缺氧条件下GC-1细胞凋亡的作用机制研究

以小鼠精原细胞系GC-1细胞为研究对象,探讨缺氧条件下GC-1细胞凋亡潜在的分子机制。首先,采用CCK-8 (Cell Counting Kit-8)法检测不同缺氧时间处理下的细胞活力,以确定细胞缺氧损伤的时间;然后,通过化学荧光法检测GC-1细胞中活性氧(reactive oxygen species, ROS)的含量,采用JC-1法检测线粒体的膜电位,采用比色法检测ATP的含量,采用线粒体荧光探针法检测线粒体的数量与分布,并采用透射电镜观察细胞的超微结构;最后,利用实时荧光定量PCR检测线粒体信号通路相关基因胱天蛋白酶(caspase)-3、caspase-9、细胞色素c (cytochrome c, Cyt-c)、Bax和Bcl-2的m RNA表达水平。结果显示,缺氧36 h后,细胞活力为(60.36±5.40)%,符合后续实验需求;在缺氧条件下, GC-1细胞中的ROS含量显著增加, ATP含量显著下降,线粒体膜电位下降、数量减少,同时细胞中促凋亡相关基因的表达水平上调,抗凋亡因子Bcl-2的基因表达水平下调。实验结果初步表明,缺氧可导致GC-1细胞线粒体功能障碍, ROS/线...     

线粒体自噬在缺氧条件下适应机制的研究进展

由于线粒体能敏感地感受机体内氧浓度的变化,缺氧时会影响线粒体氧化磷酸化过程中电子传递链的正常功能,抑制ATP生成,产生大量活性氧(ROS)。ROS蓄积导致氧化损伤细胞内脂质、DNA和蛋白质等大分子物质,线粒体肿胀,通透性转换孔开放,释放细胞色素C等促凋亡因子,最终严重影响细胞的存活。因此这些功能异常或受损线粒体是缺氧应激状态下细胞是否存活的危险因素,及时清除这些线粒体,对维持线粒体质量、数量及细胞稳态具有重要意义。线粒体自噬是近年来发现的细胞适应缺氧的一种防御性代谢过程,它通过自噬途径选择性清除损伤、衰老和过量产生ROS的线粒体,促进线粒体更新和循环利用,确保细胞内线粒体功能稳定,保护缺氧应激下细胞的正常生长发挥重要的调节作用。本文就线粒体自噬在缺氧条件下发生过程、参与相关蛋白及调节机制等方面研究进行了综述。     

线粒体内活性氧产生靶标位点研究进展

活性氧(reaction oxygen species,ROS)是真核细胞在生命活动过程中产生的一种中间产物,它在胞内信号转导、细胞应答、损伤修复等过程发挥着重要的作用。线粒体在合成三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)过程中有部分电子会从电子传递链(electron transport chain,ETC)上泄漏,与细胞质中O2、H2O及NO等结合产生ROS,是细胞内ROS的主要来源。目前,人们对真核线粒体内ROS的产生位点已有初步的了解,大多数研究证实复合物Ⅰ和复合物Ⅲ是ROS的主要来源,复合物Ⅱ也能产生部分的ROS,但其具体的靶标位点还未得到全面的阐述,使得深入了解线粒体内ROS的功能受到限制。现就诱导线粒体产生ROS的主要方法和线粒体内产生ROS的靶标位点进行简要的综述,以期为日后相关生理学、毒理学及病理学等研究提供参考。     

