小麦6B染色体微切割及其不同片段的DNA文库构建

用Nd∶YAG激光微束将处于有丝分裂中期的小麦(Triticum aestivum L.)6B染色体微切割为四段,并用微细玻璃针将每个片段分别回收。将分离的染色体片段DNA用Sau3A接头介导的多聚酶链式反应(LA-PCR)分别扩增。Southern杂交证明4个特定区域的DNA确实来自于小麦基因组。用一系列(42对引物)位于6B染色体和其他染色体上的微卫星序列对微切割的染色体片段的PCR产物进行了验证。结果表明,获得的染色体片段的PCR产物来自于小麦6B染色体。将6B染色体4个片段的第二轮PCR产物克隆到pGEMT-vector中,建立了4个染色体特定区域的基因组文库,命名为R1、R2、R3和R4,分别包含2.1×10~5、2.74×10~5、2.45×10~5和2.93×10~5个重组子克隆。每个文库均随机挑选150个克隆进行质粒的小量制备和酶切验证。结果显示:插入片段大小在300～1800 bp之间,平均大小为820～870 bp,其中43％～48％的克隆为低/单拷贝序列,42％～47％为中/高拷贝序列。本研究为详细分析植物单染色体的不同片段的分子遗传学研究提供了基础。     

小麦6B染色体微切割及其不同片段的DNA文库构建

用Nd:YAG激光微束将处于丝分裂中期的小麦(Triticum aestivum L.)6B染色体微切割为四段,并用微细玻璃针将每个片段分别回收.将分离的染色体片段DNA用Sau3A接头介导的多聚酶链式反应(LA-PCR)分别扩增.Southem杂交证明4个特定区域的DNA确实来自于小麦基因组.用一系列(42对引物)位于6B染色体上的微卫星序列对微切割的染色体片段的PCR产物进行了验证.结果表明,获得的染色体片段的PCR产物来自于小麦6B染色体.将6B染色体4个片段的第二轮PCR产物克隆到pGET-vector中,建立了4个染色体特定区域的基因组文库,命名为R1、R2、R3和R4,分别包含2.1×105、2.74×105和2.93×105个重组子克隆.每个文库均随机挑选150个克隆进行质粒的小量制备和酶切验证.结果显示;插入片段大小在300～1800之间,平均大小为820～870bp,其中43%～48%的克隆为低/单拷贝序列,42%～47%为中/高拷贝序列.本研究为详细分析植物单染色体的不同片段的分子遗传学研究提供了基础.     

水仙单染色体特异文库的构建

采用玻璃针分离法,通过显微操作系统成功地分离到一个多花水仙(N arcissus tazetta L.,2n=22)品种的中着丝粒单染色体,将分离到的单染色体放入0.2 mL Eppendorf管中,经去蛋白、S au3A酶切,并在染色体DNA片段两端加上S au3A人工接头后,进行两轮PCR扩增,得到0.3~3.0 kb之间的DNA片段.用水仙基因组DNA标记作探针,与扩增产物进行Sou thern杂交,从而证明单染色体DNA确实已被成功地扩增.将第二轮PCR产物构建质粒文库,随机挑取90个重组子进行分析,发现插入片段主要在600~2 500 bp之间.     

番木瓜单染色体的显微分离与克隆

用玻璃针显微分离出番木瓜(CaricapapayaL.)单染色体,经过LA-PCR扩增得到80-700bp的DNA片段。Southern杂交表明,扩增片段与番木瓜基因组DNA之间有同源性,从而证明番木瓜单染色体DNA已经被成功扩增。将扩增产物克隆到pGEM-T-Easy载体中,约获得1.18×105个克隆,酶切鉴定插入片段大小为100-400bp。     

内葵杂3号染色体核型分析

对内蒙古地区的栽培品种内葵杂3号三交种和单交种了进行了核型分析。其结果为:内葵杂3号三交种和单交种的染色体数均为2n=34,各具一对随体染色体。三交种第2对染色体具随体且为近中部着丝粒染色体,其余为中部着丝粒染色体,染色体相对长度变异范围4.105%～7.703%,核型公式为2n=2x=34=32m+2sm(2sat),核型类型属于1A型;单交种均为中部着丝粒染色体,第4对染色体具随体,染色体相对长度变异范围3.661%～8.128%,其核型公式为:2n=2x=34=34m(2sat),核型类型属于1B型。     

对微分离的大豆单染色体的克隆及其PCR产物的原位杂交分析(英文)

