筛选在非生长条件下突变体酶的新方法

利用双层平板筛选由定向进化方法产生的瑞氏木霉内切葡聚糖酶Ⅲ（EGⅢ）突变体库,根据水解圈在平权上形成的速度判断酶活高低。采用这种方法在不同的筛选条件下分别筛选得到了几株在低温或碱性条件下高活性的EGⅢ突变体。比色法测定的酶活性与平板筛选结果一致。该方法的建议将使通过定向进货方法改造现有蛋白质,获得具有新的优良性状的工业用酶的途径得到更加广泛的应用。     

高通量筛选工具的设计与应用

定向进化方法作为新兴的高效蛋白质工程手段,其内容包括蛋白质突变体文库的构建和有效突变体的快速筛选。高通量筛选方法是定向进化方法的重要组成部分,是成功获得有效突变体的关键。筛选的突变体数量越多,获得有效突变体的几率越大。以下介绍了目前已经成功应用于或有潜力应用于定向进化改造蛋白质的几种高通量筛选工具。高通量筛选工具的不断设计与开发将推动蛋白质工程领域的技术革新。     

D-泛解酸内酯水解酶的定向进化

易错PCR结合DNA改组方法向D-泛解酸内酯水解酶基因中引入突变,并构建突变体库。利用酶的催化特点和产物特性建立了基于平板初筛和高效液相复筛的两步法D-泛解酸内酯水解酶活性筛选系统。用该筛选系统以酶活力和pH稳定性为指标对突变体库进行筛选,最终获得一株酶活力高且在低pH条件下稳定性好的突变体Mut E-861。该突变体的酶活力是野生型酶的5.5倍。对突变体和野生型酶在pH 6.0和pH 5.0条件下的残余酶活进行对比,在这两种pH条件下,突变体酶的酶活残留分别为75%和50%,而野生型酶只能保持原来的40%和20%。通过软件对突变体Mut E-861酶基因和野生型酶基因进行分析对比,发现突变体Mut E-861酶基因发生了三处点突变,其中突变使两处氨基酸取代,另一处为沉默突变,未引起氨基酸的变化。     

耐热植酸酶突变体的筛选及性质研究

目的:对大肠杆菌Escherichia coli植酸酶基因进行定向进化,获得热稳定性提高的植酸酶突变体.方法:利用易错PCR技术和96微孔板高通量筛选方法获得突变体基因,并对突变酶进行异源表达、纯化及性质研究.结果:通过筛选获得3株热稳定性明显提高的植酸酶突变体APPA1、APPA2、APPA3.酶学性质分析结果表明,...     

大肠杆菌BL21(DE3)中定向进化突变体库构建的方法比较

定向进化的突变体库建立是定向进化是否成功的关键因素,只有建立足够大的库容才有可能筛选到合适的突变体。然而用来做定向进化的宿主菌的转化效率并不总是那么高,难以达到建库要求。而且在以常规分子克隆方法做连接转化时,耗时长,效率低等问题也影响了突变体库的建立,高效的克隆转化方法是定向进化所需求的。本文以大肠杆菌BL21(DE3)为转化宿主菌,挑选了一种新的高效的克隆转化方法,与现在实验室常规克隆转化方法进行了比较,证明了PCR多聚质粒的克隆转化方法在定向进化突变体库构建中的优势。为定向进化突变体库的构建提供了新的高效可靠的技术方法。     

定向进化细胞色素P450BM-3的研究

以来自于巨大芽孢杆菌的细胞色素P450BM-3为研究对象,采用随机突变和饱和定点突变定向进化技术对P450BM-3进行改造,通过突变体催化靛蓝显色的特性采用活性琼脂平板分析和96微孔板相结合的高通量筛选成功获得了几个具有更高催化性能的突变体。     