ATP浓度和缺氧暴露对大鼠脑线粒体RNA和蛋白质体外合成的影响

本文探讨介质中ATP浓度和急,慢性缺氧暴露对大鼠脑线粒体内RNA和蛋白质合成的影响。用差速离心法分离正常和低压舱模拟4000m高原急性连续缺氧暴露3d和慢性连续缺氧暴露40d大鼠脑线粒体,用体外无细胞（cell-free in vitro)^3H-UTP和^3H-Leucine掺入法分别测定线粒体RNA和蛋白质合成活性,结果显示,大鼠急性缺氧暴露后大脑皮质线粒体RNA体外合成活性降低40%,蛋白质合成活性降低60%;慢性缺氧暴露后线粒体RNA和蛋白质合成活性分别为对照的72%和76%;ATP对正常大鼠脑线粒体RNA以及蛋白质的体外合成活性的影响均呈双相性,大于或小于1mmol/L均可产生不同程度的抑制效应,结果提示,缺氧可在转录和翻译两个水平上影响脑线粒体mtDNA的表达,而慢性缺氧暴露时,线粒体半自主性功能的改善可能是机体对缺氧适应的细胞机制之一;ATP对脑线粒体内转录和释放活性的调节是一种经济有效的反馈调节方式。     

p53通过PKA-Drp1途径诱导肿瘤细胞衰老

正细胞衰老是指细胞进入一种不可逆的增殖阻滞状态,被认为是一种有效的肿瘤抑制机制。很多研究表明,抑癌基因p53在诱导细胞衰老中起着关键作用,但其具体机制尚未完全清楚。最近,一项研究发现在肿瘤细胞中过表达p53可引起细胞衰老和线粒体形态及功能障碍,包括线粒体延伸、膜电位降低、呼吸速率降低和线粒体活性氧(ROS)水平升高;而线粒体选择性和非选择性抗氧化剂均能够通过降低ROS水平来改善由p53所引起的线粒体功能障碍和细胞衰老,但对线粒体延伸无影响。     

α-硫辛酸对缺氧应激肝癌细胞线粒体呼吸率和产能代谢的影响

通过实验阐明抗氧化剂α-硫辛酸（alpha-lipoic acid,α-LA）对肝癌细胞内活性氧具清除作用,并发现其对肝癌细胞和正常肝细胞增殖有不同作用影响。在缺氧条件下,研究使用抗氧化剂干预对肝癌细胞和正常肝细胞缺氧耐受性,线粒体活性和产能代谢的影响及差异。以SMMC-7721人肝癌细胞和L02正常肝细胞作为研究对象,在α-硫辛酸干预条件下检测细胞生长曲线和细胞内ROS;分别在单纯缺氧及加α-硫辛酸缺氧条件下,检测细胞存活率、细胞内ROS、细胞耗氧率、细胞生成ATP和癌基因c-myc mRNA的表达。实验结果说明：缺氧情况下,肝癌细胞通过增加糖酵解途径的产能方式诱导ATP能量代偿能力提高。使用抗氧化剂α-硫辛酸干预清除细胞内过剩ROS,能降低肝癌细胞线粒体呼吸率,并能通过下调c-myc表达抑制肝癌细胞的增殖及降低其缺氧耐受性。     

Iuteolin对糖尿病大鼠心脏功能的保护作用及其可能机制

目的：研究Iuteolin对链脲佐菌素诱导的Ⅰ型糖尿病大鼠心功能及心肌线粒体氧化应激的影响。方法：雄性SD大鼠,随机分成正常对照组,Iuteolin对照纽,糖尿病模型组,低剂量Iuteolin（10ms／（kg·d））灌胃治疗组,高剂量Iuteolin（100ms／（kg·d））灌胃治疗组。各组大鼠饲养8周后,测体重、血糖、心功能、左心室重量、心肌胶原含量及活性氧自由基（ROS）水平,分离心肌线粒体检测ROS水平、超氧化物歧化酶（SOD）活性及线粒体肿胀程度。结果：Iuteolin处理对糖尿病大鼠血糖无明显影响,但可减少糖尿病引起的体重下降。高剂量Iuteolin可显著减小糖尿病大鼠心室与体重比值,提高左室发展压,降低左室舒张末压。高剂量Iuteolin治疗后,糖尿病大鼠心肌ROS及胶原含量。心肌线粒体ROS水平与肿胀程度均明显下降,心肌线粒体SOD活性明显增加。结论：Iuteolin处理可显著改善糖尿病大鼠心功能．其机制可能与减轻心肌线粒体氧化应激及抑制线粒体肿胀有关。     

