棕色固氮菌中固氮酶与过氧化物酶、过氧化氢酶、超氧化物歧化酶的相关性研究

通过对棕色固氮菌(Azotobacter vinelandii)沈-230菌株在不同时间培养下,菌的生长、繁殖与固氮酶(N2ase)、过氧化物酶(PER)、过氧化氢酶(CAT)和超氧化物歧化酶(SOD)的活力变化研究,发现棕色固氮菌中PER、CAT、SOD的活力水平与N2ase活性变化有密切的相天性。在对数生长期,N2ase活性随生长时间的延长而增加,同时CAT、PER和SOD酶的活性也相应增加。对数期之后,N2ase活力稍有下降,其它酶的活力亦有相应的变化。在研究酶活力变化的同时,研究了同工酶谱的变化。该变化亦有很强的规律性。根据研究结果,提出并讨论了棕色固氮菌中固氮酶的舫氧保护机制。     

H2O2对棕色固氮菌钼铁蛋白的损伤

棕色固氮菌固氮酶钼铁蛋白经Ｈ２Ｏ２作用后,钼铁蛋白的Ｍｏ和Ｆｅ原子含量,乙炔还原少在性,摩尔消光系数和α－螺旋度地匀显著降低,蛋白质肽链也许发生部分断一。本和纱中存在过氧化物酶。可避免Ｈ２Ｏ２对钼铁蛋白的损伤作用,表明Ｈ２Ｏ２对钼欠蛋白的金属原子簇和蛋白质结构均有明显的损伤作用,而过氧化物酶可保护固氮酶不受Ｈ２Ｏ２的破坏。     

棕色固氮菌突变种UW45的固氮酶钼铁蛋白（NifB-Av1）结晶

经两次DE52和Sephacryl s一300柱层析,从棕色固氮菌(Azotobacter vinelandii Lipmann)突变利UW45粗提液(37 677mg蛋白)中纯化得到628 mg的NifB^-Av1。经考马斯亮蓝R-250染色的SDS凝胶电泳分析表明,该蛋白基本达到SDS凝胶电泳纯,组成它的亚单位的种类与Av1(α和β亚单位)相似。NifB^-Av1不能与NifB^-Av2重组成具放氢活性的固氮酶,但可使与其保温重组的FeMoco显出高活性。在合适条件下,NifB^-Av1可在结晶溶液中析出棕色短斜四棱柱晶体,目前所得最大晶体的二维边长均为0．1mm。能否出现晶体以及出晶时间、晶体数目、大小、质量和形状等,与沉淀剂溶液各组分的种类和浓度、结晶方法、实验操作等因素密切相关。初步结果表明,所得晶体为NifB^-AV1单晶。     

棕色固氮菌含铁超氧化物歧化酶重组研究

将棕色固氮菌230含铁超氧化物歧化酶对8mol/L脲,10mmol/L EDTA透析制备无活性缺辅基蛋白;将其在8mol/L脲中对10mmol/L硫酸亚铁铵透析得到重组超氧化物歧化酶。重组酶含有与天然酶相近的铁含量,活性为天然酶的89.1％。缺辅基蛋白,重组酶与天然酶都是由二个相同的亚基组成;重组酶的吸收光谱与荧光光谱与天然酶几乎一样,而缺辅基蛋白则有较大的差异;从园二色谱的分析得知,缺辅基蛋白不含有α—螺旋,而天然酶和重组酶中α螺旋的含量分别为21％和20％;缺辅基蛋白比天然酶或重组酶具有更大的巯基反应性。     

棕色固氮菌固氮酶钼铁蛋白两种聚合体的研究

 棕色固氮菌固氮酶钼铁蛋白八聚体相当于两个钼铁蛋白四聚体的聚合体。在细胞生长过程中,胞内钼铁蛋白两种聚合体的相对含量出现规律性变化:在对数期,细胞固氮酶比活力成上升趋势,而钼铁蛋白主要以高活力的四聚体形式存在;在对数期结束至稳定期,细胞固氮酶比活力下降至一个低水平的稳定值,此时的钼铁蛋白基本上为八聚体形态。在细胞固氮生长时,向培养基中加入过量氨可明显地导致钼铁蛋白由四聚体向八聚体的转化。我们推断,生长过程中胞内钼铁蛋白聚合态的变化可能是调节固氮酶活力的一种方式。胞外,钼铁蛋白的两种聚合态可以相互转化。     

固氮蓝藻与棕色固氮菌固氮酶组分的交叉互补功能

本文报告了藻菌之间固氮酶组分的交叉互补试验。初步结果证明：固氮蓝藻(Anabaena azotica水生686)的钼铁蛋白与棕色固氮菌(Azotobacter vinelandii)的铁蛋白之间存在着明显的互补功能。但这种蓝藻的铁蛋白在非细胞形态下很不稳定,易于失活。本实验为不同生理类型和不同进化程度的固氮生物之间固氮酶组分的交叉互补研究提供了新的资料。     

棕色固氮菌缺失nifE的突变种固氮酶钼铁蛋白的结晶

从限氨固氮培养基中培养棕色固氮菌（Azotobacter vinelandii Lipmann)缺失nifE的突变种DJ35中,分离纯化得到缺失FeMoco的钼铁蛋白（△nifEAvl)。在一定条件下结晶得到深棕色短斜四棱柱晶体。结晶溶液中各组分的浓度以及结晶方法等对其晶核数目,晶体大小和质量有明显影响,目前用气相扩散的悬滴法所得的最大晶体的二维边长分别为0.12mm和0.13mm。     

