敲低心肌连接斑株蛋白对人胃癌SGC-7901细胞的迁移和侵袭能力的影响及机制研究

该文研究了敲低心肌连接斑株蛋白(junction plakoglobin,JUP)对人胃癌SGC-7901细胞迁移和侵袭的影响及其机制。通过sh RNA慢病毒介导的方式构建了敲低JUP基因的慢病毒载体序列及其阴性对照病毒,并感染至人胃癌SGC-7901细胞中,荧光检测细胞感染效率,获得JUP基因稳定沉默及其对照细胞株。用嘌呤霉素筛选阳性转染细胞株,采用实时荧光定量PCR(q RT-PCR)和蛋白质免疫印记法(Western blot)检测JUP表达水平。采用细胞划痕愈合实验和Transwell小室实验检测敲低JUP基因之后对人胃癌SGC-7901细胞迁移和侵袭能力的影响。采用Western blot检测敲低JUP之后β-连环蛋白水平的影响。结果显示,通过sh RNA介导的慢病毒成功构建了敲低JUP基因的人胃癌SGC-7901稳定细胞株。与对照组相比,敲低JUP表达可促进细胞的迁移和侵袭能力(P0.05),上调了β-连环蛋白的水平(P0.05)。以上结果表明,敲低人胃癌SGC-7901细胞中JUP基因表达后可促进胃癌细胞SGC-7901的迁移和侵袭能力可能与其上调β-连环蛋白的水平从而活化Wnt信号通路有关。     

白黎芦醇对胃癌SGC 一7 901 细胞V EGF 表达的影响

目的：探讨白藜芦醇（resveratrol,Res）在体外对胃癌SGC-7901细胞VEGF表达的影响。方法：体外培养胃癌SGC-7901细胞,MTT法检测白藜芦醇对SGC-7901细胞的增殖抑制作用,RT—PCR方法检测VEGFmRNA表达,免疫细胞化学检测VEGF蛋白的表达。结果：白藜芦醇呈时间剂量性抑制胃癌细胞SGC7901的增殖;胃癌SGC-7901细胞高水平表达VEGF,白藜芦醇能显著降低胃癌SGC-7901细胞VEGFmRNA和蛋白表达。结论：白藜芦醇可以下调胃癌SGC-7901细胞VEGF的表达,抑制胃癌细胞的增殖。     

不同浓度姜黄素对胃癌SGC-7901细胞增殖、自噬性凋亡和TGF-β/Smad信号通路的影响

摘要 目的：研究不同浓度姜黄素（Cur）体外对胃癌SGC-7901细胞增殖、自噬性凋亡和TGF-β/Smad信号通路的影响。方法：体外培养SGC-7901细胞,以不同浓度Cur作用于SGC-7901细胞。MTT法检测不同浓度的Cur对SGC-7901细胞增殖的影响。Hoechst 33258法观察不同浓度Cur对SGC-7901细胞凋亡影响,流式细胞仪检测细胞凋亡率。划痕实验检测不同浓度Cur对SGC-7901迁移能力的影响。免疫印迹法检测细胞凋亡相关蛋白NF-κB、自噬相关蛋白Beclin1、LC3Ⅱ及TGF-β/Smad信号通路蛋白TGF-β和p-smad2/3表达。结果：Cur能够抑制胃癌SGC-7901细胞的增殖和迁移,并且Cur对增殖和迁移的影响具有浓度依赖性。Cur能够促进胃癌SGC-7901细胞自噬性凋亡的发生,Cur浓度越高,SGC-7901细胞凋亡率越高（P<0.05）。Cur处理胃癌SGC-7901细胞后NF-κB、Beclin1、LC3Ⅱ表达明显升高,而TGF-β、p-smad2/3表达明显降低,且NF-κB、Beclin1、LC3Ⅱ、TGF-β和p-smad2/3的变化具有浓度依赖性。结论：Cur能够抑制胃癌SGC-7901细胞增殖和迁移并诱导自噬性凋亡的发生,其机制与促进NF-κB、Beclin1、LC3Ⅱ表达,抑制TGF-β/Smad信号通路激活有关。     