通过玻璃针分离法从大豆 (GlycinemaxL .)根尖细胞中期分裂相中显微分离出一条染色体 ,经Sau3A人工接头介导的两轮PCR后 ,将其第二轮扩增产物克隆到质粒载体上 ,构建了单染色体质粒文库。经分析 ,该微克隆文库包含约 2 0 0 0 0 0个重组子。随机挑选 1 78个重组子进行鉴定 ,证明该文库的插入片段主要介于 2 0 0～ 1 80 0bp之间 ,平均大小 830bp ;其中 ,中、高拷贝重复序列占 44% ,单、低拷贝序列占 56%。微分离染色体体外扩增产物的原位杂交分析表明它们来自于大豆基因组 ,然而却未能将其只标记在该条微分离的染色体上     

黑麦1R染色体微克隆文库的构建与分析

通过玻璃针分离法 ,从黑麦 (SecalecerealeL .)根尖细胞中期分裂相中显微分离出 2条及 5条 1R染色体。经Sau3A接头介导的PCR(LA_PCR)方法对其进行体外扩增 ,得到了 0 .3～ 2 .5kb之间的DNA片段。以DIG标记的探针进行多次Southern杂交 ,证明显微分离出的染色体的体外扩增产物与黑麦基因组DNA同源 ,并且来自 1R染色体。然后利用 5条 1R染色体的第二轮PCR产物构建质粒文库 ,可得到 2 2 0 0 0 0个重组子。随机挑选 172个重组子进行分析 ,发现插入片段主要介于 30 0～ 180 0bp之间。此外 ,根据基因组点杂交结果推算出该文库包含约 42 %的中、高重复序列和 5 8%的单、低拷贝序列 ,而且文库的冗余度较低。研究构建的黑麦 1R染色体微克隆文库为 1R染色体高密度遗传图谱的建立以及位于其上的重要基因的定位与分离提供了便利。     

利用微分离黑麦IR染色体的体外扩增产物进行染色体着染研究

首先对显微分离出的黑麦（Ｓｅｃａｌｅｃｅｒｅａｌｅ．Ｌ．）１Ｒ染色体进行了两轮Ｓａｕ３Ａ连接接头介导的ＰＣＲ扩增（ＬＡＰＣＲ）经Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交证实这些染色体扩增片段来源于基因组ＤＮＡ之后,再利用ＩＲ染色体的第二轮扩增产物,黑麦基因组ＤＮＡ,ｒＤＮＡ基因为探针,与其根尖细胞中期分裂相进行染色体原位杂交,发现微分离的ＩＲ当色体体我扩增产物中包含大量的非该染色体特异性重复序列,而其信息量却较黑麦总     

向日葵rRNA基因克隆及其染色体定位研究

该研究以内葵杂3号三交种为材料,采用同源序列法克隆了5SrRNA和18SrRNA基因并进行了序列测定,测得片段长度分别为515bp和1808bp。以5SrRNA、18SrRNA和45SrRNA基因为探针,分别与内葵杂3号三交种染色体进行荧光原位杂交（FISH）分析。结果表明：45SrRNA和18SrRNA基因均得到3对杂交信号且位点分布相同,分别位于第3对和第10对染色体及第2对随体染色体的短臂末端;5SrRNA基因的信号位点共有2对,分布在第7对和第10对染色体短臂端部。     

通过微切一扩增建立植物(蚕豆Vicia faba)染色体区段特异性基因文库研究初探

以蚕豆（Viciafaba,2n=12）根尖为材料,采用改良方法制备染色体标本,在光镜下切割分离一段大M染色体核仁组织区（NOR）特定区段（约合0．9pgDNA）,通过单一引物一聚合酶链式反应法（SingleUniquePrimer-PCR）随机扩增微切DNA后,获得近60μgDNA。经琼脂糖电泳分析测定扩增产物分子片段大小介于200-900bp。以地高新（Digoxigenin）标记蚕豆总体DNA,作为探针与扩增产物进行Southern杂交,证实扩增得到的DNA与蚕豆DNA同源,来自做切染色体。部分扩增产物经ECORI酶切后,连人经同酶切割后的pUC18载体质粒,转化大肠杆菌（EcoliJM109）。琼脂糖电泳分析得到的部分克隆,得知插人子长度介于0．25-0．9kb。本文将用于动物材料的单一引物一聚合酶链式反应法应用于植物染色体的微切微扩增,并作了一定程度简化,初步建立起一套包括微切、扩增、检测和克隆的便捷、经济的实验室制备植物染色体区域特异性基因文库的方法。     

