中华蜜蜂DNA甲基化转移酶Dnmt3基因克隆及表达谱分析

为探究中华蜜蜂Apis cerana cerana的DNA甲基化模式, 本研究采用RT PCR技术克隆了中华蜜蜂DNA甲基化转移酶3（Dnmt3）基因(GenBank登录号为JQ740768); 采用荧光定量PCR检测不同发育时期工蜂（4日龄蛹, 1, 7和30日龄成年蜂及产卵工蜂）和蜂王（4日龄蛹, 1日龄蜂王和产卵蜂王）头部的Dnmt3基因mRNA的表达量。结果表明： 该基因cDNA序列全长2 277 bp, 编码758个氨基酸残基, 预测的蛋白分子量为88.24 kD, 等电点为7.85。将中华蜜蜂与其他物种的Dnmt3基因的结构域进行比对, 同时将该基因推导的氨基酸序列与其他物种的Dnmt3氨基酸序列进行同源性比对和系统发育分析, 发现与西方蜜蜂的Dnmt3序列一致性高达99%。该基因在工蜂和蜂王不同发育时期均有表达, 1日龄工蜂与7日龄工蜂中没有显著差异(P>0.05), 30日龄工蜂中的表达量显著高于前两者 (P<0.05); 蜂王蛹中的表达量显著高于工蜂蛹 (P<0.05); 1日龄的蜂王中的表达量显著高于1日龄的工蜂(P<0.05); 产卵工蜂与产卵蜂王中的表达量没有差异（P>0.05）。这种表达情况提示其可能与工蜂劳动分工及蜜蜂卵巢发育有关。     

中华蜜蜂Orco嗅觉受体基因的克隆、表达及亚细胞定位

【目的】克隆鉴定中华蜜蜂Apis cerana cerana的Orco嗅觉受体基因, 并对其在工蜂触角上进行免疫荧光定位。【方法】利用RT-PCR技术克隆中华蜜蜂Orco基因, 并对其编码的氨基酸序列进行生物信息学分析, 使用Real-time PCR技术鉴定其在中华蜜蜂不同发育时期及不同组织的表达谱; 利用免疫荧光定位技术在中华蜜蜂工蜂触角中对Orco进行亚细胞定位。【结果】获得中华蜜蜂Orco基因的全长cDNA序列, 命名为AcerOrco (GenBank登录号： JF968610.1), 其全长为1 434 bp, 编码477个氨基酸, 预测其含7个跨膜结构以及4个位于细胞膜外的亲水区。表达谱分析显示, AcerOrco在卵、 幼虫和蛹期呈低丰度表达, 1日龄及内勤蜂时期主要在触角和足中表达, 且在1日龄的触角中表达量最高; 采集蜂时期的触角、 头(去除触角)、 胸、 腹和翅中均有较高丰度的表达。亚细胞定位结果显示, AcerOrco不仅在采集蜂触角鞭节上大量表达（尤其在触角鞭节第1亚节中表达量较高）, 而且常成对出现, 并且发现AcerOrco可能主要在触角毛形感器的外部神经元(outer dendrite, OD)以及板形感器的树突神经元中表达。【结论】成功克隆了AcerOrco基因全长, 获得了其表达谱, 且将其定位于工蜂采集蜂的触角感器神经元上, 最终推测AcerOrco与中蜂嗅觉发育和触角感器功能密切相关。     