Ad-IL-24对SGC-7901胃癌细胞生长抑制的体外实验

旨在研究携带人IL-24基因的腺病毒表达载体(Ad-IL-24)对SGC-7901人胃癌细胞的生长抑制作用并分析其分子机制。以不同MOI(感染复数)的Ad空载体腺病毒感染SGC-7901人胃癌细胞,筛选出最佳感染剂量;Ad-IL-24以最佳感染剂量感染SGC-7901胃癌细胞,RT-PCR法和Western blotting法检测腺病毒介导的IL-24基因在SGC-7901胃癌细胞中的转录;MTT法检测Ad-IL-24对SGC-7901胃癌细胞的生长抑制作用,流式细胞仪检测其诱导SGC-7901人胃癌细胞凋亡和细胞周期改变的效应,Hoechst33258染色荧光显微镜检测其诱导胃癌细胞凋亡的核形态改变;RT-PCR半定量法进一步检测SGC-7901胃癌细胞中凋亡相关基因的转录。结果显示,100MOI为感染SGC-7901胃癌细胞的腺病毒最佳感染剂量;Ad-IL-24能成功介导IL-24基因在SGC-7901胃癌细胞中转录性表达;Ad-IL-24感染SGC-7901胃癌细胞后,能明显抑制胃癌细胞生长和诱导凋亡;Ad-IL-24能显著上调SGC-7901胃癌细胞中bax、caspase-3和p53的表达和下调bc...     

人β防御素-2通过TGF-β/Smad信号通路对胃癌SGC7901细胞增殖、迁移和侵袭的影响

该文探讨了人β防御素-2(hBD2)对胃癌SGC7901细胞的增殖、迁移和侵袭的影响。将真核表达载体pCMV-hBD2转染于人胃癌SGC7901细胞。采用qPCR和免疫印迹法(Western blot)检测转染效率。Western blot检测TGF-β1、p-Smad2/3、Smad2/3、MMP9的蛋白表达水平。Transwell法检测SGC7901细胞迁移和侵袭能力。EdU法和流式细胞术分别检测增殖能力与细胞周期。结果显示,转染真核表达载体pCMV-hBD2的SGC7901细胞, hBD2的表达水平明显高于SGC7901和转染pCMV-Blank的SGC7901细胞。SGC7901-hBD2细胞中TGF-β1、p-Smad2/3和MMP9的蛋白表达水平均低于SGC7901和SGC7901-Blank细胞,而Smad2/3表达水平不变。同时,其迁移侵袭和增殖能力均受到抑制,细胞周期G0/G1期阻滞。该实验结果表明, hBD2可能通过下调TGF-β/Smad信号通路调控SGC7901细胞的迁移侵袭以及增殖能力。     

转录因子SOX2 对胃癌干细胞自我更新、增殖和迁移的影响

目的:检测SOX2在胃癌组织中的表达,探讨SOX2对胃癌干细胞自我更新、增殖和转移能力的影响。方法:采用免疫组化检测SOX2在胃癌及癌旁组织中的表达情况。通过肿瘤球形成实验富集、分离胃癌干细胞。构建SOX2过表达慢病毒并感染胃癌干细胞中,通过实时定量PCR和western bolt检测感染慢病毒后胃癌干细胞中SOX2表达情况。分别利用肿瘤球形成实验检测SOX2对胃癌肿瘤干细胞自我更新能力的影响,CCK-8实验检测SOX2对胃癌干细胞增殖能力的影响,流式细胞术分析SOX2对胃癌干细胞的细胞周期的影响,Transwell实验检测SOX2对胃癌干细胞转移能力的影响。结果:SOX2在胃癌组织中表达显著低于癌旁组织。肿瘤球形成实验能够有效富集胃癌细胞SGC-7901和BGC-823的干细胞。慢病毒载体感染能够显著增强SOX2在胃癌干细胞中的表达。过表达SOX2能够抑制胃癌干细胞的自我更新、增殖和侵袭能力。结论:SOX2在胃癌中发挥抑癌基因的功能,其机制可能通过抑制肿瘤干细胞的自我更新、增殖和侵袭转移能力而抑制胃癌的发生发展。     

