大肠杆菌RecQ解旋酶的ATP酶活性与辅助因子ssDNA长度也呈正相关(P0.01).这些研究结果将有助于阐明大肠杆菌RecQ解旋酶的分子作用机制,并为研究RecQ解旋酶家族其它成员的结构与功能提供帮助。     

线粒体DNA复制及其调控

从线粒体DNA复制的模型与机制、复制的调控、复制忠实性及其损伤修复3个方面对近年来的研究文献进行了总结.在复制的模型与机制方面,对传统的D环复制的细节有了更深入的了解,新的实验方法的结果显示,在哺乳动物中还存在着链结合单向复制和链结合双向复制2种模型.在线粒体DNA复制的调控方面,近年来研究较多的调控因子主要包括mtDNA聚合酶γ、线粒体单链结合蛋白(mtSSB)、引物酶、解旋酶、连接酶、拓扑异构酶、转录因子mtTFA等,介绍了这些因子的最新研究进展及调控机制;对mtDNA复制时期和拷贝数量调控机制的研究也有突破,确定了Abf2p是mtDNA复制时期与拷贝数目的调控因子.在mtDNA复制的忠实性及其损伤修复研究方面,主要涉及到DNA Polγ的校正功能、错配修复、重组修复、DNA切除修复等,在mtDNA损伤修复中仅存在碱基切除修复机制,缺少核苷酸切除修复机制.     

第11届国际生物奥林匹克竞赛(2000)理论试题B答案

细胞生物学1.删除2 .1,3,5 ,6 ,73.删除4 .2 ,6　 2 ,3,4 ,5　 6　 1,3,5　 1,3,5　 8　 75 .A　　 B6 .A　　B　　C　　 E　　D　　F7.7a.(1) 5 80　　 (2 ) 3407b. 8.DNA解旋酶 2引发酶 1DNA聚合酶 有 3′- 5′外切核酸酶活性 5DNA连接酶 4拓扑异构酶 DNA聚合酶 有 5′- 3′外切核酸酶活性 39.　　 C)　　　· H　　　　　　· H　　　　　　·E　　　　　　·F10 .RNA聚合酶 DNA聚合酶 聚合酶在 DNA区域开始识别和结合 A B聚合方向 D D酶在模板链上移动的方向 C C核苷酸底物加到生长链上的核苷酸类型 F E3′- 5′外…     

抗菌肽P7抑制大肠杆菌的非膜作用机制北大核心CSCD

【目的】研究抗菌肽P7抑制大肠杆菌的非膜作用机制。【方法】P7与溴化乙锭竞争结合大肠杆菌基因组DNA的荧光光谱,分析P7与DNA的结合方式;流式细胞术分析P7与大肠杆菌基因组DNA结合对细菌细胞周期的影响;采用磁珠富集和PCR扩增相结合的方法分析P7特异结合的DNA序列;通过实时荧光定量PCR分析P7对大肠杆菌DNA复制和SOS损伤修复基因表达的影响;核酸染料的荧光分析研究P7对大肠杆菌DNA和RNA合成的影响。【结果】P7以嵌插的方式作用于大肠杆菌基因组DNA碱基对并形成肽-DNA复合物,使溴化乙锭-DNA复合体系的荧光强度减弱。P7可以显著增加大肠杆菌细胞周期中S期细胞数目,抑制大肠杆菌DNA复制。P7特异性结合rnh A使该基因表达水平显著下调2.24倍。同时,在肽的影响下参与大肠杆菌DNA复制相关的ssb、dna G、lig B和rnh A基因的表达水平显著下调(P<0.05),DNA损伤修复的rec A和rec N基因显著上调(P<0.05)。P7可降低大肠杆菌DNA和RNA的合成。【结论】P7特异性地结合rnh A序列引起大肠杆菌DNA的损伤并抑制大肠杆菌的DNA复制。在P7的影响下,参与大肠杆菌DNA复制相关的基因的表达水平下调,DNA损伤修复基因显著上调,同时抑制大肠杆菌DNA和RNA的合成。     