基于磷脂酶水解圈定向筛选高效聚对苯二甲酸乙二醇酯降解酶

【目的】目前自然环境中聚对苯二甲酸乙二醇酯(polyethylene terephthalate, PET)废弃物的积累严重威胁生态健康,因此PET的降解问题已成为全球性的热点问题。生物酶法降解PET技术以其绿色环保而备受关注,但天然PET降解酶的催化活性普遍偏低,亟待进一步定向改造。现阶段定向进化为快速提高PET降解酶催化性能提供了可能,其中筛选方法是成功获得高性能突变体的关键所在。本研究旨在提出一种新型高效灵敏的筛选方法并应用于褐色喜热裂孢菌(Thermobifida fusca)来源角质酶Tfu-0883的定向改造,以期快速获得PET降解活性提高的突变体。【方法】基于易错PCR构建突变体文库,涂布于卵黄磷脂平板,以水解圈的大小作为筛选指标获得PET降解活性提高的突变体;对突变体进行酶学定性并筛选出潜在的分子改造位点,最终获得高性能突变体。【结果】从卵黄磷脂平板中挑取水解圈直径最大的单菌落,即突变体H10(N2D/D94H/A149E),其PET降解能力是野生型的1.5倍,最适温度与pH分别为60℃和8.0。突变体H10中第2位和第149位氨基酸残基远离底物结合凹槽,其突变会导致酶蛋白稳定性下降;第94位氨基酸残基则位于底物结合凹槽附近,由负电荷氨基酸Asp突变为正电荷氨基酸His,有利于吸附在带负电荷的PET表面,是突变体H10降解能力提升的关键因素;随后将野生型的第94位氨基酸残基Asp分别突变为His及同为正电荷且空间位阻更小的Lys和Arg,突变体D94H、D94K和D94R对PET降解能力均有提升,其中,突变体D94K降解PET能力是野生型的3.6倍。【结论】本研究基于磷脂酶水解圈构建了一种新的PET降解酶定向筛选方法,以此获得了降解活性提高的突变体,并证实角质酶Tfu-0883第94位氨基酸残基位点具有提升其PET降解活性的潜在能力。     

基于分子结构与生物信息学等多维度特征的定向进化改造甲基对硫磷水解酶

甲基对硫磷水解酶作为环境友好绿色催化剂,可降解甲基对硫磷等在土壤中残留的有机磷农药,这使得如何提高甲基对硫磷水解酶的水解效率成为酶工程中备受关注的问题。基于分子结构与生物信息学等多维度特征,确定了催化活性中心周围的9个关键位点。构建了一个含1 500个突变体的筛选文库,进行定向进化。经过两轮筛选,最终确定2株催化效率提高的突变体,L258V和L273M。其催化效率常数kcat/Km值分别为134.1(mmol/L)-1·s-1和166.5(mmol/L)-1·s-1,与野生酶相比较分别提高了27.3%和58.1%。这种通过半理性设计构建定向进化文库的方法,不仅有效的提高了甲基对硫磷水解酶的筛选效率,更为酶的改造提供了新的思路。     

易错PCR法提高土芽孢杆菌ZH1羧酸酯酶的热稳定性

摘要:【目的】对土芽孢杆菌(Geobacillus sp.) ZH1的羧酸酯酶基因进行定向进化,筛选得到酶热稳定性提高的突变酶。【方法】利用易错PCR技术向羧酸酯酶基因中随机引入突变,建立酶基因突变文库,筛选获得热稳定性提高的突变体,并对突变酶进行诱导表达、纯化及部分酶学性质研究。【结果】通过筛选,获得羧酸酯酶热稳定性提高的突变菌株65。序列分析表明,突变酯酶65有2个氨基酸发生了改变,包括T113S和M160K。突变酶的三维结构模拟显示,突变T113S位于酶分子的第5个β-折叠上;突变M160K处在酶分子第5个和第6个α-螺旋之间的环结构上,位于酶分子表面,突变后的Lys160与邻近的Thr162形成一个额外氢键。在90 ℃下,突变酶65和亲本酶的半衰期分别为3.1 h 和1.9 h,表明筛选到的突变酶65比亲本酶的热稳定性好。【结论】基于易错PCR技术对Geobacillus sp．ZH1羧酸酯酶的热稳定性进行了定向进化,对改善酶的性质、扩大酯酶的应用范围,以及研究酯酶的结构与功能的关系具有重要意义。     

蛋白质定向进化技术的研究进展

蛋白质定向进化技术是蛋白质分子改造的一个重要策略.重点介绍了易错PCR、DNA改组等对编码蛋白质的基因进行随机突变和重组的技术,以及构建突变体库和高通量筛选的方法,并探讨了定向进化技术在蛋白质工程中的应用及前景.     

