人类天然和记忆性B细胞需要STAT3的激活而分化为分泌抗体的浆细胞

<正>长时程的记忆性抗体反应是需要长寿命浆细胞和记忆浆细胞在接触T细胞依赖抗原后产生。IL-10和IL-21能通过激活多条信号通路,包括STAT1,STAT3和STAT5;ERK;PI3K/Akt等,从而促进人类B细胞的分化成浆细胞。本文的研究人员发现,STAT3功能丧失后能阻断IL-10和IL-21介导的人类天然B细胞分化为浆细胞,然而,STAT3缺陷的病人体内记忆B细胞的细胞数虽然减少,却仍然对IL-10和IL-21产生应答,并分化成能分泌高水平的IgM,IgA和抗原特异性的IgG的浆细胞。     

敲除含α-Arrestin结构域蛋白3对肾癌细胞PI3K/AKT信号通路及增殖能力的影响

目的:探究敲除含α-Arrestin结构域蛋白3 (α-Arrestin-Domain-Containing-3,ARRDC3)对肾透明细胞癌786-O细胞PI3K/AKT信号通路和增殖能力的影响及作用机制。方法:使用Crispr-Cas9技术构建稳定敲除ARRDC3的786-O细胞系;通过免疫印迹检测敲除ARRDC3对AXL蛋白水平的影响;借助免疫沉淀技术研究敲除ARRDC3对AXL泛素化水平的影响;利用免疫印迹、shRNA干扰蛋白表达技术和及构建的敲除ARRDC3细胞检测ARRDC3和AXL表达水平对PI3K/AKT信号通路活性的影响;CCK-8技术检测ARRDC3和AXL表达水平对肾癌细胞增殖能力的影响。结果:与野生型786-O细胞相比,稳定敲除ARRDC3的786-O细胞内AXL的蛋白水平显著升高。进一步检测细胞内AXL的泛素化水平发现,ARRDC3稳定敲除组细胞内AXL蛋白的泛素化水平显著降低;免疫印迹和CCK-8实验结果显示,敲除ARRDC3会显著增加AXL/PI3K/AKT信号通路磷酸化和细胞增殖能力,而在ARRDC3缺陷细胞内降低AXL蛋白的表达,会导致AXL/PI3K/AKT的活性和细胞增殖能力恢复到与野生型相似的水平。结论:在786-O细胞内敲除ARRDC3可通过降低ARRDC3对AXL的泛素化降解,上调AXL蛋白水平和PI3K/AKT信号通路的活性,并促进肾癌细胞的增殖。     

PGRN和Rev-erbβ双基因敲除HEK 293细胞系的构建及应用

为研究PGRN与Rev-erbβ相互作用可能存在的分子机理及其生理意义,在前期构建的Rev-erbβ基因敲除HEK293 C3-6细胞系的基础上,利用CRISPR/Cas9技术构建PGRN和Rev-erbβ双基因敲除的HEK293细胞系。首先,针对PGRN基因设计了4个不同的sgRNA,经筛选将活性较高的PGRN sgRNA 2和sgRNA 3串联,构建携带双PGRN sgRNA和Cas9的慢病毒打靶载体pLenti/CMV-Loxp-Cas9-sgRNA2-U6-sgRNA3-U6-Loxp-EF1α-Puro。再将包装的携带Cas9和双PGRN sgRNA的慢病毒感染HEK293(Rev-erbβ~(-/-))细胞,通过筛选、克隆化及测序分析获得双基因敲除的HEK293 C3-6/23(Rev-erbβ~(-/-);PGRN~(-/-))单克隆细胞系,并用qRT-PCR和Western blotting检测HEK293(C3-6/23)细胞中PGRN mRNA和蛋白质的表达。最后,在双基因敲除HEK293(C3-6/23)细胞系中,通过回补基因方式研究PGRN介导Rev-erbβ对靶基因启动子转录活性调控研究。在PGRN和Rev-erbβ双基因敲除的HEK293(C3-6/23)细胞系中,PGRN基因的两条DNA链均为缺失突变型,PGRN mRNA和蛋白质的表达均未达到检测水平。同时在HEK293(C3-6/23)细胞系中研究发现PGRN与Rev-erbβ相互作用,可以增强Rev-erbβ对靶基因启动子转录的调控。利用CRISPR/Cas9系统,成功构建了双基因敲除的HEK293(Rev-erbβ~(-/-);PGRN~(-/-))C3-6/23单克隆细胞系。利用该敲除细胞系研究发现PGRN可以影响Rev-erbβ对靶基因启动子转录的调控,但PGRN参与介导Rev-erbβ转录调控的机制还有待进一步研究。     

