EV71病毒对树鼩原代肾上皮细胞感染模型的建立

目的建立EV71对树鼩原代肾细胞的感染模型。方法胰蛋白酶消化法获得树鼩的原代肾细胞,用EV71感染树鼩肾细胞,测定1、2、4、6和8 d培养上清病毒滴度,分别用Western blot和间接免疫荧光法检测细胞中EV71病毒VP1蛋白的表达,以确定EV71病毒对树鼩原代肾细胞的感染性。结果对分离得到的树鼩原代肾细胞进行传代纯化和形态鉴别,建立以树鼩原代肾细胞为主的细胞培养。用EV71病毒感染树鼩原代肾细胞,感染后48~96 h病毒滴度可达到1.3×10~6TCID_(50)/m L,说明EV71病毒可有效感染树鼩原代肾细胞并有效增殖。Western blot检测发现,EV71病毒VP1蛋白可在感染后2~8 d的树鼩原代肾细胞中有效检出,间接免疫荧光法则在感染后2~6 d细胞的细胞质中检测到病毒VP1蛋白的分布。结论在成功建立树鼩原代肾细胞培养的基础上,确定了EV71病毒对树鼩原代肾细胞的感染性和病毒增殖特性,初步建立了EV71树鼩原代肾细胞感染模型。     

建立检测树鼩葡萄糖转运蛋白GLUT9 mRNA相对表达水平的实时荧光定量PCR方法

建立检测树鼩葡萄糖转运蛋白GLUT9 mRNA相对表达水平的实时荧光定量PCR方法.设计检测GLUT9(SLC2A9)及内参GAPDH mRNA的引物,以树鼩新鲜肾脏组织提取的总RNA为模板,进行实时荧光定量扩增,获得SLC2A9及GAPDH的标准曲线及其相对表达变化.测序结果显示扩增的SLC2A9及GAPDH核苷酸序...     

重组8型腺相关病毒介导HBV急性感染树鼩模型建立

目的利用重组8型腺相关病毒介导1.3拷贝HBV基因组（1.3HBV,ayw亚型）在树鼩肝脏表达,建立HBV急性感染树鼩模型。方法通过大腿内侧静脉注射将携带有1.3 HBV的重组8型腺相关病毒（recombi-nant adeno-associated virus 8,rAAV8-1.3HBV）导入树鼩肝脏,通过ELISA检测树鼩血清中HBsAg、HBeAg、HBsAb、HBeAb、HBcAb,荧光定量PCR检测树鼩肝脏和血清中HBV DNA,全自动生化分析仪检测血清中ALT水平,并观察感染后肝脏的病变情况。结果 HBV感染主要血清标志物1～2周内均检测阳性;30 d后肝组织仍可检测到病毒抗原阳性细胞;55 d时肝组织HBV DNA拷贝数仍可达到104～105;树鼩血清中HBV DNA拷贝数持续一个月高于正常组;肝组织炎细胞略增多,血清ALT水平持续升高。结论 rAAV8所携带的HBV基因组高效专一导入树鼩肝细胞并复制表达,成功建立HBV急性感染树鼩模型,为进一步探索rAAV8树鼩慢性感染模型打下一定的基础。     

人类巨细胞病毒感染树鼩原代真皮成纤维细胞诱导凋亡特性

人类巨细胞病毒(HCMV)流行广泛,危害严重,由于其严格的物种特异性限制,动物模型缺乏,严重阻碍了对其致病机制的研究及药物、疫苗的研发。本研究对树鼩(Tupaia belangeri)来源的原代真皮成纤维细胞感染HCMV后的细胞死亡现象进行了初步探索。首先,观察了感染后细胞病变和死亡情况,使用细胞增殖检测试剂盒测定了细胞活力;其次,对凋亡相关因子bax、bcl-2和未折叠蛋白反应相关因子chop、atf4、xbp1s转录水平的差异进行了逆转录荧光定量PCR检测与分析;然后利用免疫蛋白印迹技术检测并分析了主要病毒蛋白IE1、UL44和凋亡相关因子Bax、Caspase-9、Caspase-3、PARP的表达水平;最后结合膜联蛋白-V和碘化丙啶双染色法从生物化学角度对细胞死亡类型进行了鉴定。结果显示,细胞病变和死亡情况随着感染进程逐渐严重,细胞活力下降明显(P 0.001)。感染上调bax、bcl-2、chop、atf4、xbp1s转录水平并且使bax与bcl-2转录水平呈明显拮抗趋势;感染同时上调Bax、Caspase-9、Caspase-3、PARP蛋白表达和逐级剪切激活;病毒蛋白IE1、UL44可以上调至一个完整的病毒复制周期结束。综上,本研究指出HCMV跨物种感染树鼩原代真皮成纤维细胞可诱导细胞凋亡,并且与内质网和线粒体密切相关。     

