H5N1禽流感的威胁与全球应对

当前H5N1禽流感在迁徙禽类、家禽中的暴发,以及越来越多的人感染病例的发生,使流感全球大流行的可能性持续存在。简要综述了H5N1禽流感在鸟类和其他动物中的暴发情况,H5N1禽流感的人感染病例,以及全球禽流感应对计划及疫苗、药物、病原体基础研究的进展。     

欧洲批准新型禽流感疫苗上市

欧洲委员会近日批准了一种新型的应对H5N1型禽流感病毒的疫苗——Prepanddx。这也是首个用来抵御将来可能的禽流感爆发的疫苗。不过欧洲各国政府将怎样使用这种疫苗目前并不清楚。     

A（H1N1）疫苗免疫的血清中和抗体的交叉免疫反应分析

目的分析接种A（H1N1）疫苗人群血清的中和抗体对2009年A（H1N1）的抗病毒作用和相关病毒的交叉免疫保护作用。方法利用MDCK细胞的细胞病变检测接种A（H1N1）疫苗的人血清和未免疫的对照血清对甲型流感病毒A/Brisbane/10/2007（H3N2）,A/Brisbane/59/2007（H1N1）,A/California/07/2009（H1N1）和A/Shenzhen/406H/2006（H5N1）等病毒的中和作用。结果通过细胞病变观察,证实接种A（H1N1）疫苗的人血清稀释度为1∶40时,30份免疫血清可以中和H3N2（Brisbane）,H1N1（Brisbane）和H1N1（CA7）而不产生细胞病变,中和保护率分别均为100%,而相同稀释度的未免疫对照血清的中和保护率分别为100%,100%,40%;而当稀释度为1∶400时,30份免疫血清分别有13,20和21例未出现细胞病变,中和保护率分别为43%,67%,70%,10份对照血清的中和保护率分别为80%,70%,0%。两种稀释度的免疫血清和未免疫对照血清均不能中和H5N1引起细胞病变,中和保护率均为0%。结论接种2009年A（H1N1）疫苗可以诱导能中和CA7 H1N1的抗体产生,但该中和抗体对H3N2（Brisbane）,H1N1（Brisbane）,H5N1（SZ）高致病禽流感病毒等甲型流感病毒无交叉保护作用。     

人用禽流感疫苗1年内有望面世

12月6日在曼谷闭幕的第7届世界卫生组织“世界疫苗研究论坛”透露的信息说，第1种可用于人体的H5N1型高致病性禽流感疫苗有望在1年内面世。     

动态

研发动态我国研制出可应对禽流感疫情的新疫苗哈尔滨兽医研究所国家禽流感实验室研制出一种新型疫苗,在防范鸭瘟病毒的同时,能够阻断H5N1禽流感在鸭子之间的传播。世界粮农组织(FAO)、世界卫生组织(WHO)及世界动物卫生组织(OIE)均认为,该成果能够有效预防和应对H5N1疫情的爆发。     

利用反向遗传学技术构建H5亚型禽流感高产疫苗株

采用RT-PCR技术分别扩增了鹅源高产禽流感病毒的6条内部基因片段,近期分离的H5N1亚型禽流感病毒的血凝素基因以及N3亚型参考毒株的神经氨酸酶基因,分别构建了8个基因的转录与表达载体,利用反向遗传学技术拯救出了全部基因都源于禽源的重组流感病毒疫苗株rH5N3。通过对血凝素蛋白HA1和HA2连接肽处的5个碱性氨基酸(R-R-R-K-K)基因缺失与修饰,从而消除了病毒基因的毒力相关序列,拯救的rH5N3疫苗株对鸡和鸡胚均无致病性,病毒在鸡胚尿囊液和细胞培养上清的HA效价得到极大提高,分别为12048和1512。制备的禽流感疫苗免疫动物后4~5周即可诱导产生高效价的HI抗体,鸡免疫后18周依然保持高水平的HI抗体。重组疫苗不论是对于国内早期分离的禽流感病毒A/Goose/Guangdong/1/96还是近期分离的A/Goose/HLJ/QFY/04都能够产生完全的免疫保护作用,免疫鸡攻毒后不发病、不排毒、不死亡。带有N3鉴别诊断标记禽流感疫苗株的研制为H5N1高致病性禽流感的防治提供了新的技术保障。     