二氮嗪再灌注处理通过抑制细胞内ROS信号保护心肌细胞

恢复心肌血流量是目前针对急性心肌梗塞的有效治疗方式,但是在心肌再灌注过程中会进一步引起心肌细胞的坏死和调亡。二氮嗪是一种线粒体ATP敏感型钾离子通道开放剂,研究证明二氮嗪预处理具有心肌保护功能。本研究主要探讨二氮嗪再灌注处理是否具有心肌细胞保护作用并探讨其分子机制。以体外培养的H9c2心肌细胞为研究对象,通过联合缺氧模拟在体心肌缺血复灌损伤,检测细胞凋亡、线粒体膜电位、细胞内活性氧及钙离子各项指标的变化。结果发现,与正常组(control)相比,缺血再灌损伤组(ischemia-reperfusion injury,IRI)细胞活性显著下降,细胞凋亡率显著升高,线粒体跨膜电位(MMP)下降,同时细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)和钙离子大量爆发,二氮嗪在这一过程中通过抑制细胞内ROS的增加、保护线粒体膜电位起到心肌细胞保护作用,并且其保护作用与细胞内另一种重要的第二信使钙离子没有直接关系。     

C.elegans中clk-1基因对寿命的影响

clk-1[clock(biological timing)abnormality-1]是泛醌合成所必需的,参与电子传递过程,从而影响线粒体呼吸功能,其突变是已发现的第一个寿命延长的线粒体基因突变。该文通过对线虫表型、线粒体功能的相关检测来研究clk-1突变和clk-1 RNAi(RNA interference)对线虫寿命的影响。结果表明,clk-1突变线虫MQ130寿命延长,线粒体中活性氧类(reactive oxygen species,ROS)水平升高而胞质中ROS水平下降,总ATP含量升高;clk-1 RNAi线虫寿命缩短,线粒体中ROS水平下降而胞质中ROS水平升高,总ATP含量下降。ROS作为细胞的一种信号分子,与线虫的衰老密切相关;ATP是能量代谢的一个重要指标,其含量的升高代表着能量代谢缓慢。由此可见,clk-1突变线虫和clk-1RNAi线虫寿命的差异可能与线粒体和胞质中ROS的不同功能以及能量代谢速率的不同有关。     

线粒体分裂抑制剂Mdivi-1改善血管紧张素Ⅱ介导的内皮功能紊乱（英文）

动力相关蛋白(dynamin-related protein 1,Drp1)与线粒体的动态变化有着密切的联系,是介导线粒体分裂的主要功能蛋白。本研究旨在探讨血管紧张素II(angiotensin II,Ang II)对血管内皮细胞线粒体融合和分裂的影响以及Drp1功能抑制剂Mdivi-1对Ang II介导的内皮损伤是否有减轻作用。Ang II或联合Drp1抑制剂Mdivi-1处理人脐静脉内皮细胞(human umbilical vascular endothelial cells,HUVECs)后,用Western blot检测Drp1、e NOS和凋亡相关酶的蛋白表达,用Mito Tracker Red染色观察细胞内线粒体形态,用JC-1探针染色检测线粒体膜电位变化,用DCFH-DA染色检测细胞活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)生成,用Transwell实验检测细胞迁移情况,用Annexin V/PI染色检测细胞凋亡情况。结果显示,Ang II处理12 h后,HUVECs的Drp1的表达水平显著升高,内皮细胞迁移、凋亡及ROS的生成显著增加,e NOS表达量显著降低;同时,Ang II处理还诱导了线粒体形态的改变,使网状的线粒体变成了短管状,并伴随着线粒体膜电位的下降。Mdivi-1可以显著逆转Ang II对内皮功能的上述损伤作用,提高内皮细胞线粒体膜电位及e NOS的表达量,降低细胞内ROS水平,抑制内皮细胞凋亡及迁移能力。以上结果提示,Drp1抑制剂Mdivi-1可以减轻Ang II介导的内皮损伤。     

