一株减毒百日咳鲍特菌的构建及生物学特性分析

百日咳是传染性强、感染率高的急性呼吸道传染病,主要感染婴幼儿,是婴儿死亡的主要原因之一。百日咳鲍特菌（Bordetella pertussis）是引起百日咳的最主要病原菌。近年来世界各地多次出现百日咳暴发,迫切需研制更加有效的新型百日咳疫苗。本研究构建了一株减毒百日咳活疫苗BPTM1,利用同源重组方法敲除编码百日咳鲍特菌主要毒力因子百日咳毒素（pertussis toxin,PTX）和皮肤坏死毒素（dermonecrotic toxin,DNT）的基因,并用大肠埃希菌的同源基因置换了负责气管细胞毒素（tracheal cytotoxin,TCT）转运的基因ampG。通过聚合酶链反应验证了毒素及相关基因的敲除和置换,蛋白免疫印迹法检测表明PTX的S1亚基未表达。体外生长曲线和体内定植曲线均表明,相比于野生型百日咳鲍特菌BPMM,减毒BPTM1的生长和定植能力未受影响,其所致肺部病理效应减轻,而所诱导的百日咳鲍特菌特异性IgG、IgG1、IgG2a抗体保持高水平。本研究表明,减毒百日咳鲍特菌BPTM1有可能成为百日咳疫苗的候选疫苗。     

rOmpF和OMVs亚单位疫苗可有效预防家禽感染肠炎沙门菌

正肠炎血清型沙门菌仍然是人类沙门菌感染病最常见的血清型,可通过受污染的食品(特别是家禽产品)感染人体。研制肠炎沙门菌亚单位疫苗不仅可以保护鸡免受沙门菌感染,还能切断沙门菌传染源。本研究分别以重组表达的外膜蛋白F (rOmpF)和提取的外膜囊泡(OMVs)制备了两种肠炎沙门菌亚单位疫苗,并在鸡中进行了肠炎沙门菌攻毒试验。结果显示,制备的亚单位疫苗不仅能诱导鸡体内产生抗体,还能引起较强的细胞免疫应答。     

百日咳鲍特菌菌毛蛋白纯化方法的建立及免疫原性的初步评价

目的建立一种适合生产放大的百日咳鲍特菌菌毛蛋白(fimbriae, Fim)纯化新工艺,并对其免疫原性进行初步评价。方法百日咳黏附素(pertactin, PRN)流穿液经一步盐析和一步复合型阴离子Capto Adhere疏水层析流穿法进行纯化,以纯度和回收率为检测指标,对硫酸铵盐析质量体积比和疏水离子层析条件进行优化,进行连续3批生产验证工艺稳定性。检验精纯Fim蛋白毒性,将合格Fim蛋白与百日咳其他组分配伍成五组分无细胞百日咳疫苗(acellular component pertussis vaccine, acPV),免疫小鼠,评价免疫原性。结果成功建立了从PRN流穿液中纯化Fim蛋白的方法。该工艺制备的3批Fim蛋白纯度(95%)高,回收率均在60%以上,具有良好的重复性,且Fim蛋白符合特异性毒性试验要求。5μg Fim蛋白免疫小鼠后在7、28、35和42 d血清中的抗Fim抗体几何平均滴度(geometric mean titer, GMT)分别为10.6、97.7、102.9、192.6 IU/mL,与生理盐水组相比具有统计学差异(P0.05)。结论利用QbD理念建立了适合生产放大的百日咳鲍特菌菌毛蛋白纯化新工艺,且蛋白具有良好的免疫原性,未来有望作为组分百日咳疫苗的候选抗原。     

福氏志贺氏2a及Y变种保护性抗原的研究

福氏志贺菌Y变种曾经作为一种痢疾疫苗的候选株,其特有的抗原结构在疫苗的有效性抗原研究中起主要作用。以Y变种毒株与无毒株、野生型F2a株与T32株及失去Ⅱ型抗原结构的T32-1株之间分别进行了各种毒力表型的检测、四种外膜侵袭蛋白表达、菌株的外膜蛋白提取物(OMPs)分析、质粒DNA图谱和小鼠主动免疫、被动保护试验的对比分析,了解其抗原特性。结果显示：细菌外膜蛋白抗原和具有完整型特异性抗原结构的福氏菌LPS在动物机体免疫中都发挥着重要的作用。这些抗原物质的共同存在似乎能达到更好的免疫效果。     