人轮状病毒G1P[8]型感染树鼩原代小肠上皮细胞模型的建立

目的探究树鼩原代小肠上皮细胞的增殖特性,建立人轮状G1P[8]型病毒体外感染树鼩原代小肠上皮的细胞模型。方法采用胶原酶XI和中性蛋白酶I联合消化法获取树鼩原代小肠上皮细胞,经纯化和鉴定,用人轮状G1P[8]型病毒感染细胞,测定培养上清的病毒滴度和载量,并用Western blot和间接免疫荧光检测法检测人轮状病毒G1P[8]型VP6蛋白的表达情况,评价人轮状G1P[8]型病毒体外对树鼩原代小肠上皮细胞的感染性。结果分离的树鼩原代小肠上皮细胞经传代培养纯化,获得纯度达90%树鼩原代小肠上皮细胞。对树鼩原代小肠上皮细胞、原代肾细胞、HCT116细胞和MA104细胞进行轮状病毒易感性比较,确定树鼩原代小肠上皮细胞可以被人轮状病毒G1P[8]感染,培养72 h时病毒滴度可达到2.0×105TCID_(50)/m L。经Western blot和间接免疫荧光发现在人轮状G1P[8]型病毒感染树鼩原代小肠上皮细胞1~5 d均能检测到人轮状病毒VP6蛋白的表达和分布。结论确立了树鼩原代小肠上皮细胞的分离、纯化与培养方法,并建立了人轮状G1P[8]型病毒感染树鼩原代小肠上皮细胞的体外模型。     

人偏肺病毒感染小鼠肺内Toll样受体表达及PolyI:C对病毒感染的影响

探讨人偏肺病毒感染BALB/c小鼠后肺组织Toll样受体(TLRs)表达变化及PolyI:C对病毒复制的影响。实验小鼠分为hMPV感染组、polyI:C+hMPV组、polyI:C+DMEM组、DMEM对照组,均在滴鼻后1、3、5、7、9和16d处死,取肺组织用于病毒滴度测定、病理检查、通过RT-PCR和实时荧光定量PCR方法检测小鼠肺组织内TLRs mRNA的表达。结果显示:①与hMPV感染组相比,polyI:C+hMPV组小鼠肺内病毒复制水平明显减低,仅在感染后第5d及第7d检测到病毒;病理检查结果亦提示肺部炎症明显减轻。②RT-PCR结果提示:hMPV感染组小鼠与DMEM对照组相比,肺组织内大部分TLRs mRNA表达均升高。③实时荧光定量PCR结果提示:hMPV感染后小鼠肺组织TLR7-8 mRNA增高最为显著,且有时间依赖性;滴鼻后24h,polyI:C+hMPV组TLR3的表达明显升高。提示:人偏肺病毒感染BALB/c小鼠后,可上调小鼠肺组织Toll样受体表达,其中TLR7/8途径可能在启动天然免疫应答中起着重要作用;polyI:C可通过早期活化TLR3,抑制hMPV在小鼠肺内的复制,并减轻肺部炎症。     