中华蜜蜂mab-21基因序列分析及表达特征

【目的】探究中华蜜蜂 Apis cerana cerana Male abnomal 21（mab-21）基因在不同发育阶段的表达特性及染螨条件下mab-21基因表达变化规律。【方法】本研究利用RT-PCR方法,克隆了中华蜜蜂mab-21的基因编码区;采用荧光定量PCR方法检测了中华蜜蜂mab-21在不同发育时期（新出房蜂、哺育蜂、守卫蜂及采集蜂）工蜂头部中mRNA的表达量以及接种大蜂螨 Varroa destructor 前后mab-21基因的表达变化。【结果】克隆获得中华蜜蜂mab-21 cDNA,命名为 Accmab 21（GenBank登录号KR000001）。序列分析显示, 该编码区开放阅读框长为1 098 bp,编码365个氨基酸,推测的编码蛋白的相对分子量和等电点分别为41.63 kD和8.53。系统发育分析表明中华蜜蜂mab-21与西方蜜蜂 Apis mellifera mab-21、小蜜蜂Apis florea mab-21和熊蜂Bombus impatiens mab-21聚成一支。该基因在中华蜜蜂工蜂的不同发育时期均有表达,其中哺育蜂阶段显著高于新出房蜂、守卫蜂和采集蜂(P<0.05)。接种大蜂螨后,哺育蜂和守卫蜂中mab-21基因的表达下降显著(P<0.05);而在新出房蜂和采集蜂中表达量变化不显著。【结论】该基因可能与中华蜜蜂抗螨行为相关。     

中华蜜蜂气味结合蛋白基因OBP4的分子特性及时空表达

气味结合蛋白OBPs在蜜蜂识别气味分子和生理反应的过程中起到了十分重要的作用。本研究通过利用生物信息学软件预测分析中华蜜蜂Apis cerana cerana气味结合蛋白基因OBP4(AcerOBP4)编码的蛋白理化特性和结构特征;采用MEGA 5.2软件中的邻位相连法(Neighbor-joining, NJ)构建AcerOBP4及其它昆虫OBPs的系统发育树;通过qRT-PCR技术分析AcerOBP4在中华蜜蜂的哺育蜂、采集蜂和1日龄工蜂各组织的表达情况。结果表明,中华蜜蜂和意大利蜜蜂Apis melliferaOBP4(AmelOBP4)氨基酸同源性为78%,AcerOBP4在中华蜜蜂的触角表达量最高,其次是足和头部组织表明该基因与蜜蜂的嗅觉行为密切相关。此外,AcerOBP4在蜜蜂脑部有一定的表达,但是在腹部组织表达量很低。该研究结果丰富了蜜蜂OBPs表达特性的研究数据,同时也为继续深入研究OBP4在中华蜜蜂中是否影响嗅觉行为提供了基础。     

中华蜜蜂感觉神经元膜蛋白基因克隆、组织表达分析及原核表达

为明确中华蜜蜂Apis cerana cerana嗅觉形成中重要功能因子的信号转导通路, 本研究利用RT-PCR方法, 克隆了中华蜜蜂感觉神经元膜蛋白 (sensory neuron membrane protein, SNMP) 基因编码区, GenBank登录号为KC012595, 命名为AccSNMP1。序列分析表明, 该编码区开放阅读框长1 563 bp, 编码520个氨基酸, 推测的编码蛋白的相对分子量和等电点分别为58.02 kD和5.83。同源性比较发现, 中华蜜蜂AccSNMP1与其他昆虫感觉神经元膜蛋白基因同源性差异很大, 在氨基酸水平上与西方蜜蜂Apis mellifera SNMP基因一致性达99.2%, 与熊蜂Bombus impatiens SNMP基因一致性达90.9%, 而与赤拟谷盗Tribolium castaneum SNMP基因一致性仅为22.7%。系统发育树显示中华蜜蜂与西方蜜蜂遗传距离最近。实时荧光定量PCR结果分析表明, AccSNMP1在触角中表达量最高, 在足中表达量较高, 与胸、 腹、 头（去除触角和喙）、 喙中表达量相比差异显著（P<0.05）。构建原核表达载体pEASY-E1-AccSNMP1, 经IPTG诱导, 中华蜜蜂感觉神经元膜蛋白在大肠杆菌Escherichia coli BL21 （DE3）中高效表达。结果为进一步研究AccSNMP1在中华蜜蜂体内的作用机理奠定了基础。     