鸭疫里默氏杆菌外膜蛋白生物学特性研究

血清2型鸭疫里默氏杆菌强毒菌株体外传200代获得了无毒力无免疫原性菌株,采用超声波裂解和超速离心法提取二株菌的外膜蛋白, 以比较分析鸭疫里默氏杆菌外膜蛋白的生物学特性。电镜观察细菌超微结构显示传代菌株外膜膜密度降低, 外膜泡的数量明显减少, 细胞质不均匀、内有空泡产生;免疫印迹结果表明二株菌的外膜蛋白免疫原性多肽存在明显区别;原代菌株的外膜蛋白仅与2型RA抗体出现特异性凝集, 而传代菌株的外膜蛋白与 1、2、10与11型RA抗体均出现凝集;二株菌的外膜蛋白均可诱导雏鸭产生抗体, 但原代菌株外膜蛋白诱导雏鸭产生抗体滴度显著高于200代次菌株;原代菌株外膜蛋白免疫鸭对同源RA菌株的攻击可产生100%的免疫保护, 而传代菌株外膜蛋白免疫鸭对同源RA菌株的攻击不产生免疫保护。序列分析显示两者的外膜蛋白A同源性达到99.9%。结果表明强毒菌株的外膜蛋白为良好的亚单位疫苗候选, 体外连续传代对RA外膜蛋白生物学特性影响显著。     

鸭疫里默氏杆菌外膜蛋白生物学特性研究

血清2型鸭疫里默氏杆菌强毒菌株体外传200代获得了无毒力无免疫原性菌株,采用超声波裂解和超速离心法提取二株菌的外膜蛋白, 以比较分析鸭疫里默氏杆菌外膜蛋白的生物学特性。电镜观察细菌超微结构显示传代菌株外膜膜密度降低, 外膜泡的数量明显减少, 细胞质不均匀、内有空泡产生;免疫印迹结果表明二株菌的外膜蛋白免疫原性多肽存在明显区别;原代菌株的外膜蛋白仅与2型RA抗体出现特异性凝集, 而传代菌株的外膜蛋白与 1、2、10与11型RA抗体均出现凝集;二株菌的外膜蛋白均可诱导雏鸭产生抗体, 但原代菌株外膜蛋白诱导雏鸭产生抗体滴度显著高于200代次菌株;原代菌株外膜蛋白免疫鸭对同源RA菌株的攻击可产生100%的免疫保护, 而传代菌株外膜蛋白免疫鸭对同源RA菌株的攻击不产生免疫保护。序列分析显示两者的外膜蛋白A同源性达到99.9%。结果表明强毒菌株的外膜蛋白为良好的亚单位疫苗候选, 体外连续传代对RA外膜蛋白生物学特性影响显著。     

抗艾滋病分泌型重组BCG疫苗的研究进展

抗艾滋病分泌型重组ＢＣＧ疫苗,是一种含有分泌融合蛋白质的牛分枝杆菌ＢＣＧ菌的疫苗。融合蛋白质是由外来抗原肽（艾滋病毒表面抗原肽）插入含有信号肽的载体蛋白（抗酸菌的α抗原）分子表面得到的。该疫苗能有效地诱导杀伤Ｔ细胞,显著提高抗体水平,用于艾滋病的预防和治疗。     

百日咳杆菌69KD外膜蛋白的研究进展

<正>百日咳是由百日咳杆菌引起的一种急性呼吸道传染病,严重威胁婴幼儿健康,对它的控制迄今主要依赖于菌苗预防。目前认为,百日咳杆菌有许多生活学活性成份,包括白细胞增多促进因子(LPF)[又称百日咳毒素(PT)]、丝状血凝素(FHA)、腺苷酸环化酶(AC)、外膜蛋白、脂多糖、不耐热毒素等。其中LPF、FHA、69KD外膜蛋白作为保护性抗原成份,是目前国内外学者研究的热点。     

肠道沙门氏菌O-抗原多糖的研究进展

O-抗原是由多糖重复单元组成的多聚糖,表达于细菌的外膜,具有多样性,是划分沙门菌血清型的重要依据。O-抗原多糖由多基因协同作用而合成,这些基因在沙门菌基因组上成簇存在,形成O-抗原基因簇。O-抗原多糖也是重要的毒力因子,在沙门菌入侵宿主、体内存活、定殖等致病过程中均发挥着重要的作用。此外,O-抗原还是沙门菌主要的保护性抗原,能激发宿主产生高水平抗体并发挥免疫保护作用,成为疫苗研究的靶点。本文综述O-抗原多糖的基因结构和合成、生物学功能及其在疫苗研制中的应用与前景。     