亚硝酸钠体外随机突变枯草杆菌纤溶酶基因及其产物性质研究

通过对目的基因随机突变,希望获得纤溶酶活性提高的突变体。方法:采用一种简单方便的突变方法--亚硝酸钠直接突变含目的基因的质粒,然后转化受体菌获得突变体。在亚硝酸钠浓度为40mmol／L,温度为37℃,反应时间为1h条件下,突变带枯草杆菌纤溶酶基因的质粒pUBH,转化受体菌DB403,得到大量突变体。随机挑取约1600个转化子,用纤维平板法筛选。结果:获得酶活不同程度改变的突变体,其中有纤溶酶活性增加高达一倍的突变体;分离纯化了活性最高的突变酶,并证明其活性提高是与比活性提高相关的;序列分析该突变体发现碱基发生8处改变,而氨基酸只发生1处改变即V298A;和序列分析一致,SDS／PAGE和Westernblot检测结果显示其分子量和抗原性质没有改变。同时研究了诱变剂浓度、反应温度和作用时间对随机突变的影响。     

定向进化提高嗜热拟青霉J18耐热β-1,3-1,4-葡聚糖酶在酸性条件下的催化能力

应用定向进化技术提高了嗜热拟青霉Paecilomyces thermophila J18耐热β-1,3-1,4-葡聚糖酶(PtLic16A)在酸性条件下的催化能力.结合易错PCR和DNA改组的方法,构建了β-葡聚糖酶的突变体文库;利用刚果红染色法建立了阳性克隆的高通量筛选体系.筛选得到的突变酶PtLic 16AM1的反应最适pH由7.0变化至5.5,且保持了原有的耐热性和比酶活.突变酶的DNA序列中有4个点位发生突变,引发了4处氨基酸替换,分别是T58S、Y110N、G195E和D221G.结构模拟结果显示,发生突变的4个氨基酸位点中,Y110N位置靠近酶活性中心,而T58S、G195E和D221G则离酶活性中心较远,其中T58S、G195E可能对酶最适pH的变化起到了关键作用.     

同源基因拼接技术在酶体外进化中的应用

同源基因拼接技术是一种全新概念的酶人工定向进化策略,本文在介绍这一技术基本概念的基础上,主要对该技术的两个关键环节;突变体基因库的构建以及高通量的重组子筛选手段进行详细论述,最后对该技术在酶改性中的应用研究进展进行综述,并对其发展前景及存在问题进行评述。     

定向进化提高来源于Arthrobacter ramosus的MTHase的热稳定性

麦芽寡糖基海藻糖水解酶(maltosyltrehalose hydrolase,MTHase)是以淀粉或麦芽糊精为底物制备海藻糖的关键酶之一。来源于Arthrobacter ramosus的MTHase,表达量好,比活高,但热稳定性差,限制了其工业化应用。采用定向进化技术,筛选得到L137M和A216T两个突变体,在60℃下,野生型和两个突变体的半衰期(t1/2)分别为15.5、20.5和23.3 min,L137M和A216T的t1/2分别比野生型提高1.3和1.5倍。进一步考察了L137M、A216T和野生型酶在60℃分别和同样来源于Arthrobacter ramosus的麦芽寡糖基海藻糖合成酶(maltosyltrehalose synthase,MTSase)复配制备海藻糖,在相同的加酶量下,野生型、L137M和A216T的海藻糖转化率分别为51.3%,52.6%和55.7%,两个突变体的转化率都比野生型提高,说明突变体提高的热稳定性有利于海藻糖的转化率。     

一种高效的多点组合突变克隆构建方法

高质量的突变方法和高效的筛选方法相结合可以提高酶定向进化的效率。文中开发了一种高效的多点组合突变(Multi-points combinatorial mutagenesis,MCM)的克隆方法。MCM方法通过引入DNA组装、融合PCR和杂交技术,实现高效多点组合突变。应用优化后的方法定向进化改造苯甲酰甲酸脱羧酶(Benzoylformate decarboxylase,BFD)来测试MCM方法的效率。通过电转至大肠杆菌感受态Escherichia coli TreliefTM 5α所获得的单菌落数量(Colony-formingunits,CFUs)超过106 CFUs/μgDNA。经验证90/100单菌落精确组装;5个位点L109、L110、H281、Q282和A460同时组合突变的效率达到88%。最后,筛选到一种kcat/Km提高10倍的突变酶(L109Y、L110D、H281G、Q282V和A460M)。因此,应用该方法可以有效地创建突变体库,促进酶的定向进化技术的快速发展。     