CRISPR/Cas9介导的LATS1/2敲除抑制卵巢癌细胞ES-2增殖

Hippo信号通路在哺乳动物肝脏发育、动态平衡、再生和疾病中发挥非常重要的作用。大肿瘤抑制基因1/2（large tumor suppressor 1/2, LATS1/2）激酶是Hippo信号通路的关键激酶,可以磷酸化YES相关蛋白（yes-associated protein,YAP）,从而调节YAP的核质定位和降解。本文采用CRISPR/Cas9方法构建慢病毒介导的Last1/2基因敲除的载体,通过包装、感染和嘌呤霉素筛选,获得LATS1/2部分敲除的人卵巢癌ES-2和H08910细胞,免疫印迹方法检测LATS1/2表达明显减少。细胞增殖实验检测LATS1/2缺失明显抑制ES-2和HO8910细胞增殖。软琼脂克隆形成实验表明,LATS1/2缺失抑制卵巢癌ES-2细胞的克隆形成能力。细胞划痕和Transwell实验证明,LATS1/2缺失明显抑制卵巢癌ES-2细胞迁移。流式细胞检测发现,LATS1/2敲除促进卵巢癌ES-2细胞凋亡并影响细胞周期。裸鼠成瘤实验表明,LATS1/2缺失明显抑制体内肿瘤组织增殖。分子机制研究表明, LATS1/2敲除促进卵巢癌ES-2细胞中胶原I型α1（collagen type I α1,ColIα1）基因表达量增加,在卵巢癌ES-2细胞中同时敲除LATS1/2和COL1A1,可以促进细胞克隆形成。综上结果,人卵巢癌ES-2细胞中LATS1/2缺失能促进COL1A1表达增加, 从而抑制细胞增殖、转移和克隆形成,并影响细胞周期和促进细胞凋亡。     

Src激酶的功能研究新进展

Src激酶家族是具有酪氨酸蛋白激酶活性的蛋白质,作为连接许多细胞外和细胞内重要信号途径的膜结合开关分子,Src激酶在受体介导的信号传递及细胞间通讯中具中心调节作用。最近发现它在淋巴因子介导的细胞存活及血管内皮生长因子介导的血管发生中也具有重要作用。     

诱导型一氧化氮合酶在17β-雌二醇诱导的血管平滑肌细胞周期阻滞中的作用

利用大鼠血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMC)作为模型,观察17β-雌二醇(17β-estradiol,E2)对VSMC诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)活性和蛋白表达的影响,并探讨其在内皮素-1(endothlin 1,ET-1)刺激的VSMC周期循环中的作用。检测指标包括同位素法测定iNOS的活性,免疫印迹法(western blot)检测iNOS蛋白表达,流式细胞仪检测细胞周期,观察一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)抑制剂N^G-硝基左旋精氨酸甲酯(N^G-nitro—L—arginine methylester,L—NAME)对E2抑制VSMC细胞周期的影响。结果显示,E2明显增加iNOS的活性和蛋白表达,在30min和12h时能诱导VSMC的iNOS活性明显增加,而60min和24h时VSMC的iNOS活性与对照组无显著差异,不呈明显浓度依赖性,雌激素受体(estrogen receptor,ER)拮抗剂Tamoxifen和L—NAME能明显抑制E2诱导的VSMC iNOS活性增加;E2增加VSMC的iNOS蛋白表达的作用在3h时起效,12h达高峰,以后逐渐下降,呈浓度依赖性,Tamoxifen能明显抑制马诱导的VSMC iNOS蛋白表达;E2明显抑制ET-1诱导的S期细胞百分比和G2 S／G1增加,使VSMC在G1期发生细胞周期阻滞,这些作用可被预先给予L—NAME所明显减轻。上述结果提示,E2使ET—l刺激的VSMC细胞周期循环在G1期发生阻滞与增加VSMC iNOS活性有关,该作用至少部分通过ER介导。     

