BMP9通过ALK1/2信号通路诱导肝祖细胞成熟分化的作用研究

该研究探讨了骨形态发生蛋白9(BMP9)通过ALK1/2信号通路诱导肝祖细胞成熟分化的作用。通过腺病毒介导siALK1和siALK2感染肝祖细胞14-19(hepatic progenitor cell 14-19,HP14-19),Real-time PCR及Western blot分别检测ALK1及ALK2的表达,荧光素酶报告基因检测ALB-Gluc活性,Real-time PCR检测肝脏相关基因AFP、ALB、CK18、ApoB的mRNA水平表达,PAS染色和ICG摄取实验检测肝细胞的代谢及糖原合成功能。结果显示,腺病毒介导的siALK1和siALK2可特异性抑制HP14-19细胞内ALK1和ALK2的表达,BMP9可诱导HP14-19的成熟分化,细胞形态呈现多角形铺路石样,ALB-Gluc读数显著增加,肝干细胞标志物AFP下调,成熟肝细胞标志物ALB、CK18及ApoB表达显著上调,ICG和PAS染色阳性细胞数增多,Ad-siALK1和Ad-siALK2组,肝细胞标志物表达下降,解毒代谢及糖原合成能力下降。总之,BMP9可通过ALK1/2信号通路诱导肝祖细胞成熟分化。     

TGF-β1信号在成纤维细胞促血管生成中作用的研究

该研究旨在探讨转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)信号在成纤维细胞促血管生成中的作用。实验通过ELISA检测了Hepa1-6细胞上清液中TGF-β1的含量。将胎鼠成纤维细胞分三组,分别用普通培养液(DMEM/F12组)、含Hepa1-6细胞上清液的条件培养液(Hepa1-6组)以及加入1μmol/L TGF-β1受体抑制剂(GW788388)的条件培养液(GWHepa1-6组)培养。采用免疫荧光双染法、q PCR检测培养的成纤维细胞中α-平滑肌肌动蛋白(alpha-smooth muscle actin,α-SMA)、血管内皮生长因子A(vascular endothelial growth factor A,VEGFA)的蛋白质及m RNA表达水平。采用基质胶(Matrigel)血管形成实验检测成纤维细胞上清液作用下EA.hy 926细胞的血管形成能力。ELISA结果显示,与DMEM/F12相比,Hepa1-6细胞上清液中TGF-β1表达量明显升高(P0.01)。免疫荧光双染法和q PCR结果显示,与DMEM/F12组和GWHepa1-6组比较,Hepa1-6组成纤维细胞中α-SMA和VEGFA蛋白质及m RNA相对水平明显增加(P0.01),且在第5 d时达最高,其上清液诱导EA.hy 926细胞的血管形成能力明显增强(P0.01)。该研究表明,TGF-β1信号通路可以诱导成纤维细胞α-SMA和VEGFA的表达,进而促进EA.hy 926细胞形成小管样结构。     

全反式维甲酸促进骨形态发生蛋白9诱导肝祖细胞成熟分化的作用研究

该文研究了全反式维甲酸(all-trans retinoic acid,ATRA)促进骨形态发生蛋白9(bone morphogenetic protein 9,BMP9)诱导肝祖细胞14-19(hepatic progenitor cell 14-19,HP14-19)成熟分化的作用。重组腺病毒Ad-BMP9和ATRA单独及联合作用诱导肝祖细胞HP14-19成熟分化,荧光素酶报告基因检测ALB-Gluc表达情况,Real-time PCR检测肝脏相关基因DLK、AFP、ALB和TAT的mRNA水平,Western blot及免疫荧光检测AFP、ALB、CK18和UGT1A蛋白质水平,PAS染色和ICG摄取实验检测成熟分化后的功能。Ad-BMP9组和ATRA组的ALB-Gluc活性较对照组增高,而AdBMP9+ATRA组ALB-Gluc活性又显著高于Ad-BMP9组和ATRA组。Ad-BMP9+ATRA组的ALB和TAT mRNA水平以及ALB、CK18和UGT1A蛋白质水平均高于Ad-BMP9组和ATRA组,但肝干细胞标志DLK、AFP的表达均降低(P0.05)。Ad-BMP9+ATRA组的ICG摄取及PAS染色阳性细胞数显著高于Ad-BMP9组和ATRA组。ATRA和Ad-BMP9均诱导肝祖细胞HP14-19成熟分化,联合作用强于单独作用。     