黄鳝单条染色体的显微分离及特异性检测

建立了显微分离黄鳝单条染色体及检测其特异性的方法;在Olympus倒置显微镜下用毛细玻璃微针手工分离黄鳝减数分裂Ⅰ终变期3号染色体,将期DNA作模板进行DOP-PCR扩增后,分别以α^-32P-dCTP和Biotin-11-dUTP标记的单条染色体DNAPCR扩增产物及Biotin-11-dUTP标记的大豆18SrRNA基因作探针进行Southern杂交,FISH和Dot杂交来检测其特异性,结果表明：（1）减数分裂Ⅰ终变期染色体标本是进行染色体显微操作的理想材料;（2）DOP-PCR扩增产物片段在200-1000bp之间,平均600bp左右;（3）杂交结果显示,本研究所获得的单条染色体是黄鳝3号染色体;（4）与显微操作仪和微激光分离相比较。该方法不需要昂贵仪器,在常规实验室即可操作,具有广泛的普及应用意义。     

染色体特异DNA文库的构建与鉴定

为构建人类21号染色体特异DNA文库, 以应用于人类遗传疾病的鉴定和研究, 文章采用循环温度梯度法溶解释放微分离的人外周血细胞21号染色体DNA, 将其进行简并寡核苷酸引物PCR(Degenerate oligo nucleotide primer-PCR, DOP-PCR)扩增后, 利用100~500 bp和500~2 000 bp分段回收纯化的两种不同片段大小的DOP-PCR产物构建染色体特异DNA文库, 并分别采用荧光原位杂交(Florescence in situ hybridization, FISH)和斑点杂交对DOP-PCR产物的来源和随机取样的文库克隆进行检测以评估所构建DNA文库的特异性。结果表明: 循环温度梯度法能有效溶解释放微分离的21号染色体DNA; 通过对DOP-PCR产物的分段回收纯化和克隆, 增加了大片段DNA的连接效率; 利用FISH技术和斑点杂交双重鉴定实验证明了文库的特异性, 从而构建了21号染色体特异的DNA文库, 并建立了构建染色体特异DNA文库及检测其特异性的方法, 为21号染色相关遗传疾病的鉴定和研究奠定了基础。     

杉木种子随体染色体SCAR标记的建立

回收、纯化由引物OPB07(5’-GGTGACGCAG-3’) OPB18(5’-CCACAGCAGT-3’)扩增而得的杉木(Cunninghamia lanceolata(Lamb.)Hook)种子随体染色体特异性RAPD(随机扩增的DNA多态性分析)片段OPB07-18907,将该片段克隆至pUCm-T载体,转化受体菌后筛选出阳性克隆,并对插入片段进行测序,根据序列特点设计两对SCAR(序列特异性扩增区)引物,PCR结果显示,这两对引物的4种组合都可以扩增出属于随体染色体的特征带,适宜退火温度为57℃。成功将特异RAPD标记OPB07-18907转化为稳定的SCAR标记。开发随体染色体SCAR标记目的是:一方面能在分子水平上鉴定微分离的杉木随体染色体,另一方面,也可以将杉木已构建的遗传图谱中连锁群与染色体进行对应。探讨了该SCAR标记对杉木核型分析的作用。     

玉米单染色体的分离和体外扩增

建立了玉米单染色体的分离及体外扩增的方法。取95％乙醇固定后经果胶酶和纤维酶酶解的根尖制备染色体标本,用自制的微细玻璃针在倒置显微镜下挑取目的染色体。染色体DNA经Sau3A酶切后与人工合成的Sau3A连接接头连接,经两次PCR扩增获得足以用于构建单染色体DNA文库的扩增产物。片段大小为0．3～5kb,多数为0．5～3．5kb．与前人研究方法相比,所需底物量少（只需1条染色体）,扩增片段大,为植物中小型染色体分离、体外扩增进而进行单染色体DNA文库构建奠定了基础。     

