鼻咽癌细胞中ezrin基因增强子区的定位分析

本研究采用嵌套缺失和荧光素酶检测技术对鼻咽癌CNE2细胞ezrin基因增强子区进行定位分析。实验结果显示,CNE2细胞中,ezrin基因-1541/-706具有转录激活和转录增强作用,存在转录正调控区和负调控区。对5个潜在转录调控区的进一步研究发现,ezrin基因-1297/-1186对ezrin启动子和SV40启动子具有显著的转录增强作用;其它4个区域对启动子不表现转录调控作用,或表现弱的转录增强作用。结果表明,ezrin基因-1297/-1186是具有增强子作用的关键转录调控区,它有可能与其它潜在转录调控区以共同或协同的方式调控ezrin基因转录。     

hMAM启动子／增强子调控表达载体构建和调控作用

目的构建人乳腺珠蛋白（human mammaglobin,hMAM）启动子／增强子调控报告基因表达载体,探讨hMAM启动子／增强子序列在乳腺癌细胞中的特异性调控作用。方法应用PCR技术,从基因组DNA中扩增出hMAM启动子／增强子DNA序列,构建于PGL3报告基因上游,分别转染体外培养的乳腺癌细胞MDA—MB-415、T47D及胃癌细胞7901,分析启动子和增强子序列对乳腺癌细胞的基因表达调控作用。结果酶切图谱分析、DNA序列测定表明成功构建hMAM启动子／增强子调控的表达载体;荧光素酶报告基因检测结果分析表明,hMAM启动子／增强子能够调控报告基因的表达。结论hMAM启动子／增强子,在MDA—MB-415乳腺癌细胞具有调控基因表达的作用;     

增强子作用机制研究进展

增强子是能够增强启动子转录活性的ＤＮＡ顺式作用序列。增强子的结构与启动子相似,也是由多个元件组成,每个元件可以与一种或多种转录调控因子结合。增强子可以在启动子区的上游或下游起增强转录作用且与其距转录起点的远近无关。如Ｔ细胞受体α链基因的增强子位于启动...     

家蝇卵黄蛋白基因启动子区的克隆与活性分析

从家蝇基因组文库中分离到含约1．7kb5’上游区的家蝇卵黄蛋白-1基因组基因序列,根据其5’上游序列,PCR扩增出大小不同的4个启动子片段,分别插入到切除了CMV启动子的pCMV-GFP质粒中的绿色荧光蛋白报告基因上游,构建了pMYP1-GFP、pMYP2-GFP、pMYP3-GFP和pMYP4-GFP4个重组质粒。另将 684／ 7、 1165／ 7这两个启动子片段用SpeⅠ和HindⅢ双酶切,去除包含CAAT／TATA盒的 302／ 7序列区后,分别构建了pMYP5-GFP和pMYP6-GFP两个重组质粒。通过电转移实验和荧光检测表明。 684／ 7、 1165／ 7、 1616／ 7这3个启动子片段具有转录活性,而 684／ 7启动子片段的转录活性最强, 296／ 7、 684／ 302、 1165／ 302这3个启动子片段无转录活性。上述实验结果表明。 302／ 7序列区为启动子的核心部分。 302到 1616之间存在调控性启动子或增强子等其他一些顺式元件。细胞转染实验证实,6种启动子片段在BHK-21和Sf9细胞中都未表现出可检测的转录活性,说明家蝇卵黄蛋白基因启动子具有组织或细胞特异性。     