茵陈四苓颗粒对肝衰竭环境下骨髓间充质干细胞分化及IDO蛋白表达的影响

目的:研究肝衰竭体外模型环境下茵陈四苓颗粒对骨髓间充质干细胞的肝向分化及IDO蛋白表达的影响。方法:通过建立肝衰竭血清、中药干预血清、健康血清分别与骨髓间充质干细胞(BMSCs)共培养体系,检测BMSCs中CK18免疫荧光表达,Western-blot法检测甲胎蛋白(AFP)、肝组织白蛋白(ALB)、吲哚胺2,3—双加氧酶(IDO)蛋白表达。结果:1、CK18免疫荧光结果显示肝衰竭组及中药干预组染色均为弱阳性,但后者染色更强,而健康组无阳性染色;2、AFP、ALB在健康组、肝衰竭组、中药干预组均有表达,且各组间ALB比较均有差异(P0.05),三组AFP表达水平逐渐增高,各组间差异有统计学意义。IDO蛋白在健康组无表达,肝衰竭组表达低于中药干预组,且两组间差异具有统计学意义。结论:茵陈四苓颗粒能增强BMSCs在肝衰竭环境下的肝向分化趋势及免疫调节活性。     

ES细胞体外定向分化为成熟肝细胞的实验研究

探讨了肝细胞在胚胎干细胞（ES cell）体外诱导分化系统中成熟分化的条件、机制及其鉴定方法.利用TGF, bFGF、HGF等细胞生长因子进行BALB/c小鼠ES细胞向肝细胞方向的定向诱导.利用反转录聚合酶链反应（RT-PCR）、免疫细胞化学（ICC）和放射免疫法（RIA）动态检测肝细胞特异性基因和蛋白AFP,ALB,G6P,TAT,CK8, CK18等在培养体系中的表达,并测定肝细胞的尿素合成功能,最后测定肝细胞分化率.结果,肝细胞特异基因AFP, ALB,G6P和TAT最早分别于第3、9、11、13天表达,肝细胞特异蛋白AFP,CK8,CK18和ALB最早分别于第7、9、9和11天开始表达.第12天开始检测到尿素出现,浓度为8.3 μmol/L,并随培养时间延长而浓度逐渐增加.最后,测得生长因子诱导组肝细胞的分化率为32％,对照组肝细胞分化率为8%.说明肝细胞可以在ES细胞体外诱导分化系统中出现并成熟分化,bFGF、HGF、OSM等可以明显提高细胞分化率和成熟度,有望成为解决肝功能替代疗法中细胞来源问题的新希望.     

稳定表达ALB启动子及荧光素酶报告基因的肝干细胞株的构建

目的构建稳定表达ALB启动子及荧光素酶报告基因的肝干细胞株。方法PCR扩增获得ALB启动子,并与pBGLuc连接获得携带ALB启动子及荧光素酶报告基因的pBGLuc—ALB质粒,脂质体转染质粒到不同细胞,ALB—GLuc活性检测功能。构建逆转录病毒,感染HP14．5肝干细胞株获得携带ALB启动子及荧光素酶报告基因的稳定细胞株,经Dex、HGF体外诱导后第3、6、9、12天ALB—GLuc检测荧光素酶活性,免疫荧光检测ALB的表达。结果PCR、酶切及测序结果显示ALB启动子正确插入至荧光素酶GLuc基因上游,HEK293、HP14．5、LC14d及Hepa1-6细胞中ALB—GLuc活性与免疫荧光结果一致。HP14．5ALB—Gluc稳定细胞株在高浓度的稻瘟菌素中存活,免疫荧光结果显示Dex、HGF诱导后细胞中ALB的表达逐渐增强,并与ALB—Gluc活性升高一致。结论成功构建了稳定表达ALB启动子及荧光素酶报告基因的肝干细胞株,为研究肝干细胞的体外成熟分化提供了重要的细胞手段。     

