人eRF3a与survivin相互作用的结构域分析

第二类肽链释放因子eRF3(eukaryotic polypeptide release factor)是一种GTPase,它促进第一类肽链释放因子eRF1的释放活性,并与细胞周期调控、细胞骨架组装、细胞凋亡和肿瘤形成等过程相关。哺乳动物细胞中eRF3有两种——eRF3a和eRF3b,分别由GSPT1和GSPT2(G1 to S phase transition 1/2)基因编码。生存素(survivin)是迄今发现的最强有力的凋亡抑制因子,具有独特的结构和复杂的功能,不仅可以抑制细胞凋亡,还参与细胞有丝分裂、血管的生成等过程。eRF3和survivin都与细胞周期和细胞凋亡的调控相关。该实验室的前期研究表明,eRF3和survivin具有相互作用关系。该研究进一步对eRF3a进行截短突变,采用酵母双杂交和pull-down两种分析方法依次验证eRF3a(1-72aa)和eRF3a(1-36aa)与survivin的相互作用关系。结果表明,eRF3a(1-72aa)和eRF3a(1-36aa)均可以与survivin相互作用,由此确定eRF3a与survivin相互作用的最小结构域位于其N末端1-36aa之间,从而为进一步证实eRF3a的N端结构域与survivin协同作用参与细胞周期和细胞凋亡的调控提供了数据支持。     

四膜虫eRF1识别终止密码子的功能结构域

原生动物的一些纤毛虫中终止密码子发生重分配现象,将1个或2个终止密码子翻译为氨基酸.目前对这一现象的发生机制仍无合理解释．近年来,对蛋白质合成终止过程中肽链释放因子(eukaryotic polypeptide release factor, eRF)结构和功能的深入研究,为揭示终止密码子的重分配机制提供了重要的线索．本实验以具有终止密码子识别特异性的四膜虫Tt-eRF1为研究对象,将其中与密码子识别有关的GTx、NIKS和Y-C-F关键模体(motif) 引入识别通用终止密码子的酵母Sc=eRF1中,构建成各种嵌合体eRF1．利用双荧光素酶报告系统和细胞活性实验,分析关键模体及其周边的氨基酸对eRF1识别终止密码子性质的影响．结果表明,GTx和NIKS模体一定程度上决定eRF1识别终止密码子第1位碱基U和第2位碱基A;Y-C-F模体决定eRF1识别终止密码子UGA的第2位碱基G．模体内及其相邻氨基酸定点突变分析进一步支持以上结果．本研究推测,eRF1在进化过程中一些关键模体结构的改变决定其识别终止密码子的特异性,只能识别3个终止密码子中的1个或2个．随后,由于tRNA基因的突变产生阻抑性tRNA,促成终止密码子在原生动物纤毛虫中的重新分配．     

八肋游仆虫eRF3 C端的76个氨基酸对于释放因子eRF1a的结合不是必需的

以八肋游仆虫第二类肽链释放因子eRF3基因为模板,用PCR的方法获得eRF3的C端(eRF3C)和C端缺失76个氨基酸的突变体eRF3Ct片段,并构建重组表达质粒pGEX-6p-1-eRF3C和pGEX-6p-1-eRF3Ct,转入大肠杆菌BL21(DE3)中获得了可溶性表达。通过Glutathione Sepharose 4B柱亲和层析纯化,重组蛋白GST-eRF3C和GST-eRF3Ct获得纯化。Western blotting分析表明获得的蛋白为目的蛋白。PreScission酶切割后得到eRF3C和eRF3Ct蛋白。体外pull down分析显示eRF3C和eRF3Ct均能与八肋游仆虫第一类释放因子eRF1a相互作用,这表明八肋游仆虫eRF3 C端的76个氨基酸对于释放因子eRF1a的结合不是必需的。     

八肋游仆虫第二类肽链释放因子核定位信号分析

蛋白质合成终止过程中肽链释放因子负责终止密码子的识别.真核生物第二类肽链释放因子（eRF3）是一类GTP酶,协助第一类肽链释放因子（eRF1）识别终止密码子和水解肽酰 tRNA酯键.之前的研究表明,两类肽链释放因子在细胞核中发挥功能,参与蛋白质合成和纺锤体的组装.本研究根据软件预测结果,构建了一系列八肋游仆虫eRF3的截短型突变体,分析在其N端是否存在引导eRF3的核定位信号.结果表明,在eRF3的N端有两个区域（NLS1:23-36 aa 和 NLS2: 236-272 aa）可以引导eRF3进入细胞核中,而且这两个区域具有典型的核定位信号的氨基酸序列特征. eRF3的核定位与其作为一种穿梭蛋白的功能相一致,即参与细胞有丝分裂纺锤体的形成和无义介导的mRNA降解途径.     