缺失nifH的棕色固氮菌突变种固氮酶钼铁蛋白的结晶

从限氨固氮培养基中培养的缺失nifH的棕色固氮菌(AzotobactervinelandiiLipmann)突变种DJ54中,分离纯化出部分纯的缺失FeMoco的钼铁蛋白(ΔnifHAv1)。用相同纯化方法分别从DJ35和UW45突变种中纯化的ΔnifEAv1和NifB-Av1的纯度明显高于ΔnifHAv1的纯度。在合适的结晶条件下,可得到这三种蛋白的深棕色短斜四棱柱晶体。ΔnifHAv1与NifB-Av1一样,晶体形成所需的时间比ΔnifEAv1的长。而它结晶所需的沉淀剂和缓冲液最适浓度则与ΔnifEAv1的相同。SDS-PAGE鉴定表明,结晶的ΔnifHAv1与OPAv1的组成相似。这表明,在ΔnifHAv1溶液中形成的晶体可能就是该蛋白质的晶体。     

柱孢鱼腥藻的铁蛋白与棕色固氮菌的钼铁蛋白的交叉互补作用

纯化的柱孢鱼腥藻铁蛋白能够与棕色固氮菌的钼铁蛋白有效地交叉反应,展现较高的活性。此异源交叉反应的乙炔还原比活及放氢比活,分别是蓝藻同源互补比活的83.8及66．7％。比较藻铁蛋白与菌钼铁蛋白异源交叉反应及藻固氮酶组分之间的同源反应的动力学特点时发现,铁蛋白对钼铁蛋白的最佳克分子比数前者(异源交叉反应)较后者(藻同源反应)为高,前者为5,后者为1;但反应的时间进程两者差别不大。     

棕色固氮菌突变种UW45的固氮酶钼铁蛋白(NifB-Av1)结晶

经两次DE52和Sephacryl S-300柱层析,从棕色固氮菌(Azotobacter vinelandii Lipmann)突变种UW45粗提液(37 677 mg蛋白)中纯化得到628 mg的NifB-Av1.经考马斯亮蓝R-250染色的SDS凝胶电泳分析表明,该蛋白基本达到SDS凝胶电泳纯,组成它的亚单位的种类与Av1(α和β亚单位)相似.NifB-Av1不能与NifB-Av2重组成具放氢活性的固氮酶,但可使与其保温重组的FeMoco显出高活性.在合适条件下,NifB-Av1可在结晶溶液中析出棕色短斜四棱柱晶体,目前所得最大晶体的二维边长均为0.1 mm.能否出现晶体以及出晶时间、晶体数目、大小、质量和形状等,与沉淀剂溶液各组分的种类和浓度、结晶方法、实验操作等因素密切相关.初步结果表明,所得晶体为NifB-Av1单晶.     

棕色固氮菌细菌铁蛋白释放铁的动力学方程和性质

棕色固氮菌细胞铁蛋白铁核中的磷铁组成存在非均匀性。细菌铁蛋白释放铁的动力学特性表现出复杂性。通过动力学曲线分析,提出蛋白壳自身调节能力起着限制释放铁速率关键步骤的观点建立分析铁蛋白释放铁的动力学特性方程并用它较合理地阐明铁蛋白释放铁的动力不储存铁的途径。用分光光度法和动力学方程研究细胞铁蛋白释放铁的全过程。其表明该蛋白以一级反应方式释放铁核表层的铁和以零级反应方式释放铁核内层的铁。外加磷酸盐能强烈     

钼,铁,硫化合物激活曝氧的棕色固氮菌固氮酶钼铁蛋白的研究

曝氧后,棕色固氮菌(Azotobacter vinelandii)固氮酶钼铁蛋白的催化活性和圆二色信号都显著降低,而吸收光谱则显著增加。与钼、铁、硫化合物和二硫苏糖醇组成的重组溶液保温后,曝氢蛋白的圆二色信号和吸收光谱几乎完全恢复至天然状态的同时,乙炔还原活性也得到了显著的恢复,表明重组溶液可使曝氧蛋白中的 P-cluster和其它活性部位都得到了不同程度的修复。     

棕色固氮菌含铁超氧化物歧化酶的分离提纯及性质研究

本文以改进的方法提纯了棕色固氮菌——230含铁超氧化物歧化酶。产品收率提高1倍以上。该酶在pH8.2时,5℃～60℃稳定。在25℃时,pH6～12稳定。NaN_3和H_2O_2是该酶的抑制剂,而KCN对此酶活力无影响。     

棕色固氮菌固氮酶钼铁蛋白的几种化学修饰方法

用对氯汞苯甲酸或二巯基双二硝基苯甲酸修饰巯基。用三硝基苯磺酸、重氮四唑和焦碳酸二乙酯分别修饰氨基、酚式羟基和眯唑基。在一定范围内,被修饰钼铁蛋白在特征波长吸收值的上升和重组活性的下降与修饰剂用量的增加和时间的延长相一致,超过该范围后则光吸收和活性都保持不变。由于无氧凝胶过滤去除多余的修饰剂时未加连二亚硫酸钠,甚至正常钼铁蛋白的重组活性下降了24.2％,修饰后的铝铁蛋白活性下降范围为23.4～41.4％不等。