体外分步诱导猕猴胚胎干细胞为肝细胞

采用分阶段诱导方法模拟肝细胞体内发育,建立体外诱导猕猴胚胎干细胞（rhesus monkey embryonic stem cells, rESCs）分化为成熟肝细胞的体系,对研究以ES细胞为基础的临床替代治疗人类晚期肝脏疾病具有重要的意义。将rESCs团块在含有10% FBS的DMEM培养基中悬浮培养11d,形成含有早期内胚层细胞的拟胚体（embryonic bodies, EB）并开始表达早期肝细胞的部分基因或蛋白,将11日龄EB接种至包被有ECM的组织培养皿,分阶段加入aFGF、BMP-4及OSM。经aFGF和BMP-4诱导7～10d后,分化细胞形态变为具有双核的多角形细胞,表达早期和中期肝细胞特异性的蛋白（AFP、ALB及CK18）和基因（AFP、ALB、APOH,G-6-P及TAT）,并具有储存糖原的功能。撤除aFGF和BMP-4,添加OSM继续诱导7～10 d,分化的细胞表达成熟肝细胞所特有基因CYP1B1和ADH1C,并具有摄取靛青绿的能力。     

低浓度血清促进胚胎肝祖细胞诱导分化

为了探讨不同血清浓度诱导培养条件下对体外诱导胚胎肝祖细胞成熟分化的影响。本研究选用含有10%FBS、5%FBS、2%FBS的DMEM/HGF/FGF4肝细胞培养基体外诱导胚胎肝祖细胞的成熟分化,分别于诱导后0d、3d、6d、9d、12dALB-GLuc检测细胞白蛋白的合成水平,细胞计数检测细胞的成长曲线。RT-PCR检测肝细胞相关标志DLK、AFP、CK18,免疫荧光检测ALB、UGT1A的表达情况。ICG摄取和尿素氮检测肝细胞成熟功能。诱导后第三天,ALB-GLuc开始增高,于第9天达高峰,2%FBS组ALB-GLuc读数最高。生长曲线显示低血清浓度下细胞的增殖速度明显慢于高血清浓度。RT-PCR和免疫荧光结果显示诱导后第9天,3个诱导组DLK、AFP表达低于无诱导组,CK18、ALB、UGT1A均高于无诱导组,2%FBS组差异最显著。3个诱导组的肝细胞ICG摄取能力明显增高,2%FBS组ICG阳性细胞数为(60.2±9.0)%,明显高于5%FBS(45.0±3.6)%及10%FBS组(35.2±2.9)%,诱导后肝细胞的尿素合成功能增强,尤其是2%FBS组。低浓度血清培养条件能更好的诱导胚胎肝祖细胞的体外成熟分化。     