表达A型H5N1血凝素的重组副流感病毒5能使小鼠抵抗高致病性禽流感病毒H5N1的攻击

安全有效的疫苗是阻止高致病性（HPAI）禽流感病毒H5N1在人群中大规模暴发的最好方法。目前FDA批准的H5N1疫苗有明显的局限性,因此,迫切需要更加有效的H5N1疫苗问世。副流感病毒5（PIV5）是一种副黏病毒,在人群中不引起任何疾病,因此是一种可行的疫苗载体。在我们的研究中,用单剂量的表达有来自-H5N1亚型病毒血凝素（HA）的重组活PIV5（rPIV5-H5）免疫小鼠,发现对致死剂量的HPAIH5N1攻击具有免疫作用。另外,我们试验了把H5N1HA插入到PIV5基因组中不同位置对PIV5制成的疫苗有效性的影响。有趣的是,当把H5N1的HA插在前导序列,即PIV5启动子和第一个病毒基因（其编码核蛋白NP）之间时,不能产生有活力的病毒。当把H5N1的HA插在NP和下一个基因V／磷蛋白（V／P）之间时,能引起病毒生长缺陷。当把H5N1的HA插在小疏水基因（SH）和血凝素-神经氨酸酶基因（HN）交界处时,其制成的疫苗对HPAIH5N1有最好的免疫力：在小鼠试验中,只要用1000PFU的剂量便已足够。本研究说明了表达有H5N1HA的重组PIV5有潜力成为HPAIH5N1的候选疫苗。     

人用H5N1禽流感疫苗临床研究进展

H5N1高致病性禽流感病毒传染性强、致死率高,已在世界范围内广泛流传,严重威胁人类的健康与生命。接种流感疫苗是最有效且经济的方法,然而H5N1毒株难以培养收集、疫苗不适用于老人与儿童,且接种繁复,因此人用H5N1禽流感疫苗的制备研究一直是研究热点。从临床研究及应用的角度概述人用H5N1禽流感疫苗的研究现状,着重分析疫苗类型特征、临床试验数据及审批应用情况,为人用禽流感疫苗的研究提供有益帮助。     

我国成功研制新型H5亚型禽流感疫苗

农业部3月11日宣布,具有国际先进水平的新型H5N1亚型禽流感染灭活疫苗和重组禽痘病毒活载体疫苗,由农业部动物流感重点开放实验室及国家禽流感参考实验室研制成功。与现有禽流感疫苗相比,新型灭活疫苗抗原含量高、抗原针对性强,所诱导的保护性抗体水平高,持续期延长2～6个月以上。具有高度生物安全性、生产效率高、免疫效果可靠、使用方便的突出特点,可广泛应用于包括水禽在内的各种禽类H5亚型高致病力禽流感防治。H5亚型禽流感重组禽痘疫苗抗原针对性强,免疫后产生的针对H5亚型禽流感保护性抗体水平可持续6～10个月,大大优于国际同类疫苗…     

高致病性禽流感H5N1疫苗研究获突破

近日,中国科学院上海巴斯德研究所周保罗研究组在高致病性禽流感H5N1疫苗研究中获重要突破,该研究组在世界上首次开发出能诱导出针对所有高致病性禽流感H5N1亚类和亚亚类广谱中和抗体反应的免疫原．同际期刊《病毒学杂志》日前在线发表了这一成果。     

H5N1型禽流感病毒广谱中和单克隆抗体的筛选及其中和机制初步研究

利用杆状病毒-昆虫细胞表达H5N1型禽流感病毒的血凝素蛋白(HA),纯化后的重组蛋白HA免疫小鼠并制备杂交瘤单克隆抗体,用H5N1型禽流感病毒的全病毒进行筛选,成功地获得了抗H5N1型禽流感病毒血凝素蛋白HA的单抗.MDCK细胞微量中和试验表明,单抗8G10D7可对clade2和clade9的H5N1型禽流感病毒起中和作用.Western-blot及血凝抑制实验进一步证明了该单抗的结合位点位于HA蛋白的HA1亚基上.鸡胚感染病毒预防试验结果表明,8G10D7对禽来源的和人来源的H5N1型禽流感病毒均可达到100%的保护率;在治疗试验组中,8G10D7对禽来源的病毒感染具有较高的保护率,可达100%,对人来源的H5N1型禽流感病毒最高也可达87.5%的保护率.该抗体的获得不仅为H5N1型高致病性禽流感病毒的预防和治疗带来了希望,同时其中和位点的发现也为以后亚单位疫苗的研制提供新的思路.     