淋巴细胞活化基因-3敲除(Lag-3~(-/-))小鼠构建及初步表型分析

目的构建淋巴细胞活化基因-3(Lag-3)基因敲除小鼠,初步分析Lag-3基因敲除对小鼠表型影响,为后续Lag-3体内功能研究提供动物模型。方法利用CRISPR/Cas9技术结合受精卵显微注射构建敲除小鼠,通过分子鉴定筛选基因敲除阳性小鼠,利用RT-PCR和流式检测方法进一步验证Lag-3基因敲除小鼠体内Lag-3基因敲除效果;通过建立Con A诱导的肝损伤模型研究Lag-3基因在体内的功能。结果 PCR和产物测序结果显示,获得了exon 2缺失的Lag-3基因敲除小鼠;该基因敲除纯合子小鼠(Lag-3~(-/-))经刀豆蛋白(Con A)刺激后,小鼠心脏、脾、肺、巨噬细胞和淋巴结中仅能检测到Lag-3 mRNA本底表达信号,小鼠巨噬细胞、脾细胞和淋巴结中仅能检测到非常低数量的Lag-3阳性细胞。表型分析发现,Lag-3基因的缺失显著减少了Con A诱导的小鼠外周血、骨髓和脾CD3+T细胞的数量,减轻了Con A诱发的急性肝损伤情况。结论成功构建Lag-3基因敲除小鼠模型,肝损伤过程中的体内功能研究显示,Lag-3缺失可以显著缓解Con A引发的肝损伤的发生。     

ILK—整合素信号传导通路中的关键激酶

胸外基质与细胞的相互作用主要由整合素介导。由整合素介导的机械和生化信号调控胞浆激酶、生长因子受体、离子通道的活性并掏胞内肌动蛋白细胞骨架的组装。众多由整合素介导的信号传导通路最后可归于对细胞周期的调节、决定细胞存活或死亡、增殖或者退出细胞周期和分化。近年的研究发现,整合素连接激酶（inte-grin-linked kinase,ILK）在这些信号传导通路中具有关键作用。     

A型流感病毒通过激活HIF-1α/iNOS/VEGF信号通路诱导肺上皮细胞铁死亡的机制

【背景】已发现A型流感病毒（influenza A virus,IAV）可激活多种程序性细胞死亡途径,这些途径在宿主细胞防御系统中起着重要作用。铁死亡是一种新型的非凋亡细胞死亡,主要由铁依赖性脂质过氧化介导。【目的】探讨HIF-1α/iNOS/VEGF信号通路在IAV感染诱导的细胞铁死亡中的作用机制。【方法】使用IAV感染小鼠肺上皮细胞（MLE-12）构建细胞损伤模型后检测细胞病毒滴度和炎性因子分泌;使用荧光探针法和比色法检测细胞活性氧（reactive oxygen species,ROS）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）、总铁离子和亚铁离子;透射电镜观察细胞超微结构;检测细胞铁死亡标志物mRNA和蛋白表达;生物信息学预测流感病毒诱导铁死亡潜在作用机制;激光共聚焦观察IAV对细胞缺氧诱导因子-1α（hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α）表达影响,并检测其信号通路相关元件mRNA和蛋白表达;构建HIF-1α敲低模型,探讨HIF-1α/iNOS/VEGF信号通路在IAV诱导细胞铁死亡中的作用。【结果】铁死亡抑制剂能降低IAV感染细胞的病毒载量和炎性因子的分泌,并能抑制细胞ROS、总铁离子和亚铁离子含量,促进细胞SOD活性,修复细胞线粒体损伤,逆转铁死亡标志物mRNA和蛋白表达;生物信息学预测发现HIF-1α/iNOS/VEGF信号通路在IAV诱导的铁死亡中具有重要的相关性;试验验证IAV感染能促进细胞HIF-1α的激活和易位入核,并激活HIF-1α、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）、诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase,iNOS）的mRNA和蛋白表达。【结论】IAV感染可以诱导细胞发生铁死亡,其作用机制可能是通过激活HIF-1α/iNOS/VEGF信号通路发挥作用。     