Molecular characterization and immunohistochemical localization of a mitogen-activated protein kinase, Accp38b, from Apis cerana cerana

The p38 mitogen-activated protein kinase (MAPK) is involved in various processes, including stress responses, development, and differentiation. However, little information on p38 MAPK in insects is available. In this study, a p38 MAPK gene, Accp38b, was isolated from Apis cerana cerana and characterized. The quantitative real-time PCR (Q-PCR) analysis revealed that Accp38b was induced by multiple stressors. Notably, the expression of Accp38b was relatively higher in the pupae phase than in other developmental phases. During the pupae phase, Accp38b expression was higher in the thorax than in the head and abdomen and higher in the fat body than in the muscle and midgut. Immunohistochemisty showed significant positive staining of Accp38b in sections from the brain, eyes, fat body, and midgut of A. cerana cerana. These results suggest that Accp38b may play a crucial role in stress responses and have multiple aspects function during development.     

中华蜜蜂Malvolio基因 Acmvl 的克隆及组织表达分析

【目的】本研究克隆了中华蜜蜂Apis cerana cerana Malvolio (Mvl)基因的cDNA序列,分析了其编码蛋白的结构特点,并探讨其mRNA在内勤蜂、采蜜蜂和采粉蜂各部位组织中的表达差异,以期为该基因的生物学功能研究提供参考。【方法】利用RT-PCR技术从中华蜜蜂内勤蜂头部组织中扩增和克隆获得Acmvl的全长序列,并采用多种生物信息学软件分析Acmvl蛋白的结构特征;采用Real-time PCR对中华蜜蜂Acmvl在内勤蜂、采蜜蜂和采粉蜂各组织中的表达特征进行分析。【结果】Acmvl基因cDNA全长为2 130 bp（GenBank登录号：KP662686）,编码587个氨基酸,预测该蛋白分子量为65.86 kD,等电点为6.03,无信号肽,存在11个跨膜结构域、9个糖基化位点和14个潜在磷酸化位点;系统发育树分析结果显示,中华蜜蜂Acmvl与其他膜翅目昆虫Malvolio聚为一支,与小鼠Mus musculus和人Homo sapiens Nramp家族的Nramp2聚为另一大分支,且与小鼠、水稻 Oryza sativa 、黑腹果蝇 Drosophila melanogaster 和酵母Saccharomyces cerevisiae的Nramp家族同源体在跨膜区、跨膜区带电残基及转运蛋白特征结构域上有很高的保守性,尤其是与Nramp2。Acmvl 基因在中华蜜蜂各部位组织中均有表达,但高表达于内勤蜂的胸部及采蜜蜂和采粉蜂的腹部和足部,提示该基因表达的差异影响采集行为。【结论】Acmvl 属于Nramp基因家族,可能为Nramp2的同源基因,该基因影响采集行为可能与转运Cu²⁺, Mn²⁺和Fe²⁺（尤其是Fe²⁺）有关。     

中华蜜蜂蕈形体的发育

中华蜜蜂(Apis cerana cerana)的脑由前脑、中脑和后脑三部分构成,蕈形体位于前脑的背侧,是其重要的学习及其他复杂行为的整合中心。通过对中华蜜蜂工蜂的幼虫、蛹及成虫的蕈形体形态发育的观察研究,发现中华蜜蜂的蕈形体包含约1000个成神经细胞,它们最终形成了蕈形体的所有Kenyon细胞。这些成神经细胞来自于在新孵化的幼虫脑中已存在的四丛成神经细胞,每一丛细胞的数量不多于45个。蕈形体柄区的出现约在3龄幼虫,而α叶和β叶在5龄幼虫已可明显辨认。冠区出现较晚,大约在蛹期的第二天以后。由于社会性昆虫复杂的学习、记忆和认知需求,其蕈形体的体积和复杂程度都优于其他昆虫。     