基于多重计算设计策略提高枯草芽孢杆菌脂肪酶的热稳定性

提高酶的热稳定性是生物催化领域的热点和难点,计算机辅助的理性设计相比于传统的定向进化更加高效,在酶工程领域中的应用越来越广泛和深入。文中以枯草芽孢杆菌脂肪酶A为模式蛋白,首先,利用Rosetta-VIP计算设计对酶的结构空腔进行分析,选择了16个有利于结构空腔填充(ΔΔE0)的单点突变,并以突变位点的溶剂可及表面积和进化保守性为二次筛选依据,测定了其热稳定性与酶活性。有6个单点突变体(F17A、V74I、L114P、I135V、M137A、I157L)的热稳定性得到了提高,其中Tm值最大提高3.18℃。结果表明,单点突变体满足ΔΔE越低、蛋白溶剂可及表面积减少且符合序列保守性,则得到保留原有酶活力的正向突变的可能性越大。此外,将热稳定性提高的6个单点突变进行迭代组合突变,两点组合突变体的Tm最大提高4.04℃,三点组合突变体的Tm最大提高5.13℃,四点组合突变体的Tm提高了7.30℃,六点组合突变体的Tm提高了7.43℃。因此,基于酶的分子结构的空腔分析、溶剂可及表面积及氨基酸序列保守性计算的多重虚拟筛选方法,可有效提高酶的热稳定性。     

蛋白质新功能定向进化研究策略

利用定向进化策略改造蛋白质功能已经在农业、工业和医药等领域得到了广泛的应用.蛋白质工程的最新进展是利用定向进化策略对自然界蛋白质引入新功能,但由于其决定因素比较复杂,是研究者面临的一个重大挑战.详细介绍了国外近年发展的蛋白质新功能定向进化研究策略:对传统突变体库构建策略进行改进以及非同源重组改造技术的开发,是早期引入蛋白质新功能的常用手段,利用计算/理性设计与定向进化相结合引入蛋白质新功能是近年定向进化研究的一个重大突破,而噬菌体展示技术是蛋白质新功能筛选的主要策略.蛋白质新功能的分子进化模型已逐渐成为蛋白质工程改造的新思路.     

一种高效的多点组合突变克隆构建方法（英文）

高质量的突变方法和高效的筛选方法相结合可以提高酶定向进化的效率。文中开发了一种高效的多点组合突变(Multi-points combinatorial mutagenesis,MCM)的克隆方法。MCM方法通过引入DNA组装、融合PCR和杂交技术,实现高效多点组合突变。应用优化后的方法定向进化改造苯甲酰甲酸脱羧酶(Benzoylformate decarboxylase,BFD)来测试MCM方法的效率。通过电转至大肠杆菌感受态Escherichia coli TreliefTM 5α所获得的单菌落数量(Colony-formingunits,CFUs)超过106 CFUs/μgDNA。经验证90/100单菌落精确组装;5个位点L109、L110、H281、Q282和A460同时组合突变的效率达到88%。最后,筛选到一种kcat/Km提高10倍的突变酶(L109Y、L110D、H281G、Q282V和A460M)。因此,应用该方法可以有效地创建突变体库,促进酶的定向进化技术的快速发展。     

蛋白质定向进化的研究进展及其应用前景

定向进化是改造蛋白质分子的有效新策略.它不需要了解蛋白质的空间结构,主要通过在实验室里模拟自然进化过程,采用错误倾向PCR等方法对编码蛋白质的基因进行随机突变,经DNA改组、交错延伸等技术进行体外重组,设计高通量筛选方法来选出需要的突变体.本综述了定向进化技术的发展及应用.     

绿色木霉葡聚糖内切酶EGIII基因在大肠肝菌中的表达、定点突变及其动力学特性的研究

将绿色木霉葡聚糖内切酶EGIII基因亚克隆到表达载体pET-22b(+),构建重组质粒pET-egl3,转化到大肠杆菌BL21(DE3).利用金属亲和层析对重组EGIII进行纯化,纯化后酶比活力达到6 U/mg蛋白,最适反应温度为60 ℃,最适pH为4.0.同时对EGIII催化区的氨基酸残基R130和E218进行定点饱和突变,各筛选到一株酶活有提高的突变子R130P和E218F,其比活力为野生型EGIII的2.8倍和3.45倍.突变酶E218F的Km提高了一倍,催化效率Kcat提高了5.4倍;而R130P的Km和Kcat没有明显变化.两个突变酶的最适酶解温度和pH分别都提高至65 ℃和4.4.