Notch3在血管平滑肌细胞中对Erk1/2的调控作用研究

Erk1/2活性在血管许多细胞功能中具有重要影响,而Notch3主要表达在动脉平滑肌细胞中,并且是发育过程中动脉成熟所必需的.为了探讨Notch3在血管平滑肌细胞中对Erk1/2信号通路的调控作用,采用siRNA基因敲除Notch3,γ-分泌酶抑制剂DAPT抑制Notch信号通路,质粒转染过表达Notch3活性区等方法,用Western印迹检测Notch3对血管平滑肌细胞中Erk1/2磷酸化水平,即Erk1/2活性的影响.同时,利用活性氧自由基（ROS）诱导激活Erk1/2;siRNA敲除Notch3表达致使血管平滑肌细胞中Erk1/2的磷酸化水平显著降低,并且抑制了ROS诱导的Erk1/2激活;同样,Notch通路抑制剂DAPT也抑制了ROS诱导的Erk1/2激活;而Notch3活性区NICD的过表达并没有改变血管平滑肌细胞中Erk1/2的磷酸化水平,但其延缓了ROS激活后Erk1/2活性的衰减.上述结果表明,Notch3可在血管平滑肌细胞中调控Erk1/2活性以及ROS诱导的Erk1/2信号激活.     

ANGPTL8调控糖代谢作用机制研究

探讨ANGPTL8在胰岛素作用下对人肝细胞糖代谢影响及可能的作用机制。利用尾静脉水动力转染证实在小鼠肝脏过表达ANGPTL8可提高进食期糖耐受;在Hep G2细胞中利用q PCR检测进食的主要调控因素胰岛素、葡萄糖等对ANGPTL8表达影响,发现单独的葡萄糖或胰岛素对ANGPTL8表达影响不明显,而葡萄糖和胰岛素组合可显著促进ANGPTL8表达;利用Western blotting分析在ANGPTL8敲除(ANGPTL8-/-)和ANGPTL8稳定过表达(ANGPTL8++)的Hep G2细胞中胰岛素介导PI3K/AKT信号通路蛋白及其蛋白磷酸化表达差异,结果显示ANGPTL8可上调胰岛素介导的AKT信号通路中AKT、GSK-3β、Fox O1蛋白磷酸化;PAS染色分析ANGPTL8可促进胰岛素介导的糖原合成。     

ICOS通过Survivin维持T细胞分裂及存活

有关T细胞共刺激分子信号转导方面的研究远落后于其功能研究,为探讨T细胞活化后诱导表达的共刺激分子ICOS(induciblecostimulate)维持T细胞存活、抑制活化后T细胞凋亡的作用是否与survivin相关,利用survivin重组腺病毒感染活化但不提供共刺激信号的T淋巴细胞,或者在活化后提供ICOS信号的条件下人工给予优势抑制survivin突变基因,CCK-8及TUNEL法分别检测活化晚期上述T细胞存活及凋亡情况.结果显示,T细胞活化后2～6天,ICOS抗体刺激可以明显增强survivin表达,survivin可维持无ICOS信号的T细胞存活减少其凋亡,突变型survivin在ICOS信号存在下抑制T细胞存活使其凋亡增加.结果提示,活化后表达的共刺激分子ICOS通过survivin维持T细胞分裂和存活.     

白细胞介素-1受体相关激酶-2的共价修饰与激酶活性的研究

白细胞介素-1受体相关激酶-2(IRAK2)是调节IL1和Toll样受体信号通路的一个关键性分子,目前对于共价修饰如何调节IRAK2的活性还所知甚少。当与IRAK1共转染时,IRAK2能被共价修饰,在SDS-PAGE分离中呈现出迁移率变慢的多条电泳带。在小鼠骨髓干细胞分化的巨噬细胞(BMMs)中,内源表达的IRAK2在TLR配体刺激下也呈现出类似的共价修饰。而且IRAK2的共价修饰具有磷酸酯酶敏感性,提示大部分为磷酸化修饰。通过体外磷酸激酶活性分析,发现巨噬细胞中表达的IRAK2能在LPS诱导下被激活,成为一个具有激酶活性的调节蛋白。进一步研究发现激酶灭活的IRAK2突变体不能重建IRAK2基因敲除巨噬细胞的功能。通过Western杂交和定量PCR分析,发现IRAK2的激酶活性是介导LPS诱导的信号通路和炎症因子表达所必须的。因此,在LPS诱导下,IRAK2可能被IRAK1进行磷酸化修饰而活化,从而介导下游的信号转导通路、诱导炎症因子的表达。     

