微生物凝乳酶的研究 Ⅱ.酶学性质

从2502株菌中筛选到一株真菌Y85-8512经诱变育种,发酵物的凝乳酶活力为5000 u/g以上。对该酶的酶学性质进行了研究,其最适反应温度为70℃,酶在50℃保温半小时稳定;pH 5.0时酶活最高,pH 7.0酶几乎失活;pH 2—5,室温保持1小时,剩余酶活力为66—100%。该酶凝乳活性与水解蛋白质活性之比为4782。还与胃蛋白酶、小牛凝乳酶及毛霉凝乳酶进行了比较,初步认为该酶不同于这几种酶。     

微生物凝乳酶的研究 Ⅱ.酶学性质

从2502株菌中筛选到一株真菌Y85-8512经诱变育种,发酵物的凝乳酶活力为5000 u/g以上。对该酶的酶学性质进行了研究,其最适反应温度为70℃,酶在50℃保温半小时稳定;pH 5.0时酶活最高,pH 7.0酶几乎失活;pH 2—5,室温保持1小时,剩余酶活力为66—100%。该酶凝乳活性与水解蛋白质活性之比为4782。还与胃蛋白酶、小牛凝乳酶及毛霉凝乳酶进行了比较,初步认为该酶不同于这几种酶。     

焦曲霉产木聚糖酶的研究*

从1144株真菌中筛选到一株产木聚糖酶活力较高的焦曲霉(Aspergillus ustus)。该菌株适宜的产酶条件为在4%麸皮液中添加0.5%葡萄糖,0.4%硝酸钠及0.1%氯化钠,30℃振荡培养6d,木聚糖酶活力可达2176 u/mL。酶反应的最适温度为55℃,最适pH为5.5,在pH5～8酶活力稳定。45℃保温1h,酶活力剩余35%。酶水解桦木木聚糖的Km值为4.3×10^-3g/mL,V_max值为4.9mg/(mL·min)。酶解产物以木三糖和木四糖为主,表明该酶是一种典型的内切糖苷酶。     

一株地衣芽孢杆菌产凝乳酶酶学性质研究

目的：对地衣芽孢杆菌所产凝乳酶的酶学特性进行研究。方法：在不同的温度、pH值、底物浓度、不同金属离子等条件下测定地衣芽孢杆菌产凝乳酶相对酶活力。结果：地衣芽孢杆菌所产凝乳酶最适凝乳温度为70℃;40℃以上热处理后凝乳活性有不同程度的损失,75℃热处理10min后凝乳酶活性丧失;pH值为5～8时凝乳活性随乳pH值的降低而增强,pH值为7时凝乳酶最稳定;Ca2+ 、Fe2+、Fe3+、Mn2+、Mg2+、Al3+对酶活性有一定的促进作用;Li2+、Na+、Cu2+、Zn2+对酶活性有抑制作用;底物浓度最适为250 g/L、Ca2+的最适浓度为0.014 g/L。     

产果胶酶的菌种选育及发酵条件

炭黑曲霉(Aspergillus carbonarius)AS 3.396经亚硝基胍和Co60r-射线诱变,获得一株高产果胶酶突变株G5512。该菌株的发酵滤液,以高酯果胶为底物的酶活力为860u／ml;以低酯果胶为底物的酶活力为1227u／ml。产酶活力水平约为原出发菌株的2—6倍。产酶最适培养条件为：起始pH4.0—4.5,30℃,72—90小时。酶作用最适条件为：高酯果胶为底物时,pH3.5,50℃;低酯果胶为底物时,pH4.5,50℃。pH稳定范围为2．0-6．5(高酯果胶)和4.5—5.0(低酯果胶)。酶在60℃保温15分钟,高酯果胶为底物的酶剩余活力71％,低酯果胶为底物的酶活力仅剩余1％。     

棒曲霉22产木聚糖酶的研究

从105株霉菌和酵母菌中筛选到一株木聚糖酶活力较高的棒曲霉(Aspergillua clavatus)菌株22。该菌株适宜的产酶培养基为(g/1):蔗渣半纤维素30,NH₄NO₃ 5,酵母膏5,麸皮10,吐温801和少量无机盐,初始pH5.5。最适的孢子接种量为4.9×10⁶个/ml。在上述培养基中28℃振荡培养72h.木聚糖酶活力可达335.9u/ml。酶反应的最适温度为50℃;最适pH为4.8,在pH 6-11酶活性稳定。     