正常猕猴与树鼩神经系统和免疫系统组织中大麻素与阿片受体的表达

为应用猕猴和树鼩动物模型研究毒品成瘾对神经/免疫系统的影响提供基础数据,对大麻素及阿片受体在正常猕猴和树鼩神经系统和免疫系统的表达进行初步确定.采集正常猕猴和树鼩新鲜组织(皮质、小脑、脑干、海马、脊髓、脾脏),应用半定量逆转录PCR和实时定量PCR的方法检测大麻素与阿片受体mRNA在猕猴和树鼩各组织中的表达情况.猕猴脑部各区包括脾脏均表达大麻索受体1(CNR1),而大麻素受体2(CNR2)只表达于脾脏内.三类阿片受体中,mu(μ)受体表达最为广泛,在以上各组织中均有表达;delta(δ)受体表达的组织最少,只在海马表达;kappa(κ)受体表达介于两者之间,分别在皮质、小脑、脑干、脊髓中表达.在树鼩组织中,CNR1和CNR2表达于整个大脑重要脑区中,且CNR1表达量高于同一区域内CNR2表达的鼍:脾脏中CNR2的表达较高,而CNR1不表达.三类阿片受体只有检测到μ受体在脑部与脾脏表达,且在各个脑区的表达量明显高于脾脏的表达量;δ体和κ受体在被检各个组织中均无表达.总体而言,两种大麻素受体在猕猴和树鼩体内表达情况与人类和鼠的情况类似,而三类阿片受体在猕猴体内表达情况与人类吏为接近.猕猴和树鼩可能可用于人类毒品成瘾的研究;猕猴在某些神经受体的表达更接近人类,其在研究毒品成瘾的机理和对免疫系统的影响方面仍有不可替代的地位.     

树免疫细胞体外感染Ⅰ型人免疫缺陷病毒的实验研究

至今可以感染Ⅰ型人免疫缺陷病毒(HIV-1)的动物只有黑猩猩和长臂猿,这严重阻碍了HIV-1的疫苗研究和治疗研究。因此,寻找新的可以感染HIV-1的动物模型成为十分迫切的课题。已知树鼩对许多重要的医学病毒易感,为了探讨树鼩是否可以感染HIV-1,利用不同辅助受体的5种HIV-1病毒株,体外感染云南野生成年树鼩的淋巴细胞和单核/巨噬细胞;同时还用这些病毒感染人外周血淋巴细胞或单核细胞。然后用RT-PCR、PCR和流式细胞术分别进行检测。用RT-PCR方法未检测到感染上清中有病毒粒子的存在,用PCR法未能发现树鼩的这些免疫细胞中有前病毒DNA,用流式细胞术也未能在这些感染HIV-1的树鼩细胞的表面检测到特异抗原;而感染HIV-1的人免疫细胞均为阳性结果。实验结果表明树鼩的这些免疫细胞在体外未能感染上HIV-1,可能的原因是树鼩的这些免疫细胞的HIV-1受体(CD4)和辅助受体(CCR5或CXCR4)与人的免疫细胞差别较大。     

转录因子SOX9基因对脑胶质瘤干细胞干性维持的相关性研究

目的:应用慢病毒干扰SOX9的表达,观察其对脑胶质瘤干细胞干性维持的影响。方法:设计2条针对SOX9转录短发夹RNA(sh RNA)的DNA序列,构建慢病毒并感染胶质瘤细胞系U87、U251细胞,利用嘌呤霉素筛选稳转细胞。在转录水平及蛋白水平检测SOX9的沉默效果,利用荧光实时定量PCR(q RT-PCR)及免疫荧光染色检测相应干细胞相关标志分子SOX2、Nestin的表达差异。比较诱导形成的胶质瘤干细胞成球能力(肿瘤干细胞成球的直径),同时利用荧光实时定量PCR(q RT-PCR)及免疫荧光染色对干细胞相关标志物SOX2、Nestin的表达水平进行比较。结果:SOX9成功包装慢病毒并有效感染U87、U251细胞,实时荧光定量PCR检测其抑制率分别可降低83.74%和80.12%。并且在稳转细胞系水平相关干细胞标志分子表达含量有明显下降。在干细胞层面沉默SOX9可以明显抑制胶质瘤细胞诱导成球的直径(P0.01),同时免疫荧光显示肿瘤干细胞相关干性分子SOX2、Nestin的表达水平较对照组明显降低。结论:慢病毒感染沉默SOX9基因可以抑制胶质瘤干细胞干性的维持,为胶质瘤的生物治疗提供了重要的靶点。     

