分枝杆菌HGMS2中类固醇C20-羟基脱氢酶的鉴定

分枝杆菌常被用作甾体药物中间体生产菌种,然而当前人们对其具体的甾醇降解机制仍然不是很清楚。为了获得C20-羟基甾药中间体,文章直接以RS为底物进行了转化,并通过对转化产物进行TLC、HPLC、LS-MS和核磁分析,初步确定分枝杆菌中存在类固醇C20-羟基脱氢酶（1DHC）参与的代谢途径。同时,基于生物信息学和结构生物学,通过序列和结构比对分析,最终从分枝杆菌中鉴定出了一个与类固醇C20-羟基脱氢酶同源性很高的基因。将该基因在大肠杆菌中异源表达,并对其功能活性进行分析,证明该基因所编码的酶和类固醇C20-羟基脱氢酶具有相同的功能活性。文章首次从分枝杆菌中鉴定出一种类固醇C20-羟基脱氢酶,使研究者对分枝杆菌甾醇代谢机制有了更深入的理解,同时也为新型甾药中间体的制备以及分枝杆菌的改造奠定了理论基础。     

犁头霉11α-羟基化制备16β-甲基-11α，17α，21 三羟基孕甾-1，4 二烯 3，20 二酮

选育到一株对16β-甲基-17α,21-二羟基孕甾-1,4-二烯3,20-二酮(Ⅱa)11α-羟基化活性强的犁头霉A28菌株,并发现底物21乙酰化(Ⅱb)可明显提高11α-羟基化的能力。在适宜的转化条件下,Ⅱb投料浓度0.5%,产物16β-甲基-11α,17α,21-三羟基孕甾-1,4-二烯3,20-二酮(Ⅲ)收率为73%,结构经波谱分析确认。     

山羊胎儿肝脏3β—羟基甾体脱氢酶／Δ^4—Δ^5异构酶（3β—HSD）cDNA的克隆

3β－羟基甾体脱氢酶／Δ^4-Δ^5异构酶（3β－HSD）是哺乳动物体内广泛存在的一类参与甾体激素代谢的氧化还原酶,且具有异构酶活性。3β－HSD催化3β－羟基甾体的脱氢及随后的Δ^5-3-甾酮产物的异构化反应,以产生α,β－非饱和酮,3β－HSD在甾体激素代谢中起着重要作用。本文以胎羊肝为材料,首次获得了山羊胎肝的3β－HSD的cDNA,并进行了3β－HSD在肝脏组织的表达分析。参照牛,啮齿类的3β－HSD CDNA的高同源区设计引物,以2－3月雌性胎羊肝脏mRNA为模板,经RT－PCR获得416 bp cDNA片段（Fig.a),然后以其为探针筛选胎羊肝λgt10cDNA文库最后获得3－端缺失的3β－HSD cDNA克隆,并推导了其氨基酸序列（Fig.s)。同源分析表明山羊胎肝3β－HSD的氨基酸序列与牛卵巢,人I型3β－HSD的同源性分别为96％,78％和73％（Fig.3),提取雌性胎羊,雄性胎羊及母体羊肝脏的总RNA,同时做RT－PCR,表明3β－HSD在不同个体肝脏中的表达存在差异,雌性胎羊和母体孕羊肝脏中都有3β－HSD的表达,而在雄性胎羊肝脏中,则未检测到表达信号（Fig.4)。     

犁头霉11α-羟基化制备16β-甲基-11α,17α,21-三羟基孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮

选育到一株对16β-甲基,17α,21-二羟基孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮(Ⅱa)11α-羟基化活性强的犁头霉A28菌株,并发现底物21-乙酰化(Ⅱb)可明显提高11α-羟基化的能力.在适宜的转化条件下,Ⅱb投料浓度0.5%,产物16β-甲基-11α,11α,21-三羟基孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮(Ⅲ)收率为73%,结构经波谱分析确认.     