高活力β-淀粉酶菌种的选育和发酵条件的研究

产β一淀粉酶的腊状芽孢杆菌(Bacillus cereus)Asl．447,通过紫外线、亚硝基胍和利福平的反复处理诱变,获得一株具有高活力β-淀粉酶的变异菌株M一3,产酶活力从74u／ml提高到5000—7000u／ml。牛肉汁液体培养基成分为：每100ml牛肉汁中加人蛋白胨1g,可溶性淀粉1g,酵母膏0．5g,NaCl 0．5g pH6．0。该变异菌的最适培养条件是：pH6—6．5 30℃48小时。酶的最适反应条件是：温度40℃,pH7 0,pH稳定范围是6—9,酶的抗热性较差,对可溶性淀粉水解率达85％以上。     

脂肪酶产生菌Geofrichum sp. AS 2.1135产酶条件及酶一般性质的研究

在92株能同化油的地霉属菌株中,Geotrichum sp. AS2．1135菌株产脂肪酶活力为50—60u／ml,对其产酶条件的研究表明,不饱和长链脂肪酸和油类有利于酶的形成。在4％豆饼粉作为有机氮源的培养基中,加入0．2％尿素,酶活力显著增加,酶活达150u／ml。用聚乙二醇橄榄油乳化系统测定酶的作用最适pH为8．0,最适温度为4O一42℃。在pH4一9时5℃下存放24小时,或在pH 5和8时45℃保持15分钟,酶活力不变。     

微小毛霉凝乳酶基因定点突变及其酶学性质

微小毛霉凝乳酶具有很高的凝乳酶活力,是牛凝乳酶的潜在替代品,但由于微小毛霉凝乳酶蛋白水解活力过高,不利于干酪生产应用,所以本研究探索利用定点突变技术对微小毛霉凝乳酶基因进行分子改造,降低其蛋白水解活力及热稳性,提高凝乳活力。结果表明,凝乳酶肽链第186位由甘氨酸(Gly)突变为天冬氨酸(Asp)(即G186D)后,突变子凝乳活力显著提高,热稳定性有所降低;13位点由谷氨酸(Glu)分别突变为天冬氨酸(Asp)和谷氨酰胺(Gln)(即E13D,E13Q)后,突变子蛋白水解活力明显降低,同时凝乳活力稍有降低;第101位点由甘氨酸(Ala)突变为苏氨酸(Thr)(即A101T),突变子凝乳活力稍有提高,水解活力及热稳定性没有明显变化。此外,双重突变子,即101位点和186位点同时突变的突变子(即A101T/G186D)表现型与186单位点突变相一致,凝乳活力显著提高,热稳定性显著降低;186位点和13位点同时突变的突变子G186D/E13D和G186D/E13Q与13位点单点突变相比,凝乳活力有所提高,水解活力显著降低。     

二株高活力纤维素分解菌EA3-867和N2-78的获得及其特性的比较

拟康氏木霉(Trichoderma pseudokoningii Rifai)野生型菌株AS 3．3002和木3,分别经多种物理化学因素(高能电子、60钴、紫外线、亚硝基胍、硫酸二乙酯等)诱变处理后,得到二株变异菌株EA3,-867和N2-78。它仉的固体曲、液体曲和酶制剂的各项纤维紊酶活力测定结果,均比野生型菌株明显提高。N2-78菌株经摇瓶培养60小时,其CMC糖化力为255毫克葡萄糖／毫升酶液,滤纸糖化力为8．2毫克葡萄糖／毫升酶液,棉花糖化力为13．4毫克葡萄糖／毫升酶液,分别比野生型菌株提高H．6倍、5．3倍和7倍。由EA3-867和N2-78的固体曲制取的纤维素酶粗制剂,其各项纤维紊酶话力测定结果,均较Onozuka R-10纤维索酶制剂为高。上述野生型菌株及变异菌株均具有果胶酶、半纤维紊酶、淀粉酶和少置蛋白酶的活力。变异菌株中果胶酶的活力较野生型菌株为高,淀粉酶和蛋白酶活力则较低。同时,变异菌株的形态也与原始菌株有明显差异。上述四株菌的孢子致死温度相同,CMC糖化、滤纸崩溃和滤纸糖化的最适pH相近,最适温度相同,分别为pH 4.4、60℃,pH4.8、60℃和pH4.8、60℃。     