第一类肽链释放因子C端结构域参与调控终止密码子的识别过程

真核生物蛋白质翻译终止过程中,第一类肽链释放因子（eukaryotic polypeptide release factor, eRF1）利用其N端结构域识别终止密码子。eRF1的N结构域中的GTS、NIKS和YxCxxxF模体对于终止密码子的识别发挥重要作用。但至目前为止,eRF1识别终止密码子的机制,尤其是对于终止密码子的选择性识别机制仍不清楚。我们构建了四膜虫（Tetrahymena thermophilia）eRF1的N端结构域与酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）或裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）eRF1的M和C结构域组成的杂合eRF1,即Tt/Sc eRF1 和Tt/Sp eRF1。双荧光素酶检测结果证实,两种杂合eRF1在细胞中识别终止密码子的活性具有显著差异。Tt/Sc eRF1仅识别UGA密码子,与四膜虫eRF1一致,具有密码子识别特异性;而Tt/Sp eRF1可以识别3个终止密码子,无密码子识别特异性。为解释这一现象,将Sp eRF1的C结构域中的1个关键的小结构域中的氨基酸进行突变,与Sc eRF1相应位点的氨基酸一致。分析结果显示,突变体Tt/Sp eRF1识别密码子UAA和UAG的性质发生显著变化,说明第一类肽链释放因子的C端结构域参与了终止密码子的识别过程。这提示,四膜虫eRF1识别终止密码子的特异性可能依赖于eRF1分子内的结构域间相互作用。本研究结果为揭示肽链释放因子识别终止密码子的分子机制提供了数据支持。     

结构域相互作用数据库的产生、发展与应用

结构域是进化上的保守序列单元,是蛋白质的结构和功能的标准组件．典型的两个蛋白质间的相互作用涉及特殊结构域间的结合,而且识别相互作用结构域对于在结构域水平上彻底理解蛋白质的功能与进化、构建蛋白质相互作用网络、分析生物学通路等十分重要．目前,依赖于对实验数据的进一步挖掘和对各种不同输入数据的计算预测,已识别出了一些相互作用/功能连锁结构域对,并由此构建了内容丰富、日益更新的结构域相互作用数据库．综述了产生结构域相互作用的8种计算预测方法．介绍了5个结构域相互作用公共数据库3DID、iPfam、InterDom、DIMA和DOMINE的有关信息和最新动态．实例概述了结构域相互作用在蛋白质相互作用计算预测、可信度评估,蛋白质结构域注释,以及在生物学通路分析中的应用．     

Deafl的功能结构域分析和预测

目的分析转录因子Deafl的功能结构域并预测其功能。方法利用现有的数据库和软件对Deafl的转录因子结构域,核定位信号及和输出信号进行分析和预测。结果Deafl含有一个保守的SAND结构域及一个能介导蛋白质一蛋白质相互作用的MYND结构域;有核定位信号和核输出信号;在其N端还有一个富含丙氨酸结构域。结论Deafl除有典型转录因子必需的功能结构域之外,可能还有不止一个结构域能介导与其它蛋白质因子的相互作用,这对Deafl调控外周组织抗原表达至关重要。     

RPAP3 蛋白中TPR 结构域的功能研究

目的:构建针对RPAP3 TPR区域的慢病毒载体,观察过表达对细胞周期的影响。方法:通过生物信息学软件比较RPAP3结构域组成,推测功能;分析RPAP3核定位信号,构建瞬时表达质粒pEGFP-N2-RPAP3,激光共聚焦显微镜观察RPAP3蛋白的亚细胞定位;通过酵母双杂交和GST-Pulldown实验研究RPAP3与HSP70的相互作用及作用靶点;构建慢病毒载体pLJM.1-RPAP3,转染293T细胞,收病毒感染MCF7细胞,嘌呤霉素筛选获得稳定转染细胞系,流式细胞分析对细胞周期的影响。结果:RPAP3在多物种广泛存在,有高度保守性;蛋白存在典型核定位信号,激光共聚焦显微镜下,GFP标记的RPAP3蛋白主要分布在细胞核;酵母双杂交和GST-Pulldown实验证实RPAP3与HSP70间存在相互作用,且作用发生在RPAP3的三联TPR结构域和HSP70的GPTIEEVD末端之间;流式细胞显示RPAP3 TPR区域的高表达阻滞细胞周期且凋亡增加。结论:RPAP3与HSP70间的相互作用发生在RPAP3的三联TPR结构域和热休克蛋白70的GPTIEEVD末端之间;构建高表达细胞株发现其对细胞周期及凋亡有影响。     

LysM结构域及其与植物-真菌相互作用的关系

在长期的进化过程中,植物与真菌之间形成了复杂而又紧密的联系,其中最主要的就是侵染与防御的关系。植物的抗病性由于涉及农作物、林木的生长与产量,逐渐成为研究热点。在植物免疫系统中,对病原真菌的识别是一个重要环节。目前认为在这一过程中,LysM结构域起到了极为关键的作用。植物细胞膜上有含LysM结构域的识别受体,该受体可以结合真菌细胞壁上的几丁质,并将信号传递到胞内,从而启动免疫反应。在真菌中,同样具有含LysM结构域的基因,主要是一类效应因子。它们可能参与真菌在侵染过程中的"伪装",以逃避植物的识别。该文以LysM结构域在植物-真菌相互作用中扮演的角色为着眼点,讨论有关研究的意义与趋势,并对如何利用LysM结构域的相关研究进行有效的抗病育种提出了新的设想。     