干扰Sema7A抑制C2C12成肌细胞的增殖和分化

为研究脑信号蛋白家族（Semaphorins）成员Sema7A对成肌细胞增殖和分化的影响,本文设计并合成了Sema7A基因的小干扰RNA（small interfering RNA,siRNA）,用此siRNA转染C2C12成肌细胞．通过Hoechst核染和流式细胞术检测细胞增殖情况,免疫荧光检测肌管的形成情况,real-time qPCR和Western印迹技术检测成肌标记基因的变化.结果显示,干扰Sema7A后,C2C12成肌细胞增殖减慢,处在G2和S期的细胞所占的比例明显下降,而G1期细胞的比例升高．免疫荧光检测结果显示,干扰Sema7A后,肌管的直径及MyHC+细胞所占比例均显著降低．Real-time qPCR和Western印迹结果也显示,肌肉分化标志基因MyoD、MyoG、MyHC的mRNA及蛋白质表达均下降．进一步检测Sema7A受体下游信号通路发现,干扰Sema7A后,其下游信号分子PI3K和AKT的磷酸化水平被下调．以上结果表明,Sema7A可以调节C2C12成肌细胞的增殖和分化,可能是通过其受体作用于PI3K/AKT信号通路实现的,这为进一步研究Sema7A在骨骼肌发育中的作用提供实验基础.     

全反式维甲酸调控自噬促进肝祖细胞成熟分化的作用研究

该研究探讨全反式维甲酸(all-trans retinoic acid,ATRA)体外诱导小鼠胚胎肝祖细胞HP14-19细胞成熟分化及ATRA对细胞自噬水平的调控作用。应用1μmol/L ATRA处理小鼠胚胎肝祖细胞HP14-19细胞,不同时间点进行荧光素酶报告基因检测ALB-Gluc活性,Real-time PCR检测肝细胞相关标志基因的表达,吲哚菁绿(indocyanine green,ICG)及过碘酸–希夫(periodicacid-schiff,PAS)染色检测细胞的成熟功能;透射电镜观察自噬体及细胞连接,ptf LC3质粒转染细胞,激光共聚焦显微镜观察自噬流,Western blot检测自噬相关标志蛋白质水平等综合分析自噬的变化情况。结果显示,与对照组相比,ATRA可显著增强HP14-19细胞ALB-Gluc活性,抑制肝前体细胞标志DLK和AFP的表达,促进成熟肝细胞标志ALB、CK18、TAT和Apo B的表达,ICG及PAS染色阳性细胞数显著增多(P0.05);透射电镜结果可见ATRA诱导组出现大量自噬体和自噬溶酶体,同时细胞间紧密连接增多,并且自噬相关标志蛋白质Beclin1、LC3-II、RAB7水平增高,P62水平无显著变化,LC3-II/LC3-I的比值明显增加(P0.05);激光共聚焦显微镜可见ATRA组细胞质内黄色斑点的自噬体及红色斑点的自噬溶酶体均较对照组明显增多,自噬抑制剂3-MA和Baflomycin可抑制ATRA诱导的HP14-19细胞的ICG摄取和糖原合成功能。综上所述,ATRA可能通过调节细胞自噬水平有效诱导小鼠胚胎肝祖细胞的分化成熟。     

Indocyanine Green Uptake and Periodic Acid–Schiff Staining Method for Function Detection of Liver Cells are Affected by Different Cell Confluence

Hepatic stem cell transplantation has been demonstrated as an effective alternative therapy for the end-stage liver failure patients. Therefore, the functional detection of hepatic stem cell is essentially required. The present study confirmed that adenovirus BMP9 (Ad-BMP9) could increase the ALB-Gluc activity of HP14-19 hepatic progenitor cells, the expression of specific hepatic markers ALB, TAT, UGT1A were up-regulated while the hepatic stem cell markers DLK, AFP were down-regulated, and the number of positive Periodic acid-Schiff (PAS) stained cells were significantly higher than those in control group. However, the indocyanine green (ICG) uptake failed to be detectable in induced hepatocytes, which was inconsistent. By using another cell line LC14d, we found out that positive ICG uptake cells were located in the area of low cell density, while positive PAS stained cells were mainly concentrated in the area where cells were overlapped, indicating that different cell confluence might affect the outcomes of ICG uptake and PAS staining. A manual wound healing of Ad-BMP9 induced HP14-19 cells was made, the crawling cells were stained positive for ICG but not for PAS. Therefore, our finding may provide evidence for better application of PAS staining and ICG uptake assay in functional detection of mature hepatocytes.Supplementary InformationThe online version contains supplementary material available at 10.1007/s10616-021-00453-8.     