利用微分离黑麦1R染色体的体外扩增产物进行染色体着染研究

首先对显微分离出的黑麦（ＳｅｃａｌｅｃｅｒｅａｌｅＬ．）１Ｒ染色体进行了两轮Ｓａｕ３Ａ连接接头介导的ＰＣＲ扩增（ＬＡ＿ＰＣＲ）。经Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交证实这些染色体扩增片段来源于基因组ＤＮＡ之后,再利用１Ｒ染色体的第二轮扩增产物、黑麦基因组ＤＮＡ、ｒＤＮＡ基因为探针,与其根尖细胞中期分裂相进行染色体原位杂交,发现微分离的１Ｒ染色体体外扩增产物中包含大量的非该染色体特异性重复序列,而其信息量却较黑麦总基因组少;当以适量的黑麦基因组ＤＮＡ进行封阻时,微分离染色体的体外扩增产物成功地被重新定位在中期分裂相的一对１Ｒ染色体上,说明微分离１Ｒ染色体的ＰＣＲ扩增产物中的确包含了该染色体特异性的片段。此外,以从１Ｒ染色体微克隆文库中筛选出的一单、低拷贝序列和一高度重复序列分别为探针,染色体原位杂交检测发现,这一高度重复序列可能为端粒相关序列;而单、低拷贝序列却未检测到杂交信号。这些结果从不同侧面反映出染色体着染技术是证实微分离、微切割染色体的真实来源及筛选染色体特异性探针的有利工具。建立了可供参考的植物染色体着染实验体系,为染色体微克隆技术在植物中的进一步应用提供了便利。     

大豆单染色体的显微分离及体外扩增

采用玻璃针分离法,通过显微操作器成功地分离到大豆（ＧｌｙｃｉｎｅｍａｘＬ．）单染色体。将分离到的两条大豆染色体分别放入两个０．５ｍＬＥｐｐｅｎｄｏｒｆ管中,经Ｓａｕ３Ａ酶切,并在染色体ＤＮＡ片段两端加上Ｓａｕ３Ａ人工接头后,进行两轮ＰＣＲ扩增,得到０．３～３ｋｂ之间的ＤＮＡ片段。Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交表明,这些大豆单染色体扩增片段与大豆基因组ＤＮＡ之间有同源性,从而证明两条单染色体ＤＮＡ确实已被成功地扩增了,同时表明两条不同的大豆单染色体扩增产物存在一定的差异。在常规的倒置显微镜下对小型染色体进行了显微分离,为小型单染色体ＤＮＡ的体外扩增及微克隆奠定了基础。     

雄牛特异的SRY同源序列的扩增和分析

利用人、兔、鼠SRY序列设计引物,应用PCR扩增牛的SRY序列,获得200bp的雄牛特异的扩增片段。克隆该扩增片段,获得重组质粒pCH21,进行序列分析,并与人、兔和鼠SRY的对应区域比较,具有高度同源性。用pCH21 DNA作探针与牛的基因组DNA酶切图谱杂交,显示了雄牛特异的I．7kb的杂交带。分析200bp的PCR扩增片段是牛的SRY基因片段。用同一对引物扩增人和山羊的DNA样品,也获得雄性特异的200bp的扩增片段。     

杉木第四号染色体特异性RAPD片段的获得

分别分离杉木(Cunninghamia lanceolata(Lamb.)Hook)同一细胞中的第四号具随体染色体及剩余20条非随体染色体,进行DOP-PCR扩增,分别以随体染色体及非随体染色体的DOP-PCR产物为模板,用成对随机引物进行RAPD分析。用引物对OPB07+OPB10进行扩增,在500-250 bp之间,随体染色体有4条特异扩增带;用引物对OPB07+OPB18在900 bp左右获得1条随体染色体特异带;用引物对OPD07+OPD05在250 bp左右得到随体染色体1条特异扩增带。     

黑麦1R染色体的显微分离、体外扩增及扩增产物的鉴定

借助Leitz显微操作器,在国产倒置显微镜下(400×)用玻璃针对处于有丝分裂中期的黑麦根尖细胞中的1R染色体成功地进行了分离。分离出来的1R染色体转入0.5 ml的Eppendorf管中,用蛋白酶K处理,把DNA释放出来;经Sau3A酶切,再与人工合成的Sau3A连接头连接;以连接头的一条链的核苷酸顺序片段为引物对DNA酶切片段进行了PCR扩增。琼脂糖凝胶电泳显示扩增产物的长度大约为300~1000 bp。以生物素分别标记的黑麦总体DNA和小麦rDNA为探针进行斑点杂交,结果表明PCR扩增产物确实来源于黑麦的1R染色体DNA。这个方法为构建黑麦1R染色体亚基因组文库和筛选1R染色体特异性探针奠定了基础。