脱氧雪腐镰刀菌烯醇对胃癌细胞增殖及细胞周期的影响

探讨脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）对体外培养的两株胃癌细胞（SGC-7901和BGC-823）增殖及细胞周期的影响。采用细胞培养、噻唑蓝（MTF）比色法、流式细胞定量检测（FCM）、蛋白质免疫印迹（Western印迹）以及免疫细胞化学染色（ICH）等方法,研究不同浓度DON处理72h对体外培养胃癌细胞的增殖、细胞周期及细胞周期相关蛋白—细胞周期蛋白依赖性激酶抑制蛋白（CKIs）P21WAF/CIP1和细胞周期蛋白E（cyclin E）表达的影响。MTT法检测结果显示DON可明显抑制两株胃癌细胞的增殖,SGC．7901和BGC．823细胞100、500、1000ug／L DON处理组的增殖抑制率分别为4．28％、36．20％、45．35％和14．89％、32．30％、51．61％。FCM检测结果显示,给予1000ug／LDON处理72h可使两株细胞周期阻滞在GffM期。在100～1000u扎浓度范围内,两株细胞P21WAF／CIP1表达量均高于对照组,P21WAF／CIP1的表达与DON浓度呈显著正相关关系（SGC-7901细胞：r=0．886,P〈0．01;BGC-823细胞：r=0．943,P〈0．01）;两株细胞的细胞周期蛋白E表达量均低于对照组,与DON浓度有明显剂量依赖关系（SGC．7901细胞：r=-0．923,P〈0．01;BGC-823细胞：r=-0．854,P〈0．01）。Western印迹及免疫细胞化学检测进一步证实了DON处理对蛋白质表达的影响。综合结果表明,DON可抑制体外培养胃癌细胞的增殖活性,G2／M期阻滞、P21WAF/CIP1表达增高及细胞周期蛋白E表达下降可能是DON抑制胃癌细胞增殖的可能机制,DON对分化程度不同的胃癌细胞的影响没有明显差别。     

G蛋白偶联胆汁酸受体1促进胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭的实验研究

目的:探讨G蛋白偶联胆汁酸受体1(G-protein coupled bile acid receptor 1,GPBAR1/TGR5)对胃癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响。方法:免疫组织化学染色方法(Immunohistochemistry,IHC)检测胃癌及癌旁组织芯片中TGR5表达情况;qRT-PCR及Western blot检测胃癌细胞系中TGR5表达水平;小干扰RNA处理AGS、MKN-45胃癌细胞后构建TGR5敲减细胞系,慢病毒载体转染胃癌SGC-7901细胞构建TGR5过表达细胞系;CCK-8实验、平板克隆形成实验、裸鼠皮下移植瘤实验检测TGR5对细胞增殖的影响;流式细胞仪检测TGR5对细胞周期及凋亡的影响;Tanswell实验检测TGR5对胃癌细胞迁移及侵袭的影响;Western blot检测上皮间充质转化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)相关分子β-连环蛋白(β-catenin)、锌脂蛋白转录因子(Snail)、E盒结合锌指蛋白(Zinc finger E-box binding homeobox 1,ZEB)1在AGS、MKN-45及SGC-7901胃癌细胞中的表达。结果:TGR5在胃癌及癌旁组织中均有表达,胃癌组织TGR5高表达率(41.0%)显著高于癌旁组织(9.5%),伴肠化生癌旁组织TGR5高表达率(50%)显著高于不伴肠化生的癌旁组织(0%),胃癌组织TGR5表达与肿瘤大小相关。TGR5在正常人胃上皮永生化细胞株GES-1及各胃癌细胞系中均有表达。TGR5表达敲低的AGS和MKN-45细胞增殖能力减弱、凋亡率显著升高、侵袭和迁移能力显著降低。过表达TGR5的SGC-7901细胞增殖能力增强、克隆形成能力提高、凋亡率明显减低、侵袭和迁移能力显著升高。此外,TGR5过表达显著上调了间质细胞标志物β-catenin、Snail、ZEB1的表达水平。结论:TGR5能够增强胃癌细胞增殖及迁移能力,并抑制细胞凋亡。TGR5可能通过EMT途径介导胃癌细胞转移。     