波动性高糖对肾小管上皮细胞Wnt／β-catenin信号途径的影响

肾脏纤维化分为肾小球硬化和肾小管间质纤维化（tubular interstitial fibrosis,TIF）,而TIF过程与肾损伤具有密切的关系。TIF是由于细胞外基质的过度沉积造成的,肌成纤维细胞是TIF发生发展过程中产生细胞外基质的主要细胞,该过程被成纤维细胞激活,涉及上皮细胞向肌成纤维细胞的转分化^[1-2]。Wnt／β-catenin信号途径涉及细胞增殖、肿瘤发生与转移的调控。β-catenin是Wnt信号途径的关键分子,在细胞的生长与分化过程中起着重要的作用,     

PAS染色在骨骼肌糖原贮积症诊断中的应用

目的探讨PAS染色在骨骼肌糖原贮积症诊断中的作用。方法用组织化学方法高碘酸-schiff(periodic acid schiff,PAS)染色方法显示糖原贮积症肌纤维胞浆内糖原的贮积。结果糖原贮积症患者肌纤维胞浆内聚集的红至红紫色颗粒为糖原。结论 PAS染色对于判断细胞内糖原贮积的糖原病和多糖体贮积性疾病的诊断是必要的。     

复方861对大鼠肝脏卵圆细胞分化的影响

目的探讨复方861对大鼠肝脏卵圆细胞分化的影响,了解其在肝纤维化治疗过程中促进肝细胞再生的可能机制。方法不同浓度(1.95,3.90,7.81,15.62,31.25,62.50,125,250,500,1000μg/mL)的复方861在无血清培养条件下作用于WB-F344细胞24 h,MTT法分析法检测细胞生长情况。500μg/mL复方861在无血清条件下作用WB-F344细胞72 h后,通过RT-PCR观察CK-19、AFP、ALB、αmRNA表达的变化。以同期未作处理的WB-F344作为空白对照组。结果 WB-F344细胞经过不同复方861作用后,除1000μg/mL外,各组细胞生长均未受到抑制,500μg/mL时细胞生存活性最佳。无血清条件下作用72 h后,半定量RT-PCR发现861组AFP mRNA的表达显著增加,CK-19 mRNA的表达显著减少,同时发现861组有ALB mRNA的表达。结论复方861可能诱导WB-F344细胞主要向肝细胞方向分化。     

EGFR信号通路在SiO2诱导肺上皮细胞间质转化中的作用机制

目的：在二氧化硅（SiO2）刺激下可引起肺部一系列的炎症反应及其伴随相关的成纤维细胞增殖,然而EGFR信号通路可维持细胞增殖、分化和凋亡的平衡,因此,我们可以设想EGFR信号通路是否在肺纤维化的发生发展中起到重要的作用。本实验探讨SiO2是否能诱导人肺上皮细胞（A549）发生上皮间质转化,并且研究EGFR信号通路在矽肺纤维化中的作用机制。方法：以A549为研究对象,用0（对照组）、50、100、200μg／mlSiO2孵育A549,作用48h后于倒置显微镜观察细胞形态学改变,并收集不同时段细胞,采用实时荧光定量PCR（RT-PCR）检测E-钙黏蛋白（E-cadherin）和α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）mRNA表达变化,细胞免疫荧光方法检测E-cadllerin、α-SMA及信号转导蛋白EGFR表达的变化。结果：倒置显微镜观察A549经SiO2处理后细胞形态由鹅卵石状转变为纺锤型或梭型,形态似成纤维细胞,随着SiO2浓度的升高,E-cadmRNA和蛋白表达逐渐下调,在200μg／ml组表达最低,α-SMAmRNA和蛋白表达逐渐上调,200μg／ml组α-SMA表达最高;EGFR蛋白表达上调;50、100、200μg／ml与对照组的差异具有统计学学意义（P〈0．05）。结论：SiO2可诱导肺上皮细胞向间质细胞转化,其机制可能与EGFR信号通路有关。     