短小芽孢杆菌碱性蛋白酶的提纯和性质的研究

由短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)209产生的胞外碱性蛋白酶的粗酶制剂(5×10 4u／g),经硼砂NaOH缓冲液抽提,硫酸铵沉淀,Sephadex G一25脱盐,DEAE-纤维素柱层析,冷冻干燥获得部分纯化的酶。纯酶的活力为199x10u/g,比活力提高2,6倍。此酶的最适pH8．5—9．0,在pH6一10之间稳定,因此是属于微碱性蛋白酶“’。最适温度为50℃,在50℃以下稳定,在60℃处理10分钟活力损失95％。0.003村c丑件的存在对酶的热稳定性和pH稳定性均有显著提高。Ag+,Cu2+,Fe2+,Hg+,Zn2+ 对酶有抑制作用;Mn2+有明显的激活作用;1×10-3M的PCMB,IAA,O-PTH,PMSF对活力无影响;1×10-3M EDTA对酶有30％的抑制作用;在40℃用NBS(1×10-4M)、DFP(2．5mM)对醢进行10分钟处理,酶活力完全损失。此酶能水解多种天然蛋白,如酪蛋白、血红蛋白、蛇毒蛋白等,不水解鱼精蛋白和溶菌酶。以酪蛋白为底物测得的km值为0．66×10-2g／ml。在pH7．3进行圆盘凝胶电泳,虽然呈现九条带,但均具有大小不等的蛋白酶活力。     

苯甲酸1，2-双加氧酶高活力菌株的筛选和发酵条件的研究

从176株细菌中,筛选出苯甲酸1,2-双加氧酶的高活力菌株假单胞菌(Pseudomonas)137。进行了该菌产酶的发酵条件试验。产酶的最适温度为32℃,最适起始pH为6．5—7．0。葡萄糖、麦芽糖和甘油对产酶有明显的抑制作用,苯甲酸钠对产酶有促进作用。氨态氮对菌体生长和产酶是必需的。琥珀酸钠是酶形成的有效诱导物,采用0．1％苯甲酸钠和0．2％琥珀酸钠培养基(pH6．5—7．0),于32℃振荡培养72小时,可获得高活力的苯甲酸1,2-双加氧酶,每克菌体酶活力可达5-8单位。     

解淀粉芽孢杆菌凝乳酶的克隆、重组表达及酶学性质

为了实现解淀粉芽孢杆菌来源凝乳酶的异源表达,并探究重组凝乳酶的酶学性质。以解淀粉芽孢杆菌基因组DNA为模板,扩增得到凝乳酶编码基因proMCE,构建了重组菌株E.coliBL21(pET28a-proMCE),并成功表达了重组凝乳酶。通过Ni柱亲和层析法纯化具有活性的凝乳酶,分子量大小约为28.5kDa,纯化后比酶活达到1096.97SU/mg,纯化倍数达到4.56倍,回收率为66.51%。对该重组酶酶学性质进行了初步研究,重组凝乳酶分别在70℃、65℃表现最大凝乳酶活力与蛋白酶活力,60℃处理20min,凝乳酶活力与蛋白酶活力均被钝化80%,为热不定性酶。酶的最适反应pH为5.0。在pH5~7条件下处理后,凝乳酶活力相对稳定,能保留超过70%的活力。     

一株产碱性蛋白酶菌株的选育及其发酵条件的研究

从土壤中分离到的553株芽孢杆菌中选出一株产蛋白酶活力较高菌株,经紫外线和亚硝基胍诱变,获得一株产碱性蛋白酶的菌株,酶活力可达10000u／m1,此菌株经鉴定为地衣状芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)。适宜的发酵条件：培养基由6％玉米粉(山芋粉或葡萄糖),4％豆饼粉(或其水解液),Na,HP0．·12Hz0 0．4％,KH：P0·0．03％,Na zc0,0．1％组成,pH7．O,37℃旋转摇床振荡培养{2一q6小时。酶作用的最适条件：60℃,pH9．0一10．5,在pH6．0—10．5范围内稳定。酶受DFP抑制。     

青霉NXP25纤维素酶的产生及性质

青霉（Penicillium sp.）NXP25在5％玉米穗轴粉,3％（麦夫）,0.35％氮源10号和0.3％氯化钙组成的液体培养基（起始pH 5.0）中,10％接种量,29℃,280r/min振荡培养72h。在50℃温度下测定,发酵液内切-1,4-β-葡聚糖酶,外切-1,4-β-葡聚糖酶,β-葡糖苷酶和滤纸酶活力分别为841u/mL,13u/mL,24u/mL和46u/mL。各类型酶最适作用条件分别为pH4.8和60℃、pH5.0和50℃、pH4.     