DNA引发酶及其在肿瘤增殖和治疗中的作用

DNA聚合酶不能从游离的核苷酸开始合成DNA链,由DNA引发酶合成约7～10个核苷酸的RNA引物．DNA聚合酶利用引物提供自由的3′-OH末端合成新的DNA链。DNA引发酶在DNA复制的起始中起重要作用,而DNA复制是肿瘤细胞增殖的关键,抑制DNA引发酶活性,使引物的合成或延长受阻．DNA复制受抑制,肿瘤细胞不能增殖,从而达到抗肿瘤的目的。因此DNA引发酶是抗肿瘤药物研究的一个理想靶点。     

RECQL5基因的结构及其生物学功能的研究进展

RECQL5(Rec Q protein-like 5)是Rec Q DNA解旋酶家族的一个成员,同属于DEXH-box DNA/RNA解旋酶家族。Rec Q家族中的三成员(WRN、BLM、RECQL4)基因突变与人类一些遗传疾病相关,而RECQL5基因至今未发现与人类疾病相关。近年来研究发现,RECQL5对维持DNA的稳定以及在DNA的复制、修复、重组和转录等过程中发挥着非常重要的作用。该文主要对RECQL5基因的结构及其在DNA复制、修复和转录等方面的作用进行综述。     

DNA损伤修复基本方式的研究进展

DNA损伤修复基因可修复由不同原因导致的DNA损伤．从而保护遗传信息的完整性。DNA损伤修复有3种基本形式,即碱基切除修复、核苷酸切除修复和错配修复。本文综述了DNA损伤修复3种基本形式的研究进展情况并讨论了DNA链断裂重组和重接合修复及DNA聚合酶绕道修复DNA损伤。     

DEAD-box解旋酶在植物非生物胁迫响应中的功能研究进展

解旋酶广泛存在于从病毒到人类几乎所有已知的原核和真核生物体中,它们能利用NTP水解获得能量促进双链DNA/RNA解链。DEAD-box解旋酶是最大的解旋酶家族,在DNA复制、修复、重组、转录、核糖体发生和翻译起始等几乎所有涉及DNA/RNA代谢的细胞过程中均发挥重要作用。近年研究表明,DEAD-box解旋酶除具有持家基因功能外,还广泛参与植物生长发育及胁迫响应过程。目前,由解旋酶介导的胁迫应答具体机制依然不清晰。现重点介绍近年来高等植物DEAD-box解旋酶在非生物胁迫响应中的功能研究进展,同时探讨解旋酶参与胁迫应答的可能机制。     

高中生物学“DNA分子复制”教学中的2点误区

误区1：DNA分子复制时不需要DNA连接酶。 例：下面哪种酶在遗传信息的传递和表达过程中不起作用（ ）。 A．DNA连接酶 B．DNA聚合酶 C．RNA聚合酶 D．解旋酶     

DNA损伤修复机制——解读2015年诺贝尔化学奖

Tomas Lindahl, Paul Modrich和Aziz Sancar三位科学家因发现“DNA损伤修复机制”获得了2015年诺贝尔化学奖．Lindahl首次发现Escherichia Coli中参与碱基切除修复的第一个蛋白质--尿嘧啶 DNA糖基化酶（UNG）; Modrich重建了错配修复的体外系统,从大肠杆菌到哺乳动物深入探究了错配修复的机制; Sancar利用纯化的UvrA、UvrB、UvrC重建了核苷酸切除修复的关键步骤,阐述了核苷酸切除修复的分子机制．DNA损伤是由生物所处体外环境和体内因素共同导致的,面对不同种类的损伤,机体启动多种不同的修复机制修复损伤,保护基因组稳定性．这些修复机制包括：光修复(light repairing);核苷酸切除修复（nucleotide excision repair, NER）;碱基切除修复（base excision repair, BER）;错配修复（mismatch repair, MMR）;以及DNA双链断裂修复（DNA double strand breaks repair, DSBR）．其中DNA双链断裂修复又分同源重组（homologous recombination, HR）和非同源末端连接（non homologous end joining, NHEJ）两种方式．本文将对上述几种修复的机制进行总结与讨论．     