Gsα调控小鼠大脑皮层发育

异源三聚体G蛋白激活alpha亚基(Gsα),是一种普遍存在的鸟苷酸结合蛋白,调节受体介导的胞内cAMP信号通路进而参与调控细胞的生命活动。目前Gsα信号通路的研究主要在生物化学和药物方面,但在小鼠大脑皮层发育中的作用还没有详尽的描述。本研究首先利用cre-loxP系统在小鼠大脑皮层神经前体细胞中成功敲除Gsα基因;其次,通过收集出生后不同天数的正常小鼠和敲除小鼠,统计分析后发现敲除鼠的脑重和体重减轻;最后,对小鼠大脑做切片后染色,发现在小鼠大脑皮层条件性敲除Gsα基因的成年鼠中表达thy1-EGFP(增强绿色荧光蛋白)的神经元的数量减少,皮层形成异常。由此推测,Gsα在小鼠大脑皮层发育中发挥重要作用。     

C/EBP同源蛋白促进动脉移植片和动脉粥样硬化斑块中平滑肌细胞的增殖

<正>C/EBP同源蛋白(CHOP)是介导内质网应激(ER stress)引起的未折叠蛋白反应(unfolded protein response,UPR)的主要效应分子,它促进动脉粥样硬化斑块局部的巨噬细胞凋亡,从而加速动脉粥样硬化进程,但CHOP不依赖于髓系细胞而促动脉粥样硬化的作用机制尚不明确。最近美国哥伦比亚大学Ira Tabas的研究小组利用血管平滑肌细胞特异性CHOP敲除的APOE-/-小鼠揭开了上述谜底。他们发现,经过12周的高脂饮食,平滑肌细胞特异性敲除CHOP的APOE-/-小鼠动脉粥样     

NPAS2基因敲除的HepG2细胞系构建及其对肝癌细胞凋亡的影响

目的:利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建生物节律基因NPAS2敲除的HepG2肝癌细胞系,并初步探讨NPAS2基因敲除对肝癌细胞凋亡的影响。方法:利用sgRNA在线设计工具,针对NPAS2设计两条sgRNA;利用PX459质粒构建分别含有两条sgRNA的敲除载体PX459-sgRNA1;PX459-sgRNA2;利用T7核酸内切酶I检测两条sgRNA活性;将活性较高的打靶载体瞬时转染HepG2细胞,经过药物筛选,克隆化培养及基因测序后得到NPAS2敲除的HepG2肝癌细胞系;利用Western blot检测NPAS2蛋白的表达和凋亡相关蛋白Caspase3的活化;利用流式细胞仪检测敲除细胞系的凋亡水平。结果:成功构建了针对NPAS2的打靶载体;并筛选得到了活性较高的打靶载体;经过药物筛选和克隆化培养得到的NPAS2敲除肝癌细胞系未检测到NPAS2蛋白的表达;进一步发现NPAS2敲除的肝癌细胞Caspase3明显活化,凋亡水平显著升高。结论:利用CRISPR/Cas9基因编辑技术成功构建了NPAS2基因敲除的HepG2肝癌细胞系,并发现NPAS2敲除可以促进肝癌细胞凋亡,为进一步研究生物节律基因NPAS2及其它相关基因在肝癌发生发展中的作用机制提供了有力的工具。     