中华蜜蜂ZFP37基因的生物信息学分析及高温下表达特性的研究

锌指蛋白(Zinc finger proteins, ZFPs)是一类在真核生物体内广泛分布的蛋白质。锌指蛋白作为一类转录因子,它能够调控基因的表达和细胞的分化,最近的研究显示其在动植物抗逆方面也发挥着重要作用。本研究对中华蜜蜂Apis cerana cerana ZFP37的蛋白结构进行了预测分析,并通过qRT-PCR分析了中华蜜蜂在遭受高温胁迫时ZFP37的表达情况,进一步了解锌指蛋白在中华蜜蜂应对热胁迫过程中的作用。结果显示,中华蜜蜂ZFP37可编码123个氨基酸,蛋白分子量为13.7 kDa,无跨膜结构。氨基酸同源序列比对结果表明,中华蜜蜂ZFP37序列与蜜蜂科昆虫的相似性最高,与其他膜翅目昆虫的相似性存在差异。基因的表达模式显示,ZFP37在高温下表达升高,此外,胁迫时间的增加也可导致ZFP37表达的升高。这些结果表明ZFP37对于中华蜜蜂应对热应激有重要的生物学意义。     

囊状幼虫病病毒侵染对中华蜜蜂营养和免疫反应的影响

【目的】囊状幼虫病病毒(sacbrood virus, SBV)是严重危害中华蜜蜂Apis cerana cerana蜂群健康和种群数量的病原微生物,但其对蜜蜂的致死机制不明。本研究旨在探究SBV对不同发育阶段中华蜜蜂营养代谢和免疫的影响。【方法】分别给中华蜜蜂2日龄幼虫和新羽化成虫饲喂SBV,逐日统计死亡蜜蜂数量,检测病毒对蜜蜂存活的影响;利用qPCR检测中华蜜蜂4日龄幼虫、预蛹以及10和20日龄成虫体内SBV RNA、营养代谢基因(ilp1, ilp2, hex110, hex70b, hex70c和vg)、先天性病毒免疫基因(rel, toll, apidaecin, abaecin, defensin, hymenoptaecin, jra, key和state92e)、细胞凋亡基因(atg7和LOC100577876)和抗RNA病毒基因(dis3和dicer)的表达水平。【结果】 SBV感染显著降低了中华蜜蜂幼虫的存活率,但对成虫的生存影响不明显。SBV RNA在中华蜜蜂4日龄幼虫和预蛹体内的表达量显著高于其在10和20日龄成虫体内的表达量。SBV显著降低了中华蜜蜂幼虫营养代谢基因ilp1, ilp2, hex110, hex70b和hex70c以及成虫营养代谢基因vg和hex110的表达量,但显著提高了4日龄幼虫rel, toll, apidaecin, abaecin, defensin, hymenoptaecin和jra以及成虫key和 state92e等先天性病毒免疫基因的表达量,还引起预蛹体内的细胞凋亡基因atg7和LOC100577876的表达量显著增加。【结论】SBV在中华蜜蜂幼虫和预蛹体内的感染水平远高于在成虫体内的,其对幼虫的危害也大于对成虫。SBV显著影响了中华蜜蜂正常的营养代谢,染毒中华蜜蜂能够提高自身的免疫水平来应对;预蛹期中华蜜蜂幼虫细胞凋亡水平的显著增加可能与化蛹异常及死亡有关。     

中华蜜蜂气味结合蛋白AcerOBP14的表达及配体结合特性分析

[目的]气味结合蛋白(odorant binding proteins,OBPs)在昆虫寄主定位、产卵地选择等行为中发挥着重要作用,明确中华蜜蜂Apis cerana cerana AcerOBP14与配体的结合特性有助于阐明中华蜜蜂嗅觉识别的分子机制.[方法]通过qRT-PCR测定OBP14在20日龄中华蜜蜂成年工蜂...     