雌激素神经保护作用机制:线粒体功能的调节

大量研究表明雌激素具有神经保护作用,但其机制尚不清楚。近年来研究提示,雌激素的神经保护作用与线粒体有着密切联系。线粒体是细胞内能量和活性氧自由基(ROS)的主要来源,对细胞内信号转导、细胞存活与死亡调节等具有十分重要的影响。在生理和病理条件下,雌激素可多方面调节线粒体功能,包括影响ATP与ROS的生成、稳定线粒体膜电位、维护细胞内钙稳态,以及调节线粒体基因和蛋白表达等。本文主要从线粒体角度综述了雌激素神经保护作用及其机制。     

人参皂苷Rg1通过缺氧诱导因子1α促进血管内皮生长因子旁分泌

目的：研究人参中提取的小分子活性物质皂苷Rg1能否促进大鼠骨髓间充质干细胞（marrow—derived mesenchymal stem cells,MSCs）分泌血管内皮生长因子,并进一步探究其作用机制与缺氧诱导因子1α（Hypoxia—induciblefactor,HIF-1）的相关性。方法：用酶联免疫吸附剂测定法（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）观察细胞培养上清中的血管内皮生长因子（vascularen—dothelial growth factor,VEGF）以及蛋白印迹法（western blot）观察细胞中缺氧诱导因子相关蛋白的变化。结果：①通过对照组与人参皂苷Rgl处理组比较发现,1小时前血管内皮生长因子的分泌在两组之间没有明显差异,而在1小时后人参皂苷Rg1处理组相比较于对照组的血管内皮生长因子分泌显著性增加;②进一步实验发现人参皂苷Rgl处理的骨髓问充质干细胞中的HIF—1α在1小时后明显增加,而HIF-1β没有随时间有明显变化。结论：人参皂苷Rgl具有促进骨髓间充质干细胞分泌VEGF的功能,并且发现HIF-1α在这一过程中发挥关键作用,为将来人参皂苷Rgl在临床中的广泛应用提供了重要的理论依据。     

人参皂苷Rg1 通过缺氧诱导因子1α促进血管内皮 生长因子旁分泌

目的：研究人参中提取的小分子活性物质皂苷Rg1 能否促进大鼠骨髓间充质干细胞（marrow-derived mesenchymal stem cells, MSCs）分泌血管内皮生长因子,并进一步探究其作用机制与缺氧诱导因子1α（Hypoxia-inducible factor,HIF-1）的相关性。方 法：用酶联免疫吸附剂测定法（enzyme linked immunosorbent assay, ELISA）观察细胞培养上清中的血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）以及蛋白印迹法（western blot）观察细胞中缺氧诱导因子相关蛋白的变化。结果：①通过对照组与人 参皂苷Rg1处理组比较发现,1 小时前血管内皮生长因子的分泌在两组之间没有明显差异,而在1 小时后人参皂苷Rg1 处理组 相比较于对照组的血管内皮生长因子分泌显著性增加;②进一步实验发现人参皂苷Rg1 处理的骨髓间充质干细胞中的HIF-1α 在1 小时后明显增加,而HIF-1β没有随时间有明显变化。结论：人参皂苷Rg1 具有促进骨髓间充质干细胞分泌VEGF的功能,并 且发现HIF-1α在这一过程中发挥关键作用,为将来人参皂苷Rg1 在临床中的广泛应用提供了重要的理论依据。     