姜黄素对脂多糖激活的小胶质细胞iNOS 表达的抑制及抗氧化作用

用姜黄素预处理小胶质细胞株BV,1 h后加用脂多糖(200 ng/ml)进行刺激,通过MTT检测细胞活性;硝酸还原酶法检测细胞上清液中一氧化氮(NO)的含量;Western 印迹、免疫细胞化学染色检测细胞活化后形态及诱导型一氧化氮合酶(iNOS)蛋白的表达;瞬时转染和荧光素酶报告基因鉴定iNOS和NF-κB基因表达活性;SOD和GSH-Px检测姜黄素的抗氧化能力.结果证明,脂多糖可促使小胶质细胞活化,使iNOS和NF-κB基因表达活性显著增强;iNOS蛋白表达明显上调,NO释放增多;细胞内SOD和GSH-Px活性明显下降.而姜黄素(10 μmol/L)可以显著抑制活化后小胶质细胞NO的产生、iNOS蛋白的表达及iNOS-Luc、NF-κB-Luc的表达活性,其机制可能通过NF-κB的信号转导途径抑制iNOS的表达.姜黄素可通过提高细胞内SOD和GSH-Px的活性发挥抗氧化作用.     

毕赤酵母STE13基因敲除对GGH表达及其生物活性的影响

目的:重组毕赤酵母GS115/pPIC9K-GGH表达的人胰高血糖素样肽-1-人血清白蛋白融合蛋白[(GLP-1 A2G)2-HSA,GGH]的细胞活性测评结果显示生物活性较低,这可能与其表达过程中蛋白降解有一定关联.通过对毕赤酵母GS115 STE13基因的敲除,获得一株完整表达蛋白GGH的毕赤酵母宿主,并进一步提高其表达产物GGH的生物活性.方法:采用基于PCR技术介导的Cre-Loxp系统重组技术成功敲除宿主菌GS115的STE13基因,得到一株STE13缺陷型菌株GS115/D13,并通过细胞活性测评系统检测GS115/D13表达产物GGH的生物活性.结果:通过对STE13基因缺陷型菌株GS115/D13与出发菌株GS115/W发酵表达对比,显示GS115/D13菌株表达融合蛋白GGH生物活性有明显提升,且表达量提高了25.8％,两菌株生长无明显差异.结论:STE13基因的敲除成功缓解了GGH表达过程中的降解问题,并相对出发菌株GS115/W大幅度提高了蛋白生物活性.     

血管内皮生长因子受体-2所介导信号通路的研究进展

血管新生是许多生理和病理进程发生的重要机理．在生物体内,血管新生需经过多步精细调控历程,现有研究表明,血管内皮生长因子(VEGF)及其受体蛋白酪氨酸激酶,尤其是血管内皮生长因子受体-2(VEGFR-2)所介导的信号级联通路是其中关键性的调节途径．VEGF/VEGFR-2所介导的信号级联通路可以调控血管内皮细胞的增殖、迁移、存活和通透性的改变,促进血管的新生．VEGF与VEGFR-2的胞外区特异性结合后,引起受体的二聚化和自身的交互磷酸化,使胞内特定的酪氨酸残基磷酸化．下游信号蛋白可以通过其Src同源结构域-2(SH2)与VEGFR-2结合,随后激活下游的效应蛋白,调控内皮细胞的生物学活性．此外,VEGF/VEGFR-2信号通路还可以下调树突细胞(DC)的活性．对VEGF/VEGFR-2信号通路作用的深入了解,将有助于新药的研发．     

机械刺激诱导的烟草悬浮细胞一氧化氮产生途径及其与C矿和钙调素的关系

通过提高摇床转速对烟草细胞施加机械刺激（Ms）可诱导其胞内一氧化氮（No）的快速产生和一氧化氮合酶（Nos）活性的提高,这种MS诱导的NO产生可被N0清除剂cPTIO和NOS抑制剂L-NMMA显著抑制。此外,Ca2＋螯合剂EGTA、质膜Ca＋通道阻断剂La3＋、胞内Ca2＋通道拮抗剂钌红,以及钙调素抑制剂CPZ和TFP预处理均不同程度地抑制了机械刺激诱导的烟草细胞NO的产生,而机械刺激过程中钙调素活性显著上升并与NOS活性和NO含量的变化相一致。这些结果暗示着（类）Nos酶催化的精氨酸依赖途径可能是机械刺激诱发烟草细胞NO产生的主要途径,Ca2＋／CAM可能通过调节（类）NOS活性来调控No的产生。