VD通过VDR下调β-catenin磷酸化水平抑制胃癌细胞增殖

为探讨维生素D(vitamin D, VD)及维生素D受体(vitamin D receptor, VDR)对胃癌细胞增殖的作用及分子机制,该研究首先通过免疫荧光实验观察胃癌细胞SGC-7901和MKN-45中VDR的表达水平,进一步利用shRNA干扰慢病毒转染两种胃癌细胞,嘌呤霉素筛选建立shVDR稳定株,应用CCK8及细胞集落形成实验,流式细胞学实验, Western blot实验检测VD/VDR在两种胃癌细胞恶性表型增殖及细胞周期中的作用;最后再次应用Western blot实验检测VD/VDR对胃癌细胞中β-catenin磷酸化表达水平的影响。结果表明两种胃癌细胞均表达VDR;在配体骨化三醇(1α,25(OH)_2D_3)存在的情况下,胃癌细胞的增殖和集落形成受到明显抑制,同时抑制β-catenin的磷酸化水平,但对细胞周期分布及细胞周期蛋白Cyclin D1无明显作用。下调VDR的表达水平后, VD对β-catenin磷酸化表达水平无明显影响。证实VDR通过下调β-catenin的磷酸化水平,发挥抑制胃癌细胞增殖的作用。     

FXYD6 shRNA表达载体的构建及其在体外对胰腺癌细胞增殖的影响

目的：构建FXYD6短发夹RNA（shRNA）表达载体,体外评价其对胰腺癌细胞sw1990的增殖与FXYD6蛋白表达的抑制效果。方法：基于microRNA mir-30天然结构,设计表达4对FXYD6 shRNA的互补DNA序列,克隆入pCGM30质粒载体,连接产物转化感受态大肠杆菌DH5α,PCR法筛选阳性克隆,经酶切和基因测序鉴定;利用LipofectAMINE2000将pCGM30-FXYD6shRNA转染至胰腺癌细胞sw1990,MTT法检测转染后胰腺癌细胞增殖的变化,Western blot检测胰腺癌细胞中FXYD6蛋白表达水平的变化。结果：设计合成了4对表达FXYD6 shRNA的互补DNA序列,构建了4个表达FXYD6 shRNA的重组质粒;基因测序证实shRNA编码序列与设计的片段完全一致,酶切鉴定证实载体构建成功;体外实验表明,转染胰腺癌细胞sw1990的增殖能力和FXYD6蛋白表达水平明显降低（P〈0．05）,FXYD6蛋白表达水平随时间延长逐渐降低（P〈O．01）,但细胞增殖能力无明显变化（P〉0．05）。结论：构建了4个表达FXYD6 shRNA的重组质粒载体,可有效抑制FXYD6的表达;抑制胰腺癌细胞sw1990中FXYD6的表达可以抑制细胞的增殖,提示FXYD6可能是一个具有潜在临床应用价值的基因治疗靶点。     

重组人类生长激素对胃癌细胞的体外增殖研究

目的：通过体外实验,研究重组人类生长激素对胃癌细胞的增殖的影响。方法：实验分为空白组,重组人类生长激素组,奥沙利铂组和重组人类生长激素＋奥沙利铂组。用不同浓度的重组人类生长激素处理SGC．7901细胞,采用MTT法和流式细胞仪检测人胃癌细胞株的细胞抑制率,细胞周期和DNA抑制率。结果：体外实验结果表明,重组人类生长激素对SGC．7901细胞株增殖没有明显的促进作用,重组人类生长激素组和空白组以及重组人类生长激素＋奥沙利铂组和奥沙利铂组之间没有统计显著性（P〉0．05）,细胞抑制率和停止生长的细胞在G0-G1期明显增加（P〈0．01）,同时重组人类生长激素＋奥沙利铂组和空白组以及奥沙利铂组在S期,细胞数依次下降,DNA抑制率依次增加。重组人类生长激素＋奥沙利铂组与奥沙利铂组相比,细胞抑制率有明显上升趋势。结论：体外实验表明,重组人类生长激素并不加快人类胃癌细胞的增殖,与抗癌药物一同使用时,有增加治疗功效的作用。     

Downregulation of microRNA-92b-3p suppresses proliferation,migration, and invasion of gastric cancer SGC-7901 cells by targeting Homeobox D10

