兔出血症病毒四个分离株的病毒多肽和血清学关系研究

使用PEG-DS两相系统和超离心提纯的兔出血症病毒(RHDV)四个分离株病毒,再经Sepharose 4B柱层析进一步提纯后,得到较纯的病毒粒子,回收率可达70％以上。应用常规双向免疫扩散试验,交叉血凝抑制试验和酶联免疫吸附试验(ELISA)对四个不同地区分离株间的血清学关系进行了比较研究。结果表明实验中的四个分离株病毒均属同一血清型。SDS-PAGE结果表明,这四个分离株病毒均含有四条多肽,分子量为28—64KD。各株病毒多肽的分子量和各多肽在病毒粒子总蛋白中所占比例略有差异。因此四个分离株的RHDV在蛋白结构上可能存在地区差异。     

N端融合外源蛋白的兔出血症病毒衣壳蛋白自聚能力的研究

将兔出血症病毒衣壳蛋白VP6 0基因插入杆状病毒转移载体pBLUEBACHIS2_B的 6 HIS表达标签下游 ,与线性化野生型杆状病毒基因组DNA共转染Sf9昆虫细胞 ,经蚀斑纯化后获克隆化重组杆状病毒pBLUEBACHIS2B_VP6 0。以重组杆状病毒感染Sf9细胞 ,经SDS_PAGE和Westernblot检测显示高效表达一分子量为 6 9kD的重组蛋白 ,并且该蛋白可被兔抗RHDV高免血清识别。血凝试验表明 ,该重组蛋白可以凝集人“O”型红细胞 ,血凝价达 2 1 6 ,同时 ,该血凝性可被抗RHDV的高免血清所抑制。经电镜观察 ,重组病毒表达的融合有 6 HIS表达标签的衣壳蛋白仍可在昆虫细胞内自聚成不包裹核酸的、与天然RHDV病毒粒子在物理形态上相似的病毒样颗粒 (VLPs) ,并且该VLPs与兔抗RHDV高免血清作用后于电镜下可见凝集成团的现象 ,表明其与天然RHDV病毒粒子在抗原性上也极为相似     

草鱼出血病病毒的生长特性及高滴价培养

草鱼出血病病毒感染鱼肾(Clk)单层细胞后,产生明显的细胞病变,其繁殖周期为2—3天。病毒增殖的上升期在感染后的12—48小时。28℃下,当感染复数(Multiplicityof Infection简称MOI)为0.05PFU/cell时,病毒滴价可达1.78×10~(11)PFU/ml,不同温度(25℃、28℃、30℃)下通气培养,测定病毒滴价略有差异。感染病毒的细胞培养液经ELISA检测和电子显微镜观察均为阳性结果,并且能感染健康草鱼。     

铁蛋白基因Fth1的克隆及其在大鼠骨髓间充质干细胞中的表达

旨在构建编码大鼠铁蛋白重链多肽1(ferritin heavy chain 1,Fth1)的慢病毒,并检测其在大鼠骨髓间充质干细胞(RMSC)中的表达。PCR扩增大鼠Fth1基因,克隆至p Lenti-GFP-C慢病毒表达载体,包装慢病毒,感染RMSC细胞。荧光显微镜观察细胞内GFP荧光情况,Western blot检测Fth1的表达情况,WST-1试剂检测Fth1慢病毒感染组(RMSC-Fth1)和空载体组(RMSC-GFP)的细胞增殖活性。DNA测序结果表明,p Lenti-GFP-C-Fth1慢病毒载体构建成功。包装慢病毒感染RMSC细胞后,荧光显微镜下可见明显绿色荧光,表明感染成功。Western blot结果显示,实验组细胞裂解液中可检测到特异的Fth1表达条带。细胞增殖实验显示,与空载体组相比,过表达Fth1并不影响RMSC细胞生长。成功构建并包装携带大鼠Fth1基因的慢病毒,其能够成功感染RMSC细胞并表达Fth1蛋白,且对细胞增殖无明显影响。     

