IKKα的研究进展

IκB激酶(IKK复合体)是NF-κB信号转导途径成员之一,包括3个亚基:催化亚基IKKα、IKKβ和调节亚基IKKγ。无刺激时,NF-κB与抑制蛋白IκB家族的一个成员结合,或者与无活性前体(如p100)结合而以无活性形式存在。在外界信号如TNF-α或淋巴毒素β等刺激下,经过复杂的信号转导,IKK复合体被激活,导致IκB和(或)p100发生磷酸化,结果NF-κB被释放出来,进入细胞核内激活靶基因。最新研究发现在TNF-α刺激下,IKKα可直接进入细胞核内,通过催化组蛋白H3磷酸化进而激活特定NF-κB应答基因的表达。IKKα是首次发现的信号转导途径中直接进入细胞核内调节基因表达的上游成分,为NF-κB信号转导途径的研究开辟了新的道路。     

IKKα通过不同机制介导生长促进和生长抑制信号诱导的c-Fos表达和AP-1活化

目的:探讨IKK激酶催化亚基IKKα在分别介导生长促进信号(血清)和生长抑制信号(紫外线UVB)诱导的反应中,调控转录因子AP-1关键组成亚基c-Fos实现诱导表达的信号传递机制。方法:分别采用Western印迹、RT-PCR和萤光素酶报道分析系统检测血清和紫外线刺激反应状态下IKKα对c-Fos诱导表达和AP-1诱导活化的调控作用;通过转染I-κBα功能抑制型突变体I-κBα-AA,观察NF-κB诱导活化受抑时,c-Fos诱导表达和AP-1诱导活化水平的改变情况。结果:IKKα在生长促进和生长抑制信号诱导的反应中,都能够实现对转录因子AP-1及其关键组成亚基c-Fos诱导表达的调控作用。其中,在血清反应中IKKα可通过NF-κB依赖方式在转录水平调控c-Fos的诱导表达,而在UVB反应中IKKα通过转录非依赖方式调控c-Fos的诱导表达。结论:IKKα能分别以NF-κB依赖和非依赖方式参与调控生长促进和生长抑制信号诱导的反应。     

IκB激酶的激活及其在NF-κB活化过程中的作用

在NF-κB二聚体活化过程中,IκB激酶（IKK）通过对抑制性蛋白κB(IκBs)的磷酸化而扮演关键的角色.IKK复合物在胞浆内有多种存在形式,其中,IKK-α、IKK-β两者氨基酸序列52%的同源性,空间构象相似,常为催化亚单位,而IKK-γ则为调节亚单位,它们以不同的方式活化IκBs.核因子κB诱导激酶（NIK）与丝裂原活化蛋白激酶激酶激酶-1（MEKK₁）均为IKK的上游激酶,NIK可引起IKK-α Ser176、IKK-β相应位点的磷酸化,而MEKK₁主要引起IKK-β的活化.通过级联反应,使IκBs磷酸化而与NF-κB解离,致使NF-κB被激活并易位入核,启动免疫及炎症相关的基因转录.     

IKK激酶的NF-κB非相关性功能研究进展

IKK复合物由IKKα、IKKβ和IKKγ组成,是NF-κB通路中的重要分子,主要调控NF-κB通路的活化。近年的研究发现,IKK复合物还存在许多NF-κB非相关性的功能,主要涉及肿瘤发生、应激反应、转录调控、免疫功能及细胞周期调控等方面。IKK复合物的NF-κB非相关性的功能研究集中于IKKα和IKKβ亚基,并且存在激酶活性依赖和非依赖2种作用方式。对于该功能的深入探讨,对全面理解IKK分子的生理病理功能十分重要,并且为IKK分子的研究提出了一个新的方向。     

MyD88抑制乙型肝炎病毒复制依赖活化NF-κB信号通路

目的 研究髓样细胞分化蛋白(MyD88)抗乙型肝炎病毒(HBV)效应的作用机制。方法 构建MyD88的截短突变体,获得核因子kappa B(NF-κB)超抑制剂IkBa-SR或者NF-κB信号通路激活剂IKKα/IKKβ的表达质粒,分别与HBV复制型质粒瞬时转染Huh7细胞,检测细胞上清液中HBeAg,HBsAg的表达以及胞质中HBV复制中间体DNA的含量,并以NF-κB依赖的荧光素酶报道系统检测它们活化NF-κB的程度。结果 MyD88全长蛋白和2个截短突变体M(1-151)、M(151-296)活化NF-κB的程度与其抑制HBV蛋白以及复制中间体DNA合成的能力相一致。与空载相比,表达NF-κB信号通路激活剂IKKα/IKKβ的质粒共同瞬转细胞后,转染MyD88和HBV表达质粒的细胞中NF-κB的通路明显活化,同时HBV core蛋白的合成显著降低;而NF-κB的超抑制剂IκBα-SR共同瞬转的细胞中core蛋白的表达量显著增加,检测细胞培养上清液中HBeAg和HBsAg及胞质中HBV复制中间体DNA的合成,得到相似结果。结论 NF-κB信号通路的活化在MyD88抑制HBV复制中发挥了关键作用     

NF-κB、IκB、IKK在非小细胞肺癌中的表达及意义

目的检测非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)中NF-κB P65、p-IκBα(IκBα磷酸化)、p-IKKβ(IKKβ磷酸化)的表达情况及其与NSCLC临床特征的关系。方法采用免疫组化Elivision法检测NF-κB P65、p-IκBα、p-KKβ在56例NSCLC中表达情况,以20例癌旁组织作为对照。结果在NSCLC中NF-κB P65、p-IκBα、p-IKKβ的表达阳性率分别为83.9%(47/56)、55.7%(31/56)、69.6%(39/56),癌旁组织三者分别为20%(4/20)、25%(5/20)、30%(6/20),NF-κB P65、p-IκBα、p-IKKβ的表达与吸烟史、TNM分期、淋巴结转移相关,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 NF-κB P65、p-IκBα、p-IKKβ高表达与NSCLC的发生、发展起着重要作用。     