茧蜂病毒基因启动子的结构与调控

启动子的开启与关闭在基因的表达中起着重要的作用。启动子作为信号通路的终点,决定了信号通路最终的信息。本文通过利用预测启动子的生物信息学技术与方法,初步发现茧蜂病毒启动子可分为杆状病毒类似启动子和茧蜂病毒特有启动子两种,并且这两类启动子都具有真核启动子的结构。在茧蜂体内和鳞翅目宿主体内调控茧蜂病毒基因启动子的转录因子大不相同,因此启动茧蜂病毒基因启动子的通路也有所不同。在茧蜂病毒基因整合到宿主细胞的核DNA中后,利用激活的Toll信号通路和IMD信号通路完成自身的基因表达。本文以本实验室研究的双斑侧沟茧蜂病毒(Microplitis bicoloratus bracovirus)的Vank基因和寄主斜纹夜蛾Spodoptera litura的Innexin基因启动子为例,结合茧蜂病毒启动子研究的最新进展,综述了茧蜂病毒基因启动子的核心结构和NF-κB蛋白结合位点,为今后的研究打下一定基础。     

滇东南和滇西北国家重点保护野生维管植物比较分析

通过野外考察和资料整理,对《国家重点野生保护植物名录(第一批)》中维管植物在滇东南和滇西北的空间分布及其与保护区设置的相关性进行统计和分析。结果表明:1、滇东南有107种保护植物,占云南分布(144种)的74.31%;滇西北53种,占云南省的36.81%;2、滇东南和滇西北保护植物种类垂直分布均呈单峰曲线,滇东南集中分布在海拔1008m附近(RSE=0.9919),滇西北主要在2 360 m附近(RNW=0.9656);3、县级水平的自然保护区设置权重与国家I级(Pearson指数,rI=0.724)和Ⅱ级(rⅡ=0.643)保护植物种类在滇东南均呈极显著的正相关性(P0.01),而在滇西北相关性(rI=0.464;rⅡ=0.410)差异均不显著(P0.05)。滇东南保护植物较滇西北丰富,滇东南保护区设置较滇西北更有利于对保护植物的有效保护。     

尼古丁在诱导的肺泡巨噬细胞自噬及肺炎中的作用

目的:探讨尼古丁在诱导的小鼠肺泡巨噬细胞自噬及肺炎发生中的作用。方法:通过碘化丙啶(PI)/Hochest33258染色法检测尼古丁诱导巨噬细胞MH-S死亡;通过Western印迹和电子透射显微镜检测尼古丁诱导MH-S细胞自噬的发生;采用中性红摄取实验检测尼古丁处理后巨噬细胞的吞噬能力;通过攻毒实验检测尼古丁诱导的肺炎。结果:不同浓度尼古丁作用下PI染色的死细胞呈上升趋势;LC3BⅡ蛋白表达具有尼古丁剂量依赖性,并且1μmol/L的尼古丁能够增强LPS预刺激的MH-S细胞自噬发生。电子透射显微镜结果显示在1μmol/L尼古丁的作用下,细胞内自噬体数量增加;MH-S的中性红摄取能力与尼古丁浓度剂量呈负相关性;尼古丁能够诱导小鼠发生肺炎,并降低小鼠体重。结论:尼古丁能够增强肺泡巨噬细胞的自噬水平,并且可以诱导肺炎的发生,有助于进一步研究吸烟与肺炎的关系。     

Contribution to knowledge of the genus Chydaeus in Xizang Autonomous Region [Tibet] and Yunnan Province, China (Coleoptera, Carabidae, Harpalini)