肺癌细胞中调控ezrin基因基本转录活性的顺式作用元件及转录因子的鉴定

研究发现,质膜-细胞骨架连接蛋白Ezrin在多种肿瘤细胞中异常表达,而且Ezrin的表达上调与肿瘤细胞的移动侵袭相关,但是调控ezrin基因转录的分子机制却不清楚.为了探明ezrin基因的转录调控机制,以肺癌细胞A549为材料,首先采用双荧光素酶报告基因分析系统检测ezrin基因5′侧翼嵌套缺失序列和位点突变序列的转录活性,鉴定肺癌细胞中ezrin基因的基本启动子区以及关键的顺式作用元件Sp1结合位点(-75/-69)和AP-1结合位点(-64/-58).其次,利用凝胶电泳迁移率变动分析证明,肺癌细胞核蛋白提取物能够与ezrin基因含有关键顺式作用元件的DNA序列结合,形成DNA-核蛋白复合物,而且Sp1结合位点和AP-1结合位点与重组蛋白rhSp1和rhAP-1的结合具有位点特异性.最后,利用瞬时转染实验证实,转录因子Sp1和AP-1(由c-Jun和c-Fos组成的异源二聚体)分别通过Sp1结合位点和AP-1结合位点,增强ezrin基因基本转录活性,而且,过表达转录因子Sp1、c-Jun或c-Fos上调了Ezrin蛋白表达.研究确定,肺癌细胞中调控ezrin基因基本转录活性的关键顺式作用元件是Sp1结合位点(-75/-69)和AP-1结合位点(-64/-58),与之作用的转录因子Sp1和AP-1对于ezrin基因的转录激活作用至关重要.     

人类RELM-beta基因启动子的结构与功能分析

为克隆人类抵抗素样分子β（resistin-like molecule beta, RELMβ）基因的上游启动子序列,并观察其不同截短片段的启动子活性,以人类基因组DNA为模板,通过PCR扩增方法获得-871～+50 bp、-729～+50 bp、-471～+50 bp、-438～+50 bp、-371～+50 bp大小的RELMβ启动子片段,将其定向克隆入pGL3-Basic载体,构建荧光素酶报告基因载体,并制备转录因子CDX-2结合位点的突变或缺失体.在阳离子脂质体的介导下,报告基因载体分别瞬时转染人胚肾293细胞、结肠癌HCT116和SW480细胞、宫颈癌HeLa细胞.结果发现,各RELMβ启动子片段在293、HCT116、SW480细胞中均有活性,但在HeLa细胞中活性缺失;-471～-438 bp区存在RELMβ启动子的核心调控元件.针对该区域CDX-2转录因子结合位点进行突变,能导致RELMβ启动子活性显著降低;凝胶电泳迁移率实验表明,该区段能结合CDX-2.结果提示,成功克隆了具有活性的RELMβ启动子序列,CDX-2为其重要的转录因子,为研究RELMβ基因的转录调控机制奠定了实验基础.     

NFY结合位点缺失下调NPCEDRG基因启动子转录活性和效率

NPCEDRG基因是一个鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma, NPC)相关基因. NPCEDRG基因启动子为TATA-less启动子,其核心启动子区域位于-146 ～-8 bp区,该区域包含NFY、STAT1和cMYB等转录因子结合位点. 前期研究结果提示,转录因子NFY可能参与NPCEDRG基因的转录调控. 为明确NFY转录因子在NPCEDRG基因转录中的作用,本研究应用报告基因载体系统分析方法对NPCEDRG基因核心启动子区进行NFY结合位点（或CCAAT-box）缺失突变及其功能分析,分别构建NPCEDRG基因核心启动子区NFY结合位点缺失突变的Luc和EGFP报告基因表达载体. 比较核心启动子和NFY结合位点缺失突变体报告基因载体的转录活性和效率. 结果表明,在MCF7和CNE2细胞中,NFY结合位点缺失突变体的转录活性分别约为其核心启动子转录活性66.94%和75.72%,即NFY结合位点缺失致使该启动子转录效率在MCF7和CNE2细胞中分别降低了33.06%和24.28%;EGFP报告基因表达载体系统研究结果与Luc报告基因载体系统结果基本吻合. 本研究再次证实,转录因子NFY通过结合NPCEDRG基因启动子的核心元件NFY结合位点参与NPCEDRG基因的转录调控,并提高其基因转录活性和效率.     