一次性力竭运动对大鼠PHB1表达及线粒体功能的影响

目的：观察一次性力竭运动后大鼠脑、心、骨骼肌组织和线粒体中PHB1含量的变化及对大鼠线粒体功能的影响,探寻PHB1与线粒体功能和能量代谢的关系。方法：健康雄性SD大鼠40只,随机分为2组（n=20）：对照组和一次性力竭运动组,大鼠进行一次性急性跑台运动建立力竭运动模型。收集各组大鼠的心、脑和骨骼肌组织样品并提取线粒体,检测其呼吸功能和ROS的变化。用Western blot方法检测组织和线粒体中PHB1蛋白表达水平;用分光光度计检测各器官中ATP含量以及线粒体中复合体V活性（ATP合酶活性）。结果：①一次性力竭运动后脑、心肌、骨骼肌中ATP含量显著性降低;②一次性力竭运动后脑、心肌、骨骼肌线粒体中复合体V活性、RCR、ROS显著性降低,ST4均显著性升高,ST3无显著性差异。③一次性力竭运动后心、脑、骨骼肌线粒体中PHB1的表达显著性减少。④通过相关性分析得出：一次性力竭运动后心、脑、骨骼肌中ATP含量与心、脑、骨骼肌中复合体V活性呈正相关;心、脑、骨骼肌中ATP含量和心、脑骨骼肌中PHB1的表达呈正相关。结论：一次性力竭运动后,降低线粒体氧化磷酸化功能,使大鼠脑、骨骼肌线粒体内ROS生成增加,PHB1的表达、ATP含量和复合体V活性均下降。一次性力竭运动使得大鼠线粒体内PHB1表达降低,线粒体功能减弱,机体能量代谢降低。     

线粒体功能障碍在缺氧性肺动脉高压中的作用

在肺循环中,线粒体除了发挥典型的代谢作用外,还具有调节氧化还原信号、细胞周期、细胞凋亡以及线粒体质量控制等非典型功能。目前,对线粒体在肺循环中的非典型功能及其响应缺氧的作用机制的研究有限,需要对肺动脉高压的生物学标志物和治疗靶点有更多的了解。阐述了缺氧诱导的活性氧(reactive oxygen species,ROS)产生和细胞内钙离子浓度增加,以及缺氧对丙酮酸脱氢酶激酶和丙酮酸激酶M2型表达的影响,总结了线粒体融合和分裂在肺动脉平滑肌细胞增殖、抗凋亡表型等方面的作用,探讨了缺氧对线粒体活性、细胞行为以及线粒体功能障碍对肺动脉高压进展的影响。深入了解调控线粒体氧化信号、代谢和动态平衡的分子机制对研究和治疗肺动脉高压具有重要意义。     

硫化氢减少缺氧时人脐静脉内皮细胞的凋亡

目的探讨硫化氢对血管内皮细胞缺氧性损伤的保护作用及机制。方法将人脐静脉内皮细胞于2%O_2、5%CO_2、93%N_2培养箱中培养24h,复制缺氧模型。以硫氢化钠(NaHS)作为硫化氢供体,采用DCFH-DA和激光共聚焦系统检测细胞内活性氧含量;用Fura-2/AM和显微荧光成像系统检测细胞质内钙离子([Ca~(2+)]_i)浓度;使用Rh123和激光共聚焦系统检测细胞线粒体膜电位(mitochondria membrane potential,MMP);用Hoechst33342染色观察细胞核形态,计算细胞凋亡率。结果缺氧使细胞ROS含量显著升高,硫氢化钠预处理显著降低缺氧所致ROS含量的升高;缺氧使细胞[Ca~(2+)]_i显著升高,而NaHS、活性氧清除剂NAC、IP_3受体抑制剂Xesto C均抑制缺氧诱导[Ca~(2+)]_i的升高;缺氧显著降低细胞MMP,NaHS、NAC预处理缺氧细胞则抑制。MMP降低;NaHS、Xesto C预处理可显著降低缺氧所致细胞凋亡。结论硫化氢可能一方面通过减轻缺氧时ROS增多引起的线粒体膜电位下降,保护线粒体功能;另一方面抑制缺氧时ROS增多诱导的钙超载,从而减少缺氧时人脐静脉内皮细胞的凋亡。     