Five new species of the genus Chydaeus Chaudoir, 1854 are described from China: Chydaeus fugongensissp. n. (Shibali, Fugong County, Yunnan Province), Chydaeus gutangensissp. n. (Gutang, Medog County, Xizang Autonomous Region [Tibet]), Chydaeus hanmiensissp. n. (Hanmi, Medog County, Xizang Autonomous Region [Tibet]), Chydaeus asetosussp. n. (NE of Fugong, Yunnan Province), and Chydaeus baoshanensissp. n. (N of Baoshan, Yunnan Province). Taxonomic and faunistic notes on eleven other species occurring in Xizang and Yunnan are also provided. Chydaeus shunichii Ito, 2006 is re-described, based on specimens from Lushui County, Yunnan. Chydaeus kumei Ito, 1992 is treated as a subspecies of Chydaeus andrewesi Schauberger, 1932 [NEW STATUS]. The taxonomic status of Chydaeus guangxiensis Ito, 2006 is discussed. The following taxa are recorded from China for the first time: Chydaeus obtusicollis Schauberger, 1932 (Xizang and Yunnan), Chydaeus malaisei Kataev & Schmidt, 2006 (Yunnan), Chydaeus semenowi (Tschitschérine, 1899) (Xizang and Yunnan), Chydaeus andrewesi andrewesi Schauberger, 1932 (Xizang and Yunnan), Chydaeus andrewesi kumei Ito (Yunnan), Chydaeus bedeli interjectus Kataev & Schmidt, 2002 (Xizang), and Chydaeus bedeli vietnamensis Kataev & Schmidt, 2002 (Yunnan).     

Preliminary survey on the population and distribution of gibbons in yunnan province

Of the gibbons in China,Hylobates hoolock, H. lar, andH. concolor leucogenys are distributed only in Yunnan Province, whileH. c. concolor occurs limitedly in Yunnan Province and Hainan Island. During the periods from February to November 1984, and March to August 1985, the authors undertook surveys of the population and distribution of gibbons in 56 counties of 10 prefectures in Yunnan Province, and obtained the first reliable population and distribution data on the gibbons of this Province. The findings serve to fill an important blank in gibbon research in Yunnan and should pave the way for further research in the future.     

云南省生物多样性保护进展、成效与前瞻

《生物多样性公约》第十五次缔约方大会(COP15)计划于2021年在云南昆明召开, 大会将评估《2011-2020年生物多样性战略计划》执行情况及实施进展。如能达成协议, 将出台“2020年后全球生物多样性框架”, 作为指导2020年之后全球生物多样性保护的最新纲领性文件。这是生物多样性保护国际进程的一个里程碑, 也是展现中国以及云南多年来生物多样性保护成效的重要契机。作为中国生物多样性最为丰富的省份和具有全球意义的生物多样性关键地区之一, 云南在生物多样性保护方面投入巨大努力, 在全国较早发布省级《生物多样性保护战略与行动计划(2012-2030年)》、开创地方立法先河、率先试点建设国家公园、较早开展县域生物多样性本底调查与评估研究工作、建立了首个国家级野生生物种质资源库等, 在就地保护、迁地保护、重大生态工程等众多领域都取得显著成效。本文在梳理云南生物多样性保护进展与成就的基础上, 对保护成效进行了评估, 并有针对性地探讨了云南生物多样性保护未来发展方向及重大意义, 加强全省农业生物多样性的保护与可持续利用、发挥跨境生物多样性保护及减贫示范作用、协调发展生物多样性保护与少数民族传统知识保护等方面是云南省生物多样性保护今后发展的重要方向, 同时本文也为进一步促进云南生物多样性保护与管理提供了基础资料, 并为COP15提供地方履约实例。     

斜纹夜蛾ppie基因的克隆及表达载体构建

肽基脯氨酰基顺反异构酶E (Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase E, PPIE)是亲环蛋白家族的成员之一,具有肽基脯氨酰基顺反异构酶(Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase, PPIase)活性,能与亲环蛋白抑制剂CsA特异性结合。PPIE具有两个结构域:N-端的RNA识别域(RNA Recognition Motif, RRM)和C-端的PPIase活性域。PPIE和其他亲环蛋白一样,具有蛋白质折叠功能。研究表明,哺乳动物细胞中的PPIE能抑制流感病毒复制,能与MLL PHD3相互结合。但昆虫细胞中PPIE的功能研究较少。本文以斜纹夜蛾Spodoptera litura为研究对象,克隆得到ppie基因,通过生物信息学分析发现,斜纹夜蛾ppie基因ORF全长876 bp,共编码291个氨基酸,具有亲环蛋白家族标签:YQGSlFHRIIPDFMCQGG。构建了真核表达载体pIZT/V5-His-ppie,结果证明,构建的真核表达载体能在昆虫细胞中表达,融合蛋白大小为36 kDa左右,与预测大小一致。还通过免疫荧光实验确定,PPIE定位于细胞核中,与前人研究报道一致。本文研究内容将为进一步研究斜纹夜蛾PPIE功能奠定基础。     