脑膜炎球菌疫苗血清学评价的相关研究进展

研究证明,脑膜炎球菌荚膜多糖、多糖蛋白结合物以及外膜蛋白等物质都能够诱导产生抗体,帮助保护机体抵御脑膜炎球菌疾病。阐述了脑膜炎球菌疫苗研制过程中特异性抗体的检测方法以及在疫苗效果评价中的意义,指出在脑膜炎球菌疫苗的效果评价中,抗体含量以及功能性抗体活性的检测是重要指标,为疫苗的市场应用提供了依据。     

新型百日咳疫苗研究进展

百日咳(whooping cough)是一种由百日咳鲍特菌(Bordetella pertussis)感染所引起的急性呼吸道传染病,严重时可导致婴幼儿死亡。近年来百日咳的复发流行表明,百日咳的防控效果不理想,现有疫苗的保护力衰减是其重要的原因,亟需研发新型百日咳疫苗。现从不同研发角度对加强免疫、提高产能和优化工艺以及对全细胞百日咳疫苗(whole-cell pertussis vaccine,w P)、无细胞百日咳疫苗(acellular pertussis vaccine,a P)的改进,新抗原来源形式、应用新运送系统、新佐剂的新型百日咳疫苗作一概述。     

细菌荚膜多糖的抵御对抗微生物多肽的作用[英]／Campos MA…／／Infect Imman．

天然免疫系统在机体抵抗微生物的过程中起到重要作用,抗微生物多肽和蛋白(antimicrobial peptides and proteins,AP)是这一系统中的重要防御物质。AP具有多种活性,可抵御革兰阴性和阳性细菌、真菌和一些包膜病毒的致病作用。革兰阴性菌能发生一系列变化来抵抗AP的活性。如大肠埃希菌等可拥有1种外膜蛋白OmpT,能分解蛋白质以清除AP;又如淋病奈瑟菌和小肠结肠炎耶尔森菌可依赖能量将AP泵出细胞外。     

细菌菌蜕作为新颖药物递送体系的研究进展

细菌菌蜕是革兰氏阴性菌被噬菌体PhiX174的裂解基因E裂解后形成的完整细菌空壳.由于它具有完整的细菌表面抗原结构,所以它能直接作为疫苗使用.利用基因工程手段,可以非常便利地将外源抗原蛋白插入菌蜕的内膜、外膜或周质等多个部位,构建重组菌蜕多价疫苗.目前,菌蜕作为新颖的药物递送体系也开始受到关注.利用菌蜕可以递送DNA和蛋白质疫苗以及其他药物,能较好地产生免疫反应和治疗作用.     

抗百日咳毒素单克隆抗体及其应用研究进展

疫苗是预防百日咳(pertussis)的最有效措施,但无细胞百日咳疫苗接种后免疫力的迅速衰退是近年来百日咳发病率上升的原因之一。百日咳毒素(pertussis toxin, PT)是由百日咳鲍特菌(Bordetella pertussis)分泌的主要毒力因子,具有多种生物学活性。在无细胞百日咳疫苗设计初期,为确保疫苗的有效性,抗PT的单克隆抗体(单抗)常被用来检测PT表面重要的抗原表位。研究表明,与天然PT特异性结合的部分单抗无法识别经化学方法脱毒后的PT,提示化学脱毒会改变疫苗中PT的一些抗原表位,进而影响疫苗保护效果。现结合单抗可用来研究抗体干扰PT功能的分子机制,对机体在感染百日咳后的保护性免疫机制进行综述,以期为无细胞百日咳疫苗的进一步改进及开发人源化抗PT单抗治疗百日咳提供科学依据。     

嗜水气单胞菌外膜蛋白基因ompTS的高效表达及其免疫原性

根据嗜水气单胞菌外膜蛋白基因ompTS的核苷酸序列设计引物,运用聚合酶链式反应（PCR）扩增出与预期大小相符的基因片段。将此基因片段克隆至质粒pRSET A的BamHI和EcoRI位点,构建重组质粒,转化大肠杆菌BL21（DE3）,经IPTG诱导获得高效表达,SDS－PAGE蛋白电泳表明在39．9kD处出现超强特异带,占总蛋白的51％。以Ni-NTA-Conjugate抗体进行Western blot分析证明该39．9kD的蛋白为所表达的融合蛋白。纯化融合蛋白注射雄性新西兰大白兔可诱导产生特异抗体。ELISA和Western blot检测结果显示,该抗体与表达的融合蛋白和从嗜水气单胞菌中提取的36．9kD外膜蛋白均呈阳性反应,表明所表达的融合蛋白仍保持原有外膜蛋白的免疫原性,为此融合蛋白作为 疫苗的候选成份提供理论基础。     