在Yunnanese(Aγδβ)0-地贫3′缺失端点下游鉴别到两个增强子样顺序

利用荧光酶报告基因系统搜索了Yunnanese(Aγδβ)0-地中海贫血缺失3′端点下游11.5 kb区域内的调控顺序.确定缺失3′端点立即下游区1.7 kb片段,在人红白血病细胞K562及鼠红白血病细胞MELGM979中,可使γ-珠蛋白基因启动子驱动的荧光酶基因表达增加3.8～4.0倍,而在HeLa细胞中仅增加1.5倍.位于缺失3′端点约10 kb的一个长1.4 kb片段在K562和MELGM979中,可使γ-基因启动子驱动的荧光酶基因表达增加2.4～2.9倍,而在HeLa细胞中无增加.结果说明这两段顺序均有增强子活性,并且这种活性具有一定的红细胞特异性.进一步证明1.7 kb片段内包含多个转录调节蛋白结合模体的430 bp片段包含了1.7 kb片段的大部分增强子活性.这些结果为缺失导致增强子样顺序并入到接近Gγ-基因,是Yunnanese(Aγδβ)0-地贫缺失突变体中胎儿Gγ-珠蛋白基因,在成人期持续活跃表达原因的假设提供了实验证据.     

鸡AChRγ亚基基因远上游增强子样作用依赖生肌因子

先前曾报告鸡ＡＣｈＲγ亚基基因５＇连接区－５３８／－２８８片段（含一对Ｅ盒子）与生肌调节因子（ｍｙｏｇｅｎｉｎ）的相互作用,为进一步观察ＤＮＡ－ｍｙｏｇｅｎｉｎ相互作用对γ基因转录激活功能的影响,利用瞬时表达体系研究了鸡ｎＡＣｈＲγ亚基基因５＇端－５３８／－２８８片段调控机能。ＣＡＴ分析表明：γ基因－５３８／－２８８片段可显著激活ｔｋ启动子在分化的Ｃ２Ｃ１２肌细胞中的转录活性,但不能激活在未分化Ｃ２Ｃ１２肌细胞中的转录活性。这种组织特异性转录激活作用与距离无关,因而是一个典型的增强子;－５３８／－２８８片段的增强子样作用既依赖于两毗邻Ｅ盒子的完整性,又依赖于ｍｙｏｇｅｎｉｎ等生肌调节因子的存在。强化表达ｍｙｏｇｅｎｉｎ可激活ｐＢＬＣＡＴ２－γ（－５３８／－４３３）和ｐＢＬＣＡＴ２－γ（－４３２／－２８８）（各含一个Ｅ盒子）在分化肌细胞中的表达,究竟是克隆片段中的独立Ｅ盒子对这种表达起贡献还是出现在克隆位点附近的反向Ｅ盒子（ＧＴＣＧＡＣ）或ｔｋ启动子中的另一个Ｅ盆子起作用？尚不十分清楚。     

EphA3基因启动子区域定位表达及活性分析

目的构建含有不同长度EphA3基因启动子片段的报告基因载体,研究其在293T细胞和MEF细胞中的转录活性。方法以Balb／C小鼠基因组DNA为模板,扩增不同长度的EphA3基因启动子片段,并克隆进入荧光素酶报告基因质粒pGL3-Basic真核表达载体内。酶切鉴定及基因测序无误后,将重组质粒和pRL—CMV内对照质粒共转染293T和MEF细胞,分析不同长度的OhA3基因启动子片段的转录活性。结果酶切和测序鉴定表明表达载体构建成功,EphA3基因的核心启动子区域位于-279bp～＋110bp之间,在293T细胞和MEF细胞中其转录活性相似。结论成功构建了荧光素报告基因重组质粒,并确定了BphA3基因的核心启动子区域。     

An autoregulatory element of the murine Hox-4.2 gene.

Hox-4.2 promoter activity was assayed by transient expression assays in P19 embryonal carcinoma (EC) cells. Cotransfection of a luciferase reporter gene construct driven by Hox-4.2 upstream sequences with an expression vector for the Hox-4.2 gene product resulted in a 20-fold increase in luciferase activity. This activity was specific in that the Hox-1.6 gene product had no effect in the same assay. Mutational analysis defined a cis-acting element with enhancer function which conferred most of this increase. Activation was largely dependent on two TAAT/ATTA motifs within this 217 bp fragment and HOX-4.2 bound specifically to both of these motifs. The 217 bp element maps within a highly conserved region of the human Hox-4.2 gene (HOX4B) which has been shown to display spatial enhancer activity in mice and flies. These findings suggest a conserved autoregulatory mechanism for the control of Hox-4.2 expression.