游仆虫肽链释放因子eRF1对编程性翻译移码的影响

编程性翻译移码是mRNA翻译为多肽链时核糖体沿mRNA正向或反向滑动1个碱基才能表达出1个完整多肽链的现象. 人的肽链释放因子eRF1对HIV-1病毒的编程性-1移码有直接的影响. 而且在频繁发生编程性+1移码的单细胞真核生物游仆虫中,肽链释放因子eRF1对编程性移码也有明显的影响. 为进一步研究eRF1中影响编程性翻译移码的关键序列及调控机理,本研究将含有不同终止密码子的移码序列和已报道的游仆虫移码基因Ndr2分别插入双荧光素酶报告基因中,成功建立了可在酵母中进行研究的编程性移码报告检测体系. 利用游仆虫肽链释放因子Eo-eRF1b的N结构域和酵母肽链释放因子Sc eRF1的MC结构域构建了杂合肽链释放因子(Eo/Sc eRF1),检测Eo-eRF1b N结构域中的不同突变位点对移码效率的影响. 结果表明,游仆虫肽链释放因子eRF1b中YCF区的突变能明显促进含终止密码UAA的移码序列的移码,推测这可能是由于eRF1突变体降低了对UAA的识别所导致. 此外,杂合肽链释放因子Eo/Sc eRF1能够有效地提高移码基因Ndr2的移码效率. eRF1b中YCF区的突变同样能明显促进 Ndr2的移码. 因此, 游仆虫肽链释放因子YCF区的特殊序列可能是这种生物中发生编程性移码频率较高的原因之一. 本研究为探讨纤毛虫编程性翻译移码调控机制提供了实验数据.     

Identification of eRF3b,a Human Polypeptide Chain Release Factor with eRF3 Activity in vitroand in vivo

Termination of translation in eukaryotes is governed by the ribosome, a termination codon in the mRNA, and two polypeptide chain release factors (eRF1 and eRF3). We have identified a human protein of 628 amino acids, named eRF3b, which is highly homologous to the known human eRF3 henceforth named eRF3a. At the nucleotide and at the amino acid levels the human eRF3a and eRF3b are about 87% identical. The differences in amino acid sequence are concentrated near the amino terminus. The most important difference in the nucleotide sequence is that eRF3b lacks a GGC repeat close to the initiation codon in eRF3a. We have cloned the cDNA encoding the human eRF3b, purified the eRF3b expressed in Escherichia coli, and found that the protein is active in vitroas a potent stimulator of the release factor activity of human eRFl. Like eRF3a, eRF3b exhibits GTPase activity, which is ribosome- and eRFl-dependent. In vivoassays (based on suppression of readthrough induced by three species of suppressor tRNAs: amber, ochre, and opal) show that the human eRF3b is able to enhance the release factor activity of endogenous and overexpressed eRF1 with all three stop codons.     

NMR assignments of the C-terminal domain of human polypeptide release factor eRF1

We report NMR assignments of the protein backbone of the C-terminal domain (163 a.a.) of human class 1 translation termination factor eRF1. It was found that several protein loop residues exist in two slowly interconverting conformational states.     

Structure and dynamics in solution of the stop codon decoding N-terminal domain of the human polypeptide chain release factor eRF1

The high-resolution NMR structure of the N-domain of human eRF1, responsible for stop codon recognition, has been determined in solution. The overall fold of the protein is the same as that found in the crystal structure. However, the structures of several loops, including those participating in stop codon decoding, are different. Analysis of the NMR relaxation data reveals that most of the regions with the highest structural discrepancy between the solution and solid states undergo internal motions on the ps-ns and ms time scales. The NMR data show that the N-domain of human eRF1 exists in two conformational states. The distribution of the residues having the largest chemical shift differences between the two forms indicates that helices α2 and α3, with the NIKS loop between them, can switch their orientation relative to the β-core of the protein. Such structural plasticity may be essential for stop codon recognition by human eRF1.     

Role of Proteins Interacting with the eRF1 and eRF3 Release Factors in the Regulation of Translation and Prionization

Molecular Biology - The review discusses the role that proteins interacting with the translation termination factors eRF1 and eRF3 play in the control of protein synthesis and prionization. These...     

Proteasomal degradation of human release factor eRF3a regulates translation termination complex formation

In eukaryotes, eRF1 and eRF3 are associated in a complex that mediates translation termination. The regulation of the formation of this complex in vivo is far from being understood. In mammalian cells, depletion of eRF3a causes a reduction of eRF1 level by decreasing its stability. Here, we investigate the status of eRF3a when not associated with eRF1. We show that eRF3a forms altered in their eRF1-binding site have a decreased stability, which increases upon cell treatment with the proteasome inhibitor MG132. We also show that eRF3a forms altered in eRF1 binding as well as wild-type eRF3a are polyubiquitinated. These results indicate that eRF3a is degraded by the proteasome when not associated with eRF1 and suggest that proteasomal degradation of eRF3a controls translation termination complex formation by adjusting the eRF3a level to that of eRF1.