基于斑块尺度的云南省景观生态安全时空演变及归因

随着人类活动的需求增强和范围扩张，建设开发、农林种植等行为不断侵占和切分原有土地系统，导致区域景观斑块小型化和破碎化，产生了诸多生态问题。云南既是我国西南生态安全屏障，同时也是生态环境比较脆弱敏感的地区，研究云南省景观生态安全及其影响因素，对区域、国家乃至国际生态安全具有重要意义。以云南省为研究对象，提出基于斑块尺度的景观生态安全评价方法评估云南省1990-2018年近三十年的景观生态安全，采用空间自相关方法分析其时空演变规律，并通过地理探测器识别影响景观生态安全的主要驱动因子。结果表明：（1）与传统生态安全评价模型相比，斑块尺度的景观生态安全模型对区域内部景观生态安全的变化更敏感，能够反映区域内部多年景观生态安全状况的细微变化。（2）云南省1990-2018年整体生态安全成本成波动上升趋势，其中"三屏两带"地区的景观生态安全状况提升明显，而滇中城市群外围以及滇东南喀斯特地带的部分区域有所下降。云南省景观生态安全的Global Moran''s I指数平均值为-0.293，区域内部斑块破碎，空间分布上具有离散性。（3）云南省景观生态安全状况目前主要受到人口密度、年平均温度和海拔高度的影响；从交互驱动方面看，云南省景观生态安全空间分布是自然和人文因子共同作用的结果，其中自然因子的交互驱动作用更明显。研究结果可为云南省景观生态安全格局优化提供理论支撑与科学依据。     

温度对优雅岐脉跳小蜂出蜂率及性比的影响

为探明温度与优雅岐脉跳小蜂出蜂率、性比间的关系,明确繁殖时利于提高该蜂出蜂率、雌性比的温度,在18℃、21℃、24℃、27℃、30℃、33℃条件下,以橡胶盔蚧为寄主,测定了不同温度下优雅岐脉跳小蜂的出蜂率及性比。结果表明:18℃-33℃,随着温度的升高,优雅岐脉跳小蜂出蜂天数由14 d增加到22 d再降到0 d,21℃时出蜂天数最长;温度与出蜂天数呈线性关系。日出蜂率随温度升高呈现出先增加至峰值后减少的钟形曲线,24℃的日出蜂率最高为48.44%,33℃的最低为0;单雌出蜂量也表现为先增加后减少的趋势,由11.02头增加到峰值59.15头,然后减少到0,21℃时出现最大值。该蜂子代具偏雌性,18℃-30℃,雌性比随着温度的升高逐渐降低,由74.24%降至53.33%。33℃恒温条件下不会羽化出蜂。综合这两项指标,21℃-24℃是繁殖该蜂的适宜温度范围。     

滇桂两省中越边境地区藓类物种多样性及区系研究

对2012~2015年间采集自滇、桂两省中越边境地区的2 600余份藓类植物标本进行物种鉴定和文献研究,分析了中越边境地区藓类植物的物种组成和区系特点,并将中越边境地区与邻近地区和国家的藓类植物进行物种丰富度、属种相似性和区系谱的比较及聚类分析。结果表明:(1)滇、桂两省中越边境地区共有藓类植物51科、155属、452种(含种下单位),其中卷边麻锦藓[Taxithelium kerianum(Broth.)Broth.]为中国新记录种。(2)中越边境地区的藓类植物共有优势科9科,优势属12属。(3)中越边境地区的藓类植物区系以热带亚洲成分所占比例最高,达31.19%,其次为东亚成分(25.46%)和北温带广布成分(13.76%)。(4)与中越边境地区的藓类植物属及种的相似性最高的分别是越南和中国贵州。(5)中越边境地区的藓类植物区系与贵州、广东、福建及台湾的亲缘关系较近。