AFP的亚细胞定位及对肿瘤细胞生长的影响

目的观察甲胎蛋白（AFP）在不同肿瘤细胞中的亚细胞定位及对肿瘤细胞生长的影响。方法运用免疫荧光的方法观察内源性AFP在HeI。a细胞、QGY-7703细胞、MCF-7细胞中的亚细胞定位。将构建的表达AFP的质粒pcDNA3-AFP及AFP腺病毒siRNA干涉载体Adv—AFPsiRNA作用于QGY-7703细胞,MCF-7细胞,运用M1Tr,集落形成实验检测细胞增殖状况。结果免疫荧光显示,内源性的AFP在HeLa细胞、QGY-7703细胞、MCF-7细胞均只在细胞质中表达。pcDNA3-AFP使QGY-7703的细胞活性增加了2l％（P〈0．05）及集落形成能力增加了32％（P〈0．01）,MCF-7实验组比对照组细胞活性降低了30％（P〈0．01）．克隆形成能力降低82％（P〈0．01）。Adv—AFPsiRNA使QGY-7703的细胞活性降低了22％（P〈0．05）,平均克隆形成能力降低52％（P〈0．01）,MCF-7细胞活性提高了24．5％（P〈0．05）,克隆形成能力提高了89％（P〈O．01）。结论内源性的AFP只在细胞质中表达。AFP能促进QGY-7703细胞的增殖及克隆形成能力,而在MCF-7细胞中发挥相反的作用。腺病毒介导的内源性的AFP表达的下调能降低QGY-7703的增殖,却增加了MCF-7的细胞活性及克隆形成能力。     

不同浓度TGF-β1对肺泡II型细胞系MLE-12表型及功能的影响

探讨不同浓度及不同时间点TGF-β1对肺泡II型上皮细胞（AECII）表型及功能的影响。小鼠肺泡II型细胞系MLE-12,随机分为：对照组（0ng／mL）、低浓度组（0．1ng／mL）、中浓度组（1ng／mL）和高浓度组（10ng／mL）。应用细胞免疫荧光双标法及荧光定量PCR法观察各组12,24,48,72h细胞形态变化、AECII标记（肺表面活性物质蛋白B,SP—B）及成纤维细胞标记（成纤维细胞特异性蛋白1,FSP—1）蛋白及mRNA的表达情况。结果表明,随着TGF—β1干预时间的延长及浓度的升高,AECII逐渐由鹅卵石样变成纺锤体形状,获得成纤维细胞样外观。蛋白水平,AECII标记SP-B表达逐渐减弱,成纤维细胞标记FSP-1表达逐渐增强,48h中浓度组及24h高浓度组两者可见明显的共表达,同时,其SP-BmRNA表达较同时间对照组下调,而FSP1 mRNA表达较同时间对照组上调。低浓度组各时间点上述表现不明显。TGF—β1促使AECII向成纤维细胞转化（EMT）,且具有时间及浓度依赖性。     

小鼠精原干细胞在三种培养基中的生长行为

目的：建立小鼠精原干细胞（SSCs）的体外长期培养体系。方法：用分别添加了等量的胶质细胞源神经营养因子（GDNF）、可溶性GFRα1和hFGF的DMEM／F12、KSR和StemPro-34 SFM三种无血清培养基和MEF饲养层分别培养经差异贴壁分选富集的小鼠SSCs,通过形态观察、标志基因的RT-PCR和免疫细胞化学分析检测其SSCs本原。结果：DMEM／F12与KSR可支持小鼠SSCs在体外存活6-7d,而StemPro-34 SFM能能维持SSCs体外增值一个月。结论：StemPro-34 SFM支持小鼠SSCs的体外增殖。