海枣曲霉β-D-岩藻糖苷酶的研究

虽然芦β-D-岩藻糖苷酶(EC3．2．1,38)已从多种动植物中分离纯化,但因它们的专一性均不高而难以确证。我们从海枣曲霉(Aspergillus phoenicis)培养物中提取,经过PEG6000-磷酸缓冲液双水相分离,相继用DEAE—sepbadev A-50、羟基磷灰石、Sephadex G-100等柱层析分离,获得了凝腔电泳均一的β-D-岩藻糖苷酶,比话力提高500倍。酶反应的最适条件为40℃和pH 6.0,在35℃以下和pH5．5—6.5稳定。凝胶过滤法测分子量为50000—60000,用SDS—PAGE测出分子量为57000。酶的Km值为2.4mmol／L,Vmax为12．8μmol·min-1·mg-1。金属离子Ag+．Hg2+对酶有强抑制作用,巯基乙醇和牛血清清蛋白以及甘油 和多种糖能提高酶活力。化学修饰结果表明,-SH、-COOH基团和组氨酸,色氨酸残基为酶活力所必需。该酶只能水解pNPβ-D-岩藻糖苷,有严格的底物专一性,并能专一地受D-岩藻培和D-岩藻糖酸-r-内酯所抑制,为迄今为止最专一的β-D-岩藻钠苷酶,堪称该酶的典型代表。     

多粘杆菌β-淀粉酶的产生及其性质的初步研究

多粘杆菌(Bacillus polymyxa) As1.546产β-淀粉酶的最适培养基成份(％)为：玉米粉4,豆饼粉2,酵母膏0.5,Na HPO4·12H2O 0．2,NaH2PO4·2H2O 0．03,MgSO4．7H2O 0．05,自然pH(7左右)。250毫升三角瓶装50毫升培养基,旋转式摇床(220转／分),温度为30a℃,培养时间为60小时,每毫升发酵液酶活力可达700单位。酶反应的最适温度为45℃,最适pH为6．5,水解可溶性淀粉生成麦芽糖可达96％。     

颗粒状固定化青霉素酰化酶的研究

将巨大芽孢杆菌 (Bacillusmegaterium)胞外青霉素酰化酶通过共价键结合到聚合物载体EupergitC颗粒环氧基团上 ,制成的颗粒状固定化青霉素酰化酶表现活力达 1 40 0 μ/g左右。固定化酶水解青霉素的最适 pH8 0 ,最适温度为 55℃。在pH6 0～ 8 5、温度低于 40℃时固定化酶活力稳定。在 pH8 0、温度 37℃时 ,固定化酶对青霉素的表现米氏常数Ka为 2×1 0 - 2 mol/L ;苯乙酸为竞争性抑制剂 ,抑制常数Kip为 2 8× 1 0 - 2 mol/L ;6 APA为非竞争性抑制剂 ,抑制常数Kia为 0 1 2 5mol/L。固定化酶水解青霉素 ,投料浓度为 8% ,在使用 2 0 0批后 ,保留活力 80 %左右 ,6 APA收率平均达 89 48%。     

β—N-乙酰氨基己糖苷酶产生菌的筛选与产酶条件

筛选了真菌、细菌和放线菌共1121株,其中有β-HexNAcasc活力的有237株,在所筛选菌中只要有β—GlcNAcase活力,也就有β-GalNAcase活力,但两酶比值(β-GlcNAcase／β—Gal-Nacase)不同。所筛选出的溜曲霉(ASP.tamarii)S215为由土壤中分离的,其产酶最适条件为5％麸皮液体培养基,28—30℃振荡培养5—6天,补充碳源如纤维二糖、葡萄糖胺、半乳糖胺或者补充氮源(NH4)2SO4及NH4NO3,可以稍稍提高酶活。在溜曲霉的培养液中除β-GlcNAcase及β-GalNAcase外,还有a-半乳糖苷酶、β一半乳糖苷酶、β-葡萄糖苷酶、β-岩藻糖苷酶及α-甘露糖苷酶。     

产α-淀粉酶的米曲霉菌株筛选及产酶条件的研究

从51株米曲霉(Aspergillus oryzae)中筛选到5株产α-淀粉酶活力较高的菌株,对其中的5037号菌株进行了产酶条件的试验:最适培养温度为30—33℃,时间为2.5天,3天以后酶活力开始下降;pH3.5—6.0之间对产酶活力影响均不大;外加碳源以糊精和瓜干粉较好,其中玉米粉加量以5%最好;外加氟源中NH₄NO₃和尿素等对酶的形成有促进作用;NH₄Cl抑制酶的形成。在最适产酶条件下,酶活力平均达438.8u/ml。