控制禽流感流行

禽流感病毒在全球好些地方流行,尽管未发现在人之间传染,但接触染病物(如瘟鸡等)可直接传染,染病后造成伤亡,特别禽流感病毒H5N1型有潜在的危险性。WHO高度重视。据称对这种禽流感尚无特效药。当前,防治禽流感病毒除了隔离、灭杂、注射禽流感疫苗之外,还有药物研发的几条途径有     

青海湖鸟岛斑头雁种群对H5N1亚型禽流感病毒的免疫状况

斑头雁（Anser indicus）是2005年青海湖H5N1型高致病性禽流感的主要被感染物种。为了解斑头雁目前对H5N1亚型禽流感病毒(AIV)免疫状况,2008年春季,在青海湖鸟岛采集该种群弃卵（68枚）和巢卵（125枚）,以血凝抑制试验（HI）检测抗H5N1亚型禽流感病毒的卵黄母源抗体（IgY）。根据测试结果推断,在高致病性禽流感暴发3年后,青海湖鸟岛繁殖的斑头雁种群有26.5%～35.2%的繁殖对可能已经获得了对H5N1型禽流感病毒的免疫能力。另外,以斑头雁巢密度和抗体效价进行相关分析发现,斑头雁母源抗体水平与斑头雁巢密度正相关(r=0.736, P=0.000),表明高密度繁殖群内的母源抗体传递更具有适应性意义。     

H7N9禽流感病毒裂解佐剂(MF59)疫苗稳定性研究

目的评价H7N9禽流感病毒裂解佐剂(MF59)疫苗的稳定性。方法采用国内自主构建的重组H7N9禽流感病毒疫苗株毒种制备单价疫苗原液,制备含MF59佐剂的成品疫苗。按照企业注册质量标准进行检定,分别放置于(37±2)℃、(25±2)℃和(5±3)℃环境下,观察不同时间疫苗的稳定性。结果经检定,成品疫苗的外观、装量、无菌检查、异常毒性检测、细菌内毒素含量、渗透压质量摩尔浓度及其他检定项目均符合企业注册质量标准。H7N9禽流感病毒裂解佐剂(MF59)疫苗在(37±2)℃保存3 d、在(25±2)℃保存3个月、在(5±3)℃保存30个月,疫苗各项指标均符合企业注册质量标准。结论 H7N9禽流感病毒裂解佐剂(MF59)疫苗具有良好的稳定性。     

禽流感病毒H5N1血凝素基因和神经氨酸酶基因在大肠杆菌中的表达

目的：克隆、表达和鉴定禽流感病毒H5N1血凝素基因（hemagglutinin,HA）和神经氨酸酶基因（neuramidinase,NA）序列,为制备抗体和基因工程疫苗打下基础。方法：在成功克隆禽流感病毒H5N1全长HA、NA基因并测序的基础上,将部分基因序列克隆到表达载体pET32a（＋）上,全基因序列克隆到表达载体pGEX4T-1上,构建了重组表达质粒pET32a（＋）/HA(49~1587bp)、pET32a（＋）/NA(121~1141bp)、pGEX4T-1/HA、pGEX4T-1/NA,转化大肠杆菌BL21/rosetta,IPTG诱导表达,利用Ni2＋亲和层析柱和GSTra P4B亲和层析柱对重组蛋白进行纯化,并用Western blotting和ELISA方法检测其抗原性。结果：重组蛋白在大肠杆菌中可以高效达,SDS PAGE显示其相对分子质量与预计大小一致,蛋白纯度占总蛋白的90％以上。ELISA和Western blotting实验证实,重组蛋白具有良好的抗原性。结论:成功克隆和表达了禽流感病毒H5N1 HA、NA基因序列,为禽流感病毒H5N1诊断试剂和疫苗的开发等进一步的研究奠定了基础。     

用电穿孔方法研究 H5N1 禽流感病毒DNA 疫苗对动物的免疫保护作用

为了研究 H5N1 DNA 疫苗对小鼠和鸡的保护效率,用 H5N1 禽流感病毒 HA DNA 疫苗免疫 BALB/c 小鼠和 SPF 鸡 . 小鼠和鸡分别经电穿孔和肌肉注射免疫两次,间隔为 3 周 . 二次免疫后,用致死量的同源病毒进行攻毒实验 . 空白对照组在攻毒后全部死亡,而经电穿孔免疫的小鼠和鸡均获得了完全的保护,并能有效地抑制病毒在小鼠肺脏和鸡泄殖腔的繁殖 . 同时,电穿孔免疫的小鼠和鸡均产生了高水平的特异性抗体 . 经电穿孔免疫的小鼠攻毒后 CTL 反应明显加强 . 这些结果表明, HA DNA 疫苗能有效地保护小鼠和鸡对禽流感病毒的感染,同时也表明电穿孔免疫是 DNA 疫苗免疫的有效途径之一 .     