腮腺炎病毒的多肽及其在感染细胞中的合成

以差异离心和蔗糖密度梯度离心祛提纯了在鸡胚尿囊腔中繁殖的腮腺炎病毒粒子。并用SDS—PAGE分析病毒粒子的结构多肽,发现其结构多肽为11种,分子量在35K到72K之间。同时还检测到HN蛋白的多聚体和F蛋白的大亚基F1。将腮腺炎病毒分别感染Hela,Vero和CE细胞,比较这三种细胞对ME株腮腺炎病毒的敏感性,发现CE细胞是ME株的敏感宿主。用[31S]蛋氨酸标记病毒感染的CE细胞,以SDS-PAGE及放射自显影法检测到腮腺炎病毒在宿主细胞中合成了至少8种多肽,分子量在26．5K到94K之间。对这些多肽在细胞中不同时期合成情况进行了研究。还用脉冲追踪(pulsechase)技术在感染细胞中发现了FO到F这一转译后加工(Postttanslational procession)现象。此外也研究了放线菌素D和高沈度氯化钠对细胞蛋白质合成的抑制作用。     

兔出血症病毒遗传变异分析及RT—PCR检测方法的建立

目的获得兔出血症病毒（浙江分离株）近20年间遗传变异概况,建立兔出血症病毒的RT—PCR检测方法。方法对1989～2006年间的7株RHDV浙江分离株的衣壳蛋白基因（VP60）进行了克隆与测序,并与国内、外RHDV的基因组序列进行了遗传比对和分析;根据兔出血症病毒株的VP60设计引物,对20只人工感染兔的实质脏器、全血和350只实验兔全血样本进行了检测。结果7株RHDV的VP60基因均由1740个核苷酸组成,编码580个氨基酸。它们与参考序列之间的氨基酸同源性为94.0%～99.8%。系统发生树分析结果显示,RHDV可划分为2个大的基因群,浙江（中国）的RHDV分离株主要集中于C亚群。RT—PCR检测方法表明20只实验兔全部扩出预期条带,而350只实验兔全血检测中出现13只RHDV可疑样本。经血凝抑制试验检测,13例PCR阳性样品中有10个HAI阳性,3个阴性。检测敏感度达100%,特异性为99.12%,经统计检验,kappa=0.865,表明PCR检出RHDV的结果与HAI高度一致。结论RHDV基因群之间的遗传距离有逐渐加大的趋势。我们建立的RT—PCR法可用于RHDV浙江分离株的检测,用RT—PCR检测全血中RHDV方法的建立为活体检测RHDV打下了基础。     

兔出血症病毒VP60基因在昆虫细胞中形成病毒样颗粒及其特性

目的将兔出血症病毒（RHDV）VP60全长基因在昆虫细胞-杆状病毒系统中表达,验证重组蛋白形成病毒样颗粒（VLPs）的能力及其生物学特性,探讨VLPs作为检测抗原及亚单位疫苗的潜力。方法用Bac-to-Bac系统体外表达RHDVVP60全长基因。以免疫荧光及Western blotting检测蛋白表达情况及确定蛋白最佳表达条件;免疫电镜观察VLPs形态,并对VLPs的血凝性、免疫原性进行检测。结果SDS-PAGE电泳分析表明,表达的重组蛋白分子量大小约为68KDa,在免疫荧光、琼脂扩散、ELISA试验中均与RHD多克隆抗血清特异性反应;接种重组病毒的Sf9细胞裂解液在电镜下可观察到与RHDV形态相似的VLPs;该VLPs可凝集人“O”、“B”型红细胞,凝集可被RHD多克隆抗血清所抑制;含VLPs的Sf9细胞裂解液可不经纯化用作间接ELISA抗原,所建立的ELISA方法与进口商品化试剂盒相比,特异性良好,敏感性、检出率稍低;将含VLPs的细胞裂解液加氟氏佐剂免疫兔,HI效价可达1∶40,可经受致死量病毒攻击。结论RHDV-VLPs的获得及其良好的免疫原性,为RHD血清学检测试剂的标准化、亚单位疫苗研制应用奠定基础,同时在转移载体及RHDV受体方面研究亦有潜在应用价值。     