Δ5-3β,7β-二羟基甾醇及其C-7差向异构体波谱特征及胆碱酯酶的抑制活性

本文对Δ5-3β,7β-二羟基甾醇(1~3)和Δ5-3β,7α-二羟基甾醇(4~6)的一些核磁共振波谱特征进行了比较。活性测试表明化合物1~6对乙酰胆碱酯酶(AChE)无明显的抑制活性,对丁酰胆碱酯酶(BuChE)则有较强的抑制活性,其中24-亚甲基胆甾-5-烯-3β,7α-二醇(6)的IC50值为9.5μM。通过活性数据比较我们发现7α-羟基甾醇对丁酰胆碱酯酶的抑制活性明显比相应的7β-羟基甾醇高。我们通过计算7位羟基和四环平面之间的二面角角度来尝试解释这些活性差别。     

3β-羟基类固醇脱氢酶基因的克隆表达及其性质研究

目的:构建3β-羟基类固醇脱氢酶(3β-HSD)异源表达系统,进一步探究其酶学性质。方法:通过分子生物学方法克隆来源于Mycobacterium neoaurum菌株的3β-羟基类固醇基因,构建重组质粒,运用HPLC方法检测酶反应体系的产物。结果:本实验构建了表达载体pet28a-hsd。优化诱导表达条件,发现3β-HSD异源表达的最适温度为16℃~25℃,37℃时蛋白表达为包涵体。此外,同一温度下不同IPTG浓度诱导的表达结果差异不大。利用纯化后的蛋白进行酶特性的研究,结果表明在3β-HSD酶反应体系中,30℃达到较高的酶活性;pH 7.5~9.0之间,酶活力较强,pH低于7.0时,酶活性明显下降;有机助溶剂DMSO对酶反应有抑制作用;Fe~(3+)和Cu~(2+)对酶反应有抑制作用。结论:本实验探究了分枝杆菌中3β-羟基类固醇脱氢酶的相关性质,为进一步研究该酶在类固醇代谢中的功能提供基础。     

增产菊胺酯对小鼠睾丸间质细胞-氧化氮合酶和3β-羟基甾体脱氢酶影响的酶组织化学研究

本文用ＮＡＤＰＨ－黄递酶法研究了ＮＯＳ在小鼠睾丸的分布与活性,用ＮＢＴ法研究了３β－ＨＳＤＨ的活性,以探讨新型植物生长调节剂增产菊胺酯的生殖毒作用机理。光镜观察和图像分析表明,ＮＯＳ主要存在于睾丸间质细胞,而支持细胞和生精细胞未见或仅见弱阳性反应产物。进一步观察表明,随着剂量的增加,ＮＯＳ和３β－ＨＳＤＨ活性均明显减弱,睾丸内睾酮含量也随之减少。结果提示,增产菊胺酯可能由此而引起生殖功能的损伤     

△^5—3β，7β-二羟基甾醇及其C-7差向异构体波谱特征及胆碱酯酶的抑制活性

本文对△^5-3β,7β-二羟基甾醇（1—3）和△^5-3β,7α-二羟基甾醇（4～6）的一些核磁共振波谱特征进行了比较。活性测试表明化合物1—6对乙酰胆碱酯酶（AChE）无明显的抑制活性,对丁酰胆碱酯酶（BuChE）则有较强的抑制活性,其中24-亚甲基胆甾-5-烯-3β,7α-二醇（6）的IC50值为9．5μM。通过活性数据比较我们发现7α-羟基甾醇对丁酰胆碱酯酶的抑制活性明显比相应的7β-羟基甾醇高。我们通过计算7位羟基和四环平面之间的二面角角度来尝试解释这些活性差别。     

新月弯孢霉AS 3.4381对新型甾体底物C11β-羟基化

应用本实验室保藏的新月弯孢霉Curvularia lunataAS 3.4381对新型甾体化合物(Ⅰ)(16α,17β-二甲基-17-丙酰基雄甾-1,4-二烯-3-酮)作为底物进行生物转化C11β-羟基化反应的研究。实验研究结果表明,采用Ⅱ级发酵的工艺,收获新月弯孢霉菌丝体作为生物催化剂,在磷酸缓冲液介质体系中,对化合物Ⅰ的C11位实现β羟基化,生成皮质激素药物。测试数据TLC,MS,IR及1H NMR证明了该产物的化学结构,表明生物转化产物为C11β-羟基-16α,17β-二甲基-17-丙酰基雄甾-1,4-二烯-3-酮。     