真核基因启动子非依赖的功能转录延伸复合物的体外组装

真核生物RNA聚合酶Ⅱ的持续合成能力对基因转录过程中每一个阶段,包括启动子脱离、转录暂停、转录终止以及转录偶联DNA损伤修复过程的调节至关重要.在RNA聚合酶Ⅱ介导的转录延伸过程中,其和模板DNA及转录产物RNA紧密结合,形成一个非常稳定的延伸三维复合物(elongationcomplex,EC).此特征性“泡”状结构的形成是RNA聚合酶Ⅱ持续合成能力所必需的.在不依赖启动子及众多转录起始因子的条件下,利用人工合成的RNA与DNA寡核苷酸,在体外组装形成具有功能转录活性的延伸复合物.结果表明,长度为9个核苷酸的RNA与模板DNA形成的杂合分子对转录延伸复合物的形成是必需的,而非转录模板DNA链的加入导致最终活性转录“泡”状复合物的形成,并可转录形成与模板相关的转录产物,进一步通过在模板DNA的特定位置引入一个乙酰氧乙酰氨基芴修饰基团,可特异性地阻断转录延伸过程,从而显示该系统在研究真核基因转录及转录偶联DNA损伤修复机制中的潜在应用价值.     

人类神经退行性疾病相关的三核苷酸重复DNA序列不稳定性机制研究进展

三核苷酸重复DNA序列扩增或缺失不稳定性与50多种人类神经退行性疾病有关.与疾病相关的三核苷酸重复拷贝数的增加或减少,影响了特定基因的表达,或因之产生具有细胞毒性的RNA和蛋白质已成为相关疾病的共有病理机制.现有的研究表明,疾病相关的三核苷酸重复拷贝数的改变有可能起因于相关三核苷酸重复DNA序列的异常DNA复制、修复、...     

荧光偏振技术研究Bloom解旋酶催化核心与双链DNA的相互作用

Bloom 综合症(BLM)解旋酶是RecQ家族DNA解旋酶中的一个重要成员,参与了DNA复制、修复、转录、重组以及端粒的维持等细胞代谢过程,在维持染色体的稳定性中具有重要的作用．BLM解旋酶的突变可导致Bloom综合症,患者遗传不稳定易患多种类型癌症．本研究运用荧光偏振技术研究BLM解旋酶催化核心(BLM^642～1290)与双链DNA(dsDNA)的相互作用,分析其相关特征参数,了解BLM^642～1290解旋酶与dsDNA的结合和解链特性．结果表明：BLM^642～1290解旋酶与dsDNA的结合和解链与dsDNA 3′端的单链DNA(ssDNA)长度有关;解旋酶优先结合于dsDNA底物的ssDNA末端,且每分子解旋酶可结合9.6 nt的ssDNA;dsDNA 3′端ssDNA的长度为9.6 nt时,解旋酶的解链效率达到最大且不再随其长度而变化．另外,BLM^642～1290解旋酶也能够结合和解链钝末端dsDNA,但其结合亲和力和解链效率低于有3′端ssDNA的dsDNA．推测BLM^642～1290解旋酶在与dsDNA底物结合和解链时是单体形式,可能以尺蠖的形式解开dsDNA．这些结果可为进一步研究BLM解旋酶的功能特征提供理论基础．     

洛美沙星对Bloom综合征解旋酶生物学特性影响的机理研究

Bloom综合征解旋酶(BLM)是RecQ家族DNA解旋酶中的一个重要成员,参与了DNA复制、修复、转录、重组以及端粒的维持等细胞代谢过程,在维持染色体的稳定性中具有重要作用.BLM解旋酶的突变可导致Bloom综合征.Bloom综合征是一种罕见隐性常染色体遗传疾病,患者遗传不稳定,并易患多种类型癌症.洛美沙星(LMX)可以抑制细胞内多种酶,并通过结合DNA干扰DNA代谢,从而治疗多种疾病,但是其具体的作用机理还未完全清楚.运用荧光偏振技术和自由磷检测技术,研究了LMX对BLM642～1290解旋酶DNA结合活性、解链活性和ATP酶活性的影响.运用荧光及紫外吸收光谱法研究了LMX与解旋酶结合的结合常数、结合位点数、作用力类型、结合距离等参数.结果表明,LMX与解旋酶之间能自发进行反应,两种分子有一个结合位点,通过静电引力和疏水作用力形成稳定的BLM-LMX复合物,且解旋酶的内源荧光被LMX静态猝灭,主要原因是非辐射能量转移.在这一过程中,LMX能抑制解旋酶的解链活性和ATP酶活性,而促进解旋酶的DNA结合活性.LMX对BLM解旋酶生物学活性影响的机理可能是LMX使解旋酶通过别构机制影响其ATP酶活性,并使酶的构象维持在较低解链活性的状态,通过抑制ATP催化水解与解链过程的偶联和阻止解旋酶的易位,从而抑制其解链.LMX能够促进解旋酶的DNA结合活性,可能是因为其C-6和C-7上的取代功能基团可以增加酶活力,以及增强药物、酶和DNA的结合,从而形成药物-酶-DNA复合物.这些结果为研究以DNA解旋酶为药物靶标的分子机理和理解喹诺酮类药物的作用机理奠定相关理论基础.     