中蜂囊状幼虫病病毒核酸和多肽的研究

中蜂囊状幼虫病病毒(CSBV)核酸经聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)和琼脂糖凝胶电泳(AGE)分析,表明为单链RNA,易于降解;CSBV结构多肽经SDS-PAGE分析,有3个多肽,其分子量分别为27,000、29,000、39,000道尔顿。此病毒RNA和多肽与意蜂囊状幼虫病病毒(SBV)有差异。     

Ⅱ型单纯疱疹病毒感染细胞的扫描与透射电镜对比观察

以感染复数为3的 HSV—Ⅱ(333株)感染兔婴肾单层细胞,不同间隔时间取材作扫描(SEM)及透射电镜(TEM)观察。感染1小时后,SEM 下显示细胞表面有大量病毒颗粒吸附,颗粒均匀分布或积聚成簇,多数病毒颗粒有囊膜,少数无囊膜。感染2小时后,变化与上基本类似,但有少数细胞变园。感染4小时后,变园的细胞数量增多,在此种细胞的核周区及边缘区积聚有大量病毒颗粒,而核上区则仅见少量散在的病毒颗粒,感染16小时后,部分细胞表面出现大小及形状不规则的孔洞;部分细胞解体成碎片,在孔洞边缘及细胞碎片中,可见有囊膜及无囊膜的病毒颗粒。病毒感染1—2小时后,TEM 下可见有囊膜及无囊膜的病毒颗粒吸附于细胞表面,随后在细胞表面的凹陷及胞浆小泡中,亦可见到类似的病毒颗粒。感染4小时以内的细胞超微结构变化主要有:髓膜的形成,线粒体肿胀,粗面内质网腔扩张及染色质边聚。感染16小时后,细胞呈现严重的变性及解体,在细胞碎片中,亦可见到有囊膜及无囊膜的病毒颗粒。对病毒的吸附,穿入,释放等问题进行了讨论.     

在昆虫细胞中表达能自聚成病毒样颗粒的兔出血症病毒衣壳蛋白

将兔出血症病毒衣壳蛋白VP60基因插入杆状病毒转移载体pBLUEBAC 4,获得重组转移载体pBLUEBAC4-VP60.在脂质体转染试剂介导下,将重组杆状病毒转移载体pBLUEBAC4-VP60 与线性化的野生型杆状病毒基因组DNA共转染对数生长期的Sf9昆虫细胞,经过三轮蚀斑纯化后,获得了克隆化的重组杆状病毒pBLUEBAC4-VP60.以重组杆状病毒感染Sf9细胞后,收获细胞培养上清和细胞裂解液上清,SDS-PAGE电泳分析显示,重组病毒pBLUEBAC4-VP60表达一分子量各为60kD左右的特异性重组蛋白,并且该重组蛋白经Western blot检测,皆可被兔抗RHDV高免血清所识别,表明VP60蛋白基因在重组杆状病毒感染的Sf9昆虫细胞中得到了表达,并且具有与天然VP60相似的抗原性.血凝试验表明,表达的重组蛋白具有血凝特性,可以凝集人"O"型红细胞,血凝价为213.同时,该血凝性可被抗RHDV的高免血清所抑制.经电镜观察,重组病毒表达的衣壳蛋白可以在没有其他任何成分存在的条件下,在昆虫细胞内也能自然聚合成不包裹核酸的、与天然RHDV病毒粒子在物理形态上类似的病毒样颗粒(VLPs).在与兔抗RHDV高免血清37℃作用1h后,该病毒样颗粒于电镜下观察可出现凝集成团的现象,表明该VLPs与天然RHDV在抗原性上也极为相似.