To investigate the effect and mechanism of microRNA-92b-3p (miR-92b-3p) targeting Homeobox D10 (HOXD10) on proliferation, migration, and invasion of gastric cancer, we detected t he expression of miR-92b-3p and HOXD10 in SGC-7901 cells. The effects of miR-92b-3p or HOXD10 on proliferation, migration, invasion, and matrix metalloproteinase (MMP)-2/9 expression in SGC-7901 cells were measured by the Cell Counting Kit-8 assay, Transwell assay, and Western blot, respectively. The results showed that miR-92b-3p expression was increased, and HOXD10 expression was decreased in SGC-7901 cells, compared with human normal gastric epithelial cells GES-1. Functional experiments demonstrated that cell proliferation, migration, invasion, and expression of MMP-2/9 in SGC-7901 cells were significantly inhibited by miR-92b-3p silencing and HOXD10 overexpression. Moreover, HOXD10 was a potential target gene of miR-92b-3p as evidenced by the TargetScan software and double luciferase reporter assay. In the rescue experiment, knockdown of HOXD10, accompanied by higher expression of MMP-2/9, could significantly eliminate the inhibitory effects of miR-92b-3p silencing on cell proliferation, migration, and invasion. In conclusion, miR-92b-3p is highly expressed in gastric cancer SGC-7901 cells, and interfering with its expression might inhibit SGC-7901 cell proliferation, migration, and invasion via downregulating MMP-2/9 expression and targeting HOXD10.     

人EGFR显性负性突变体抑制胃癌细胞促血管形成能力

目的探讨人表皮生长因子显性负性突变体(dominant negative epidermal growth factor receptor,DNEGFR))对胃癌细胞促血管形成能力的影响及其分子机制,并检测其对裸鼠皮下移植瘤生长的影响。方法选用2株人胃癌细胞,分为如下6组:SGC-7901及NCI-N87细胞未转染组(US组,UN组),SGC-7901及NCI-N87细胞pEGFP-N1质粒转染组(ES组,EN组),SGC-7901及NCI-N87细胞pEGFPN1-DNEGFR质粒转染组(DS组,DN组)。采用人脐静脉内皮细胞(humanumbilical vein endothelial cell,HUVEC)管腔结构形成实验检测体外促血管形成能力,采用酶联免疫吸附测定法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)测定细胞培养液中血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的水平,建立人胃癌细胞裸鼠移植瘤模型,标本微血管密度(microvessel density,MVD)检测体内促血管形成能力,标本体积检测其对裸鼠皮下移植瘤生长的影响。结果转染pEGFPN1-DNEGFR质粒的人胃癌细胞株出现HUVEC管腔结构形成抑制,培养液中VEGF水平降低,MVD计数降低,裸鼠皮下移植瘤体积变小。结论 DNEGFR可能通过下调VEGF分泌抑制胃癌细胞体外及裸鼠体内促血管形成能力,最终抑制裸鼠皮下移植瘤生长。     

c—FLIP在DATS诱导人胃癌SGC-7901细胞凋亡中的作用

目的：探讨二烯丙基三硫（diallyl trisulfide,DATS）诱导人胃癌SGC-7901细胞凋亡及凋亡过程中c-FLIP的变化及意义。方法采用MTT、western-blot和细胞免疫组化分别检测DATS对SGC-7901细胞的增殖抑制率及c-FLIP的表达情况。光学显微镜观察凋亡形态,流式细胞术检测凋亡率。结果：MTT结果显示,不同浓度DATS（6、8、10、12、14、16mg.L^-1）DATS处理SGC-7901细胞24、48小时后,生长抑制率分别为20.4%--79%和36%--90%,DATS抑制作用随浓度及时间逐渐增强（P〈0.05）。细胞免疫组化和western-blot显示：9.5mg..L^-1DATS处理SGC-7901细胞24、48小时后,与对照组相比,c-FLIP的表达下调（P〈0.05）。光学显微镜：通过9.5mg..L^-1DATS作用后24、48小时后,胃癌细胞出现了凋亡形态学改变。流式细胞术检测：经过9.5mg..L^-1DATS处理SGC-7901细胞24、48小时后,细胞凋亡率逐渐升高。结论：DATS促进SGC-7901细胞凋亡的机制可能与抑制c-FLIP蛋白的表达有关。     