UCP2通过p53介导的线粒体动力学调控影响内皮表型

<正>线粒体的主要功能是为细胞呼吸提供场所,产生ATP。除此以外,线粒体还参与了很多生理病理过程,比如细胞凋亡、血红素的合成、Ca平衡调控、炎症以及发育等等。现在有越来越多的研究集中在线粒体的动力学以及线粒体在细胞应对环境刺激中的作用。本文的作者研究了线粒体对内皮细胞增殖功能的影响,他们的研究结果发表在2013年9月13日在线出版的《循环研究》杂志上。文中,作者用血清或VEGF刺激内皮细胞增殖,发现内皮UCP2的表达也是显著增加的。UCP2的增加导致了内皮线粒体     

NADPH氧化酶与ROS信号区域化

最近有关活性氧物质 (ROS)的研究取得了突飞猛进的进展,尤其是其作为第二信使介导了许多生理性与病理性细胞事件,包括细胞分化、过度生长、增殖及凋亡.为了避免ROS的毒性产生特异性的信号转导,ROS的产生与代谢必须被严格调控;其具体的调控机制一直是人们关注的焦点. 最近有关ROS区域化观点的提出解决了这一问题. NADPH是生成ROS的主要来源. 研究发现,NADPH氧化酶及其衍生的ROS存在于机体的多种组织内,且在细胞中呈区域化分布,对细胞内信号的精确调控具有至关重要的作用. NADPH一方面通过小窝/脂筏组装成功能型复合物,从而产生ROS区域化;另一方面,NADPH通过其不同亚细胞定位亚基与各种靶蛋白之间的相互作用,产生ROS特异性. 本文系统综述了NADPH衍生的ROS信号区域化,为进一步理解ROS信号在各种生理或病理过程的分子调控机制提供理论依据.     

氧化应激下p66Shc的调控作用

氧化应激产生的过量活性氧簇（reactive oxygen species,ROS)可通过分子毒性作用或相关信号通路影响相关病理生理学过程. p66Shc是Shc蛋白家族的重要成员之一. 氧化应激下p66Shc能被蛋白激酶Cβ（protein kinase Cβ,PKCβ）、Jun氨基末端激酶（Jun N terminal kinase,JNK）和p53等激活,促进线粒体产生ROS.本文将对氧化应激下p66Shc的作用以及调控其作用的信号转导机制做一综述.     

Pravastatin激活自噬抑制糖皮质激素引起的髓核细胞凋亡

地塞米松注射可以缓解椎间盘退变引起的腰痛症状,但是具有一定的副作用。普伐他汀(Pravastatin)被发现可以缓解骨关节炎的炎症和症状,但是其对髓核细胞及椎间盘退变的作用及其机制尚不清楚。该文培养SD大鼠原代髓核细胞,用不同浓度地塞米松(dexamethasone,DXM)作用髓核细胞48 h后, DCFH-DA和MitoSOX Red染色分析细胞总活性氧(reactive oxygen species, ROS)和线粒体ROS水平, Annexin V/PI流式和DAPI染色分析细胞凋亡水平, N-acetyl-Lcysteine(NAC)抑制ROS水平。Western blot检测LC3-II、Beclin-1和P62等自噬相关蛋白质水平,ATG5 siRNA转染抑制自噬。结果显示,随着DXM处理浓度的增加,髓核细胞内总ROS和线粒体ROS水平及凋亡率升高(P0.05)。Pravastatin增加DXM处理下髓核细胞中LC3-II和Beclin-1蛋白质水平,降低P62蛋白质水平(P0.05)。Pravastatin可以抑制DXM诱导的髓核细胞中的ROS产生和细胞凋亡,而ATG5 siRNA抑制自噬后,显著逆转Pravastatin对细胞的保护作用(P0.05)。该研究结果提示, Pravastatin可能通过激活髓核细胞自噬抑制DXM诱导的ROS产生从而减少细胞凋亡。