DNA合成的忠实性机制

DNA的忠实性合成对于基因组稳定和物种延续至关重要,否则可能会产生严重的后果。DNA合成具有极高的忠实性,这主要基于3个步骤:(1)基于氢键、碱基对构象或其他因素的核苷酸选择;(2)基于3′→5′外切酶活性的校对,方式有顺式校对和反式校对,可以去除错误掺入的核苷酸;(3)基于错配修复、切除修复、同源重组修复和跨损伤DNA合成的修复过程,可以纠正逃过校对的错误核苷酸。由于DNA聚合酶不仅可以作为抗病毒或抗癌药物的靶标,而且其忠实性还与抗药性或药物副作用有关,所以深入研究DNA合成的忠实性具有非常重要的意义。文章主要论述了DNA合成的忠实性机制,并对DNA聚合酶的应用前景做了展望。     

DNA复制研究步入单分子时代

DNA复制是生命体内必不可少的基本过程之一。传统研究显示DNA复制体中前导链和后随链的合成速度总体来说是一致的,从而避免在新生链中产生明显的单链缺口。主流的观点认为这是由于负责前导链和后随链的两个DNA聚合酶分子之间存在着某种协调同步机制。然而,Kowalczykowski实验室最近采用单分子荧光显微技术实时跟踪发现,大肠杆菌DNA复制体前导链和后随链上两个DNA聚合酶分子互相独立工作,并且都不是匀速行进而是呈现断断续续、时快时慢的随机动态变化。当DNA聚合酶暂停复制时,解旋酶仍会持续解链,导致解旋酶和聚合酶短暂的分离。有意思的是,此时DNA复制体触发一种类似“死人键”(dead-man’s switch)的保险机制,使DNA解旋的速度降低80%,从而恢复解旋酶和聚合酶的偶联。基于单分子水平的实时观察,他们认为前导链和后随链DNA复制进程均遵循一个符合高斯分布的随机模型。这与传统的生化研究观察到两者的合成速度总体来说是一致的并不矛盾。Kowalczykowski实验室的研究实现了从复制开始到结束整个过程对每个单分子行为的连续观测,而传统研究反映的则是经过较长时间对多分子群体平均水平的最终结果进行测定。因此,单分子技术可以极大地弥补传统生化研究的不足。随着未来单分子技术的进步和更广泛的应用,必将把包括DNA复制在内的生物学研究带到一个新的时代。     

荧光偏振技术研究Bloom解旋酶催化核心与双链DNA的相互作用

Bloom 综合症(BLM)解旋酶是RecQ家族DNA解旋酶中的一个重要成员,参与了DNA复制、修复、转录、重组以及端粒的维持等细胞代谢过程,在维持染色体的稳定性中具有重要的作用．BLM解旋酶的突变可导致Bloom综合症,患者遗传不稳定易患多种类型癌症．本研究运用荧光偏振技术研究BLM解旋酶催化核心(BLM642-1290)与双链DNA(dsDNA)的相互作用,分析其相关特征参数,了解BLM642-1290解旋酶与dsDNA的结合和解链特性．结果表明,BLM642-1290解旋酶与dsDNA的结合和解链和dsDNA3’末端的单链DNA(ssDNA)长度有关;解旋酶优先结合于dsDNA底物的ssDNA末端,且每分子解旋酶可结合9.6 nt的ssDNA;dsDNA3’末端ssDNA的长度为9.6 nt时,解旋酶的解链效率达到最大且不再随其长度而变化．另外,BLM642-1290解旋酶也能够结合和解链钝末端dsDNA,但其结合亲和力和解链效率低于有3’末端ssDNA的dsDNA．推测BLM642-1290解旋酶在与dsDNA底物结合和解链时是单体形式,可能以尺蠖的形式解开dsDNA．这些结果可为进一步研究BLM解旋酶的功能特征提供理论基础．