中华蜜蜂气味受体基因AcOr170的克隆与序列分析

本研究采用自行设计的引物对中华蜜蜂Apis cerana cerana雄蜂触角中气味受体基因(Odorant receptors 170)Ac Or170的c DNA序列进行了克隆和序列分析,以探寻中华蜜蜂雄蜂气味受体Ac Or170基因在近缘种昆虫间的进化差异。结果表明:中华蜜蜂雄蜂气味受体基因Ac Or170的c DNA序列总长度为1356 bp,编码区序列长度为1188 bp,共编码396个氨基酸,其分子量为46.272 k Da,等电点8.96,Genbank登录号:KX264359。结构域的分析结果显示,该蛋白具有7tm-6一个保守结构域。经序列比对后发现,Or170的序列在中华蜜蜂、西方蜜蜂和大蜜蜂间的亲缘性很近。     

Molecular characterization,immunohistochemical localization and expression of a ribosomal protein L17 gene from Apis cerana cerana

Ribosomal protein L17 (RPL17) is a core protein of the large (60S) ribosomal subunit and plays an important role in protein synthesis. In this report, a RPL17 gene was isolated from Apis cerana cerana, designated as AccRPL17. Alignment analysis showed that AccRPL17 exhibits high homology to other known RPL17s. Moreover, genomic sequence analysis revealed that five exons are splitted by four introns, and the position of the first intron is comparatively conservative, being localized in the 5′ untranslated region. Partial putative cis‐acting elements related to development were also examined. Quantitative real‐time PCR showed that the highest mRNA level was detected in larvae on the fifth day. Simultaneously, immunohistochemical localization showed that AccRPL17 is primarily concentrated in muscular tissues, stigma, body wall, and the surrounding of the eye in the fifth‐instar larvae. Further studies suggested that AccRPL17 might be involved in responses to abiotic stresses. This is a report attempting to analyze the expression and distribution of RPL17 in A. cerana cerana. These results indicated that AccRPL17 might play an important role in insect development, and the importance of AccRPL17 in participating in abiotic stresses is discussed. © 2010 Wiley Periodicals, Inc.     

中华蜜蜂dynactin p62基因的克隆及不同发育阶段表达分析

为探究中华蜜蜂Apis cerana cerana dynactin p62基因的表达特性, 本研究克隆了中华蜜蜂dynactin p62的基因组DNA序列(GenBank登录号： JX101463) 和mRNA序列（GenBank登录号： JX101464）; 采用荧光定量PCR检测了中华蜜蜂dynactin p62在不同发育时期（3日龄和6日龄幼虫、 刚羽化出房蜜蜂）三型蜂中mRNA的表达量。结果表明： 该基因基因组DNA序列全长为2 403 bp, mRNA序列全长为1 491 bp, 编码496个氨基酸残基, 预测的蛋白分子量为56.49 kD, 等电点为8.31。系统发育分析表明中华蜜蜂dynactin p62与西方蜜蜂Apis mellifera dynactin p62聚成一支。该基因在不同发育时期均有表达, 在雌性蜜蜂（蜂王和工蜂）中, 刚羽化成虫期的表达量显著高于幼虫期(P<0.05), 并且同一发育时期相比, 工蜂的表达量显著高于蜂王(P<0.05); 而该基因在雄蜂中表达量没有明显的规律性。这些结果提示该基因可能与中华蜜蜂级型分化有关。     