问号钩端螺旋体疫苗候选基因LB061的抗原性和保守性研究

目的 克隆表达和鉴定问号钩端螺旋体黄疸出血群赖型赖株中疫苗候选基因LB061,研究LB061的免疫原性和在不同血清型钩端螺旋体菌中的保守性。方法 生物信息学软件分析预测LB061的特征。构建原核表达质粒pQE31-LB061,经IPTG诱导后用SDS-PAGE及Western印迹法鉴定表达情况。用表达的重组蛋白免疫BALB/c小鼠,Western印迹法检测其抗原性和在不同血清型钩端螺旋体中的保守性。Western印迹法检测钩端螺旋体全菌兔抗血清中的LB061抗体。结果 生物信息学预测结果显示,LB061含有DUF839家族结构域。成功克隆了重组质粒pQE31-LB061,表达的重组蛋白能刺激BALB/c小鼠产生抗体(效价为1∶32000),并能与相应抗体反应,具有良好的抗原性。在16株不同血清型的钩端螺旋体中均可检测到LB061蛋白的表达,并在钩端螺旋体赖株全菌兔抗血清中检测到其抗体。结论 LB061蛋白可以作为外膜蛋白刺激宿主免疫系统产生抗体,具有良好的抗原性和保守性。本研究为其作为疫苗候选基因的研究奠定了基础。     

细菌菌影作为新型疫苗和递送载体的研究进展

细菌菌影（bacterial ghost,BG）是革兰阴性菌在噬菌体PhiX174的裂解基因E的作用下形成不含核酸、核糖体等胞质内容物的细菌空壳。这种细菌空壳保留了与天然细菌一样的完整外膜结构,且不具有活菌样的致病作用,可作为疫苗无需佐剂就能诱导机体产生体液免疫应答和细胞免疫应答。菌影内部及外膜上可装载DNA、抗原和药物等异源物质,易被机体免疫细胞识别捕获,使其成为一种新型的生物递送载体。另外,菌影具有制备简单,易于保存等优点。细菌菌影在疾病预防和治疗方面具有广阔的应用前景。     

百日咳免疫保护相关机制及评价指标的研究进展

百日咳是目前世界上普遍采用疫苗可进行免疫预防策略的疾病之一。近十年来包括中国在内的许多国家出现的百日咳发病率上升的现象已引起了全球极大关注。其主要原因可能与疫苗接种尤其是无细胞百日咳疫苗(acellular pertussis vaccine, APV)诱导产生的免疫力不断衰减有关。血清中的抗百日咳毒素特异性IgG抗体检测是最重要的免疫力评价方法之一,但到目前为止,感染百日咳菌或接种百日咳疫苗后的免疫力保护相关机制及评价指标尚无统一的标准。现就国内外百日咳相关研究进展作一概述。     

HIV—1 env基因在鸡痘病毒中表达的研究

HIV是Alffi的主要病原,其env基因编码的病毒粒子外膜蛋白gpl60可被宿本细胞蛋白分解酶修饰加工成膜表面蛋白（gP120）和穿胰蛋白（MI）。gP160上含有多个HfV感染的中和部位,已证明envgP160和gP120能诱导机体产生中和抗体和CYL反应,成为基因工程疫苗研究的重点。我舍已完成鸡瘟病毒（FI,v）282M株基因组BamHI片段的克隆和分析。本实验即是利用核病的TK和B片段,插入痘苗病毒P7．5多个串联的启动干和牛瘟病毒A型包涵体（ATI）的晚期启动手的复合启动子,以beZ做报告基因,构建IZ个命名为puTA—Zf－16L和PuBA－7－16L的载…     

肺炎克雷伯菌五种外膜蛋白研究进展

细菌的外膜蛋白是一种常见的毒力因子,同时也是控制抗菌药物进入细菌体内的重要通道.近年来,随着肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae,KP)毒性和耐药性的增强,受感染人群和感染率逐年增长.为了减少感染,多采取诸如制备相关抗耐药菌药物、蛋白疫苗等预防治疗措施.该文主要针对肺炎克雷伯菌五种重要的外膜蛋白Om...