L-酪氨酸对大鼠黄体细胞3p-羟-甾体脱氢酶活性的影响

目的：研究L-酪氨酸对离体培养大鼠黄体细胞3β-HSD活性的影响。方法：运用细胞培养技术和放射免疫分析法,观察不同剂量L-酪氨酸对大鼠黄体细胞3β-HSD活性的影响和L-酪氨酸及其类似物酪氨酰肼在拮抗hCG诱导孕酮生成作用中,3β-HSD活性的变化。结果：①0．2mmol^-1和2．0mmol^-1的L酪氨酸明显抑制3β-HSD的活性,相同浓度的L-苯丙氨酸及L-广多巴胺对此酶活性无影响;②在底物浓度较低时,L-酪氨酸可显著增强3β-HSD活性,随着底物浓度的增加,L-酪氨酸的作用逐渐减弱并转为抑制作用。③L-酪氨酸及酪氨酰胼对hCG诱导的3β-HSD活性有明显的抑制作用。结论：L-酪氨酸可明显影响大鼠黄体细胞3β-HSD活性,其作用性质与底物浓度密切相关。L-酪氨酸及酪氯酰肼抑制hCG诱导的3β-HSD活性。     

黑曲霉催化雄甾-4-烯-3,17-二酮16β-羟基化

为进一步确定黑曲霉菌株TCCC41650的生物转化能力,以雄甾-4-烯-3,17-二酮(Androstenedione)为底物,利用黑曲霉菌株TCCC41650进行催化,产物经纯化、重结晶后,通过单晶衍射鉴定为16β-羟基雄甾-4-烯-3,17-二酮。转化条件为:培养液pH 6.0,乙醇添加量为2%,投料浓度为1‰时,72 h转化率为85.8%。目前甾体研究领域对于C16β-羟基化的微生物转化未见报道,研究结果为C16β-羟基甾体药物的研发奠定了基础。     

3-甾酮-1-脱氢酶基因的表达及甾体转化分析

本文利用带有P43启动子的表达分泌载体pWB980,实现了简单节杆菌3-甾酮-1-脱氢酶在枯草芽孢杆菌中的表达,表达出的目的蛋白的分子量为55KDa。利用分光光度法检测得到胞内和胞外可溶性部分的酶活分别为110±0.5mU和15±0.6mU每毫克蛋白, 比出发菌株简单节杆菌提高了将近30倍。重组芽孢杆菌对甾体底物4-AD的转化率为45.3％,比出发菌株简单节杆菌提高了近10倍。利用枯草芽孢杆菌对甾体底物进行脱氢为甾体药物的生产开辟了一个新的途径。     

β-环糊精对甾体微生物羟化反应的影响

考察了β-环糊精(β-cyclodextrin, CD)对雄甾-4-烯-3,17-二酮(androst-4-ene-3,17-diorle,AD)在水中的溶解度及微生物对其11а羟化反应的影响,结果表明β-环糊精能显著提高底物AD在发酵培养基中的溶解度,增溶效果优于有机溶剂.在底物投料浓度0.2%(w/v)时,与4%无...     

甾体化合物RSA的11β-羟基化反应

原生质体在甾体中的应用起始于Ｄｌｕｇｏｎｓｋｉ在 1984年采用Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍｅｌｌａｅｌｅｇａｎｓ转化可的松龙 ( 17α ,2 1 二羟基孕甾 4 烯 3 ,2 0 二酮 )和Ｈｙｐｈｏｄｅｒｍａｒｏｓｅｕｍ转化 6α 氟 可的松龙 16,17 醋酸酯 ( 6α Ｆｌｕ 17α ,2 1 二羟基孕甾 4 烯 3 ,2 0 二酮 16,17 醋酸酯 ) ,发现原生质体具有甾体转化能力[1 ,2 ] 。Ｓｅｄｌａｃｚｅｋ进一步采用等重的原生质体和菌丝体进行比较 ,原生质体的羟基化能力较后者提高了 3倍 ,表现出很高的转化能力[3] ,从而引起人们的关注。随后展开了有关原生质…     