Snai1 miRNA干扰质粒构建及胃癌细胞系稳定株筛选

目的：设计并构建针对Snai1的微小干扰核糖核酸（miRNA）,最终鉴定出有效干扰质粒并筛选稳定转染的胃癌细胞株SGC-7901。方法：设计并构建4对Snai1的pcDNATM6.2-GW/EmGFPmiR microRNA及1对无效对照microRNA干扰质粒。将干扰质粒用罗氏BD转染试剂转染胃癌细胞株SGC-7901,通过倒置荧光显微镜观察绿色荧光确定转染效率。分别用不同浓度l的杀稻瘟菌素作用于SGC-7901细胞,得到杀稻瘟菌素对SGC-7901细胞的筛选浓度。Westernblot检测4对干扰质粒、阴性对照质粒对snai1蛋白水平表达的影响。结果：测序表明,Snai1干扰序列及读码框完全正确,干扰质粒瞬时转染的SGC-7901细胞系在倒置荧光显微镜下观察绿色荧光达85%以上。杀稻瘟菌素对于SGC-7901细胞的筛选浓度为5μg/ml。Westernblot结果显示,干扰序列Mi-1对Snai1有较强的干扰效果。结论：成功构建了Snai1干扰真核表达载体,同时筛选出有效干扰质粒及稳定转染株,为进一步研究Snai1在胃癌中的作用奠定了基础。     

RNA干扰抑制Snail表达对于胃癌细胞上皮间充质转化以及体外侵袭的影响

目的用RNA干扰(RNAinterference,RNAi)技术抑制转录因子Snail表达,观察其对人胃腺癌SGC-7901细胞上皮-间充质转化表型和体外侵袭能力的影响。方法构建能表达针对Snail的小干扰RNA(Small interferingRNA,si RNA)的RNA干扰载体(Snail si RNAvector)和表达不针对任何已知mRNA的si RNA的阴性对照RNA干扰载体(control si RNAvector),分别转染SGC-7901细胞,筛选得到Snail表达受抑制的SGC-7901-siSnail细胞和Snail表达未受影响的SGC-7901-siControl细胞。分别采用RT-PCR和Western blot技术检测非转染组、SGC-7901-siSnail、SGC-7901-siControl三组细胞Snail、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和E-cadherin表达,用Boyden chamber模型检测细胞侵袭能力。结果 SGC-7901-siSnail组与SGC-7901-nontransfection组相比,Snail和α-SMA表达显著减弱(P0.01),E-cadherin表达显著增强(P0.01),Boyden chamber穿膜细胞数显著减少(P0.01);SGC-7901-siControl组中Snail、α-SMA、E-cadherin表达、Boyden chamber穿膜细胞数分别和SGC-7901-nontransfection组比较无显著差异(P0.05)。结论通过RNA干扰阻滞Snail表达能有效地抑制SGC-7901细胞上皮-间充质转化及体外侵袭能力。Snail可能在胃腺癌上皮-间充质转化及侵袭过程中扮演重要角色,抑制Snail表达可能成胃腺癌治疗的可行策略。     

过表达胃泌素促进胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭

胃癌患者转移淋巴结中胃泌素基因的表达量是原发胃癌组织的42倍,推测胃泌素可能与胃癌转移密切相关. 本文通过构建含胃泌素基因的真核表达载体,成功获得过表达胃泌素的稳转胃癌细胞株AGS和SGC-7901, 并用MTT、细胞伤愈实验、Transwell 小室实验及ELISA检测过表达胃泌素对细胞迁移、侵袭及转移相关蛋白基质金属蛋白酶2（MMP-2）分泌能力的影响. 结果显示,过表达胃泌素稳转细胞的相对增殖率、 迁移入细胞致伤区的相对距离比对照组高,迁移和侵袭到Transwell下室面的细胞, 以及培养液中每mg蛋白质的MMP-2浓度也高于对照组的细胞. 结果提示,胃泌素通过促进胃癌细胞分泌MMP-2来增强细胞的迁移和侵袭能力. 该研究对揭示胃癌转移的分子机制具有重要意义.