羽化和性成熟时中华蜜蜂蜂王和雄蜂转录组分析

【目的】为了系统了解中华蜜蜂Apis cerana cerana蜂王和雄蜂转录组特征,丰富蜜蜂转录组数据信息。【方法】本研究利用高通量测序的方法分别检测中华蜜蜂蜂王和雄蜂刚出房、性成熟时期以及性成熟期蜂王生殖系统和雄蜂生殖系统之间转录组表达差异。【结果】经过测序获得质量值不低于20的碱基比例（Q20）均高于90%;所有reads组装成90 839个unigenes,平均长度1 549 bp;基于5个数据库(NR,Swiss Prot,GO,COG和KEGG)进行比对,共有45 112个unigenes被注释。差异基因表达分析发现,与刚出房时相比,性成熟的蜂王和雄蜂均在表皮蛋白、细胞色素P450、气味结合蛋白等家族基因上存在显著差异表达,而且这些差异表达基因与蜜蜂生长发育和性成熟过程中蜜蜂骨骼发育、生殖系统发育、嗅觉发育等方面有关;性成熟蜂王与性成熟雄蜂之间以及它们生殖系统之间在气味结合蛋白基因方面存在显著差异。【结论】结果表明,中华蜜蜂在性成熟过程中,体内大量基因的表达发生了变化。这些结果揭示了中华蜜蜂性成熟发育的整体基因表达特征,在得到大量转录组unigene序列的同时,获得了一批与蜜蜂性成熟有关的基因序列,为深入开展中华蜜蜂生长发育与繁殖研究提供了丰富的数据资源。     

中华蜜蜂工蜂蕈形体胚后发育中神经胶质的形成模式

本研究通过形态解剖、免疫组织化学等技术,对中华蜜蜂Apis cerana cerana工蜂蕈形体胚后发育中神经胶质的形成过程进行了比较研究。结果表明：蕈形体中神经胶质增殖的高峰期集中在幼虫发育末期到蛹发育早期;在工蜂蕈形体的蕈体冠、蕈体柄以及小叶的发育过程中,神经胶质细胞往往先于神经纤维网出现在特定的区域,引导神经纤维网的形成。它们一方面规定了神经纤维网的边界和区域,为神经纤维网提供内部的分隔;另一方面也为神经纤维的移动提供特定的“路标"和靶向。与神经纤维网相关联的神经胶质的数量的持续增加,除了神经胶质的分裂增殖外,还有一部分来自于外部细胞体层的神经胶质的迁入。     

中华蜜蜂视觉系统中神经胶质的组成和胚后发育

神经胶质作为视觉系统的重要成分之一, 对视觉系统的发育及功能起着重要的作用。本研究通过组织解剖观察、 免疫组织化学等技术, 对中华蜜蜂Apis cerana cerana幼虫和蛹的视觉系统中神经胶质的类型和发育过程进行了比较研究。研究表明： 在中华蜜蜂视觉系统中, 根据神经胶质的位置和形态主要分为表面神经胶质、 皮层神经胶质和神经纤维网神经胶质3种类型; 神经胶质主要来源于视柄和视叶中的神经胶质前体中心; 神经胶质细胞数量的增加一方面来自于细胞的迁移, 另一方面来自于神经胶质细胞自身的分裂增殖。本研究为昆虫神经胶质的发育以及功能研究提供理论基础。     

中华蜜蜂mrjp1 cDNA的克隆及其序列分析

构建中华蜜蜂(Apis cerana cerana)8日龄工蜂头部cDNA文库,利用中蜂基因组的mrjp3部分基因片段作为杂交探针,采用DIG标记筛选cDNA文库,获得mrjps阳性克隆120个;对阳性克隆进行PCR扩增和测序,通过NCBI的BLAST序列比对,获得12个与印度蜂(Apis cerana india)、西方蜜蜂(Apis mellifera L.)mrjp1基因同源的中蜂mtjp1 cDNA片段,并进一步对中华蜜蜂mrjp1的cDNA全序列进行测定和分析。序列比对分析表明,东方蜜蜂(Apis cerana)与西方蜜蜂mrjp1的cDNA序列相似性为93．78％,中华蜜蜂与印度蜂的相似性高达99．36％,这一结果从分子水平证实中华蜜蜂与印度蜂有较近的共同祖先,而东方蜜蜂与西方蜜蜂的亲缘关系较远。