葡枝根霉NG0305酶催化甾体C11α-羟基化的研究

应用本实验室保藏的葡枝根霉Rhizopus stolonifer NG0305对甾体化合物烯睾丙内酯(3-oxo-4,6-diene-Pregna-17-aloha-hydroxy-21-carboxylic acid gama-lactone)进行酶催化C11α-羟基化反应的研究。研究结果表明,菌体培养的碳源供应对菌体所产羟化酶的活力有重要影响。采用葡萄糖和淀粉组合碳源,并加入适量的黑曲霉糖化酶的方式,解决了葡萄糖抑制的问题,并缩短了菌体培养反应时间,得到高羟化转化率。酶转化反应88h后,提取吸附在菌丝球内的产物,应用液相色谱测定,结果表明C11α-羟基化转化率达到了53．0％。     

微生物合成11α-羟基-16α,17α-环氧孕酮的动力学

对耐温黑根霉菌丝体催化16α,17-α-氧孕酮生成11α-羟基-16α,17α-环氧孕酮的反应体系进行了研究,考察了不同反应时间、不同菌体量和底物质量浓度对11α-羟化反应的影响,建立了相应的动力学模型,其方程为r=0.031Sr/1.05＋Sr。结果表明：提高菌体质量浓度有利于提高反应速率;底物浓度与反应初速率的关系与米氏方程相似。     

甾体C7-羟基化研究进展

生物羟基化被用作研究甾体代谢机制和制备羟基甾体的工具,许多真菌微生物菌具有甾体C7-羟基化能力,而C7-羟基甾体具有许多重要的生物活性。在分子水平上,人们已经发现了7α-羟基化酶及其基因。就以上几个方面做一简单综述,并对此领域的发展趋势进行展望。     

表达3-甾酮-△1-脱氢酶降解植物甾醇合成雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮

构建分枝杆菌表达载体pMTac并在分枝杆菌Mycobacterium neoaurum JC-12中加强表达甾醇降解过程中的关键酶3-甾酮-△1-脱氢酶(KSDD)以提高雄甾-1,4-二烯-3,17-二铜(ADD)的产量。将p MF41的启动子pACE替换成tac启动子构建载体pMTac,在分枝杆菌中分别表达报告基因绿色荧光蛋白(GFP)和关键酶KSDD,通过GFP亮度和KSDD酶活验证tac启动子在M.neoaurum JC-12中的效果,并发酵验证加强表达KSDD对产物ADD的影响。荧光显微照片表明两个载体均能在M.neoaurum JC-12表达GFP,但tac启动子的效果比pACE强。酶活测定结果为重组菌M.neoaurum JC-12/pMTac-ksdd破碎细胞上清液中KSDD酶活比原始菌提高了6.53倍,比M.neoaurum JC-12/pMF41-ksdd提高了4.36倍。摇瓶发酵显示重组菌M.neoaurum JC-12/pMTac-ksdd ADD的产量比原始菌提高了22.2%,由4.86 g/L提高到5.94 g/L,而AD的产量由0.92 g/L减少到0.17 g/L,降低了81.5%;与M.neoaurum JC-12/p MF41-ksdd比,ADD产量提高了12.7%,AD降低了71.2%。以20 g/L植物甾醇为底物,5 L发酵罐中重组菌M.neoaurum JC-12/pMTac-ksdd的ADD产量达到10.28 g/L。结果表明,构建的新型表达载体pMTac适用于在M.neoaurum JC-12中加强表达关键酶KSDD,而且在M.neoaurum JC-12中过量表达KSDD有助于ADD产量的提高,为目前报道的发酵法利用新金色分枝杆菌降解植物甾醇合成ADD的最高水平。