产业动向

“人用禽流感疫苗研制”项目通过验收“人用禽流感疫苗研制”项目近日通过科技部的验收,项目承担单位北京科兴生物制品有限公司和中国疾病预防控制中心已向国家食品药品监督管理局(SFDA)提交了临床研究申请。国务院总理温家宝17日到北京科兴生物制品有限公司,考察了我国人用禽流感疫苗研制的进展情况。参加此次“人用禽流感疫苗研制”的20多位研究人员曾经研制出全球首支进入临床研究,并取得临床成功的SARS疫苗。2004年3月,科兴与中国CDC合作共同启动“人用禽流感疫苗研制项目”,同年5月,科兴从NIBSC得到H5N1疫苗原型株NIBRG-14,1…     

禽流感病毒最新研究进展

本文针对2004年爆发的禽流感疫病,回顾了2004年至2005年期间禽流感病毒的研究进展。逆转录聚合酶链式反应技术为禽流感病毒的分型提供了一种快速、可靠、准确的方法。对H5N1禽流感病毒致病机制的研究发现,其强致病性在于它可以躲避人类抗病毒细胞因子的作用,NS1基因编码蛋白的92位谷氨酸在其中发挥了关键作用。由于禽流感疾病多引起结膜炎,并与病毒细胞受体的研究结果相结合,有科学家认为眼部特异性是禽流感病毒的一个总体特征。社会普遍关注禽流感疫苗的研制,人类和禽类流感A型病毒M2蛋白胞外区域的序列比对工作为疫苗研制提供了一条新的思路,依据神经氨酸酶抑制剂抑制病毒的出芽繁殖原理的疫苗正在研制过程中,而利用siRNA预防和治疗禽流感也是很有潜力的一种方法。禽流感病毒研究的另一个热点是病毒基因节段的重配问题。     

H5N1禽流感病毒环介导等温扩增快速检测方法的建立

目的：建立H5N1禽流感病毒环介导等温扩增（LAMP）快速检测方法。方法：从GenBank中获得H5N1禽流感病毒血凝素（HA）基因序列,应用DNAStar软件MegAlign程序分析其序列,利用PrimerExplorerV3软件在序列保守区域设计LAMP引物,即外引物、内引物和环引物,同时以所克隆的阳性质粒为模板,对试验中的几个重要参数进行优化。结果：LAMP检测方法对H5N1禽流感病毒的灵敏度达到4～6个拷贝,其引物对于H1、H9亚型禽流感病毒和新城疫病毒无非特异性扩增,表现出良好的H5亚型特异性。结论：建立的H5N1禽流感病毒环介导等温扩增快速检测方法灵敏度高、特异性强、重复性好,为快速检测禽流感病毒提供了新方法和新思路。     

上海地区H9N2亚型禽流感病毒的遗传演化分析

为阐明上海地区 H9N2亚型禽流感病毒分离株的遗传变异、分子特征和重组模式,选取2002和2006～2014年分离自活禽市场、家禽养殖场和生猪屠宰场的14株 H9N2亚型禽流感病毒进行分析。这14株病毒分别来源于鸡、鸭、鸽、野鸡咽喉和泄殖腔样品及猪肺脏样品,用 H9亚型荧光反转录‐聚合酶链反应（RT‐PCR）试剂盒检测后,阳性样品经无特定病原体（SPF）级鸡胚尿囊腔接种并分离病毒,用血凝抑制（HI）实验进一步确定其血凝素（HA）亚型。RT‐PCR分别扩增这14株病毒全基因并进行序列测定,分析8个基因片段的遗传发生关系,发现这些分离株主要由 F／98亚系、Y280亚系、G1亚系及未知亚系重组而成。根据8个基因片段的组合情况,这14株病毒可分成5个基因型。2002、2006～2008年分离的5株H9N2亚型禽流感病毒代表了4个不同基因型,2009～2014年分离的9株H9N2亚型禽流感病毒属第5种基因型,推测可能与疫苗免疫选择压力有关。因此,在以后工作中加强H9N2亚型禽流感分子流行病学监测是非常必要的。