关于IL-10抗炎机制的研究

IL-10属于细胞因子中的干扰素家族,研究发现内源性和外源性的IL-10均能在转录水平上强烈抑制IL-1、IL-6、IL-8肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、GM-CSF、G-CSF的合成.近十年来,研究认为IL-10主要是通过抑制IKK的激活或NF-κB的DNA结合能力,从而抑制NF-κB启动相关前炎症因子基因的转录.但同时,国外也报道过IL-10抑制炎症细胞因子如TNF-α的合成可能与NF-κB无关,而与如AP-1,细胞因子信号抑制子-3(SOCS-3)等其他蛋白相关.另一方面,最近随着对NOD家族成员NOD2及其同源异构体的深入研究,有证据表明IL-10对NF-κB的作用可能不仅仅局限在IKK(IκB的激酶)及其下游的水平上,而在上游也会造成影响.     

热休克蛋白27在转移潜能不同人肝癌细胞系中的表达及机制研究

利用不同转移潜能肝癌细胞系探讨热休克蛋白27(HSP27)参与肝癌细胞转移潜能形成的可能分子机制.细胞免疫荧光技术、RT-PCR和免疫印迹技术显示,HSP27在转移潜能不同的肝癌细胞Hep3B、MHCC97L和MHCC97H中定位于细胞浆,亦可见于细胞核,HSP27 mRNA和蛋白质的表达水平与肝癌细胞转移潜能呈正相关.高转移潜能肝癌细胞系MHCC97H的HSP27 RNA干扰试验结果显示,HSP27 RNA干扰后MHCC97H的侵袭(MHCC97H组:21.36±2.92;对照RNAi组:19.88±2.23;RNAi组:11.40±2.05)、运动能力(MHCC97H组:26.35±3.29;对照RNAi组:24.43±3.17;RNAi组:10.92±2.27)明显减弱,细胞凋亡显著增加(MHCC97H组:15.12%;对照RNAi组:17.56%;RNAi组:27.64%).同时进行信号转导基因芯片检测发现,HSP27干扰后核因子κB(NF-κB)通路抑制,并且免疫印迹显示细胞核内活化的NF-κBp65减少,细胞内磷酸化IκBα降低.另外,免疫共沉淀检测发现,在肝癌细胞内HSP27可与IKKβ、IκBα共沉淀,且在HSP27RNA干扰后IKKβ与IKKα结合能力下降.这些结果提示,HSP27可能通过参与细胞内NF-κB通路的激活,影响细胞凋亡和细胞运动,在肝癌细胞侵袭转移过程中发挥作用.     

旋覆花内酯抑制炎性因子介导的内皮细胞与单核细胞的黏附

为了观察旋覆花内酯(1-O-acetylbritannilactone,ABL)乙酰化衍生物ABLO2对脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)/干扰素-γ(interferon-γ,IFN-γ)刺激的内皮细胞ECV304活化及其与RAW264.7单核/巨噬细胞相互作用的影响,采用Western印迹检测核因子-Κb(nuclear factor-Κb,NF-Κb)活化以及NF-Κb依赖的黏附分子的表达水平,应用电泳迁移率改变分析(electrophoretic mobility shift assay,EMSA)检查ABLO2预处理及LPS/IFN-γ诱导对NF-Κb与DNA结合活性的影响.结果显示,ABLO2显著抑制LPS/IFN-γ诱导的NF-Κb核转位和DNA结合活性,同时ABLO2降低NF-Κb抑制蛋白(IκB)激酶(IκB kinases,IKK)的活性,抑制IκB的磷酸化及降解;ABLO2还通过减少血管细胞黏附分子-1(vascular cell adhesion molecule-1,VCAM-1)、骨桥蛋白(osteopontin,OPN)、基质金属蛋白酶-9(metalloproteinase-9,MMP-9)、黏蛋白-C(tenascin-C)的表达,进而减弱单核细胞与内皮细胞之间的黏附作用.研究结果表明,ABLO,通过抑制IKK活性及IκB降解而抑制NF-Κb治化,进而起到抑制NF-KB依赖的黏附分子表达及细胞黏附作用.     

绝经后骨质疏松症TNF-α通过激活NF-κB促进RANKL诱导的破骨细胞形成

本研究检测了绝经后骨质疏松症妇女的肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和雌激素水平,并探讨了TNF-α对破骨前体细胞RAW264.7中破骨细胞标志物核因子κB受体激活因子(nuclear factor kappa-B, RANK)、组织蛋白酶K (Cathepsin K, CTSK)和凝血酶受体激活肽(thrombin receptor activating peptide, TRAP)以及核因子-κB (NF-κB)亚基(p65)和NF-κB抑制蛋白(IκBα)的影响。研究结果表明,绝经后骨质疏松症患者的TNF-α水平显著升高,而雌二醇水平显著降低。核因子κB受体激活因子配体(receptor activator for NF-κBligand, RANKL)处理1周后,破骨前体细胞RAW264.7中破骨细胞标志物RANK、CTSK和TRAP的mRNA和蛋白高度表达。与RANKL对照组相比,TNF-α处理可上调RANK、CTSK和TRAP m RNA的表达。但是,仅TNF-α不能诱导培养的RAW264.7细胞分化为破骨细胞成。TNF-α以剂量依赖性方式诱导NF-κB亚基p65和IκBα磷酸化,而NF-κB抑制剂处理则有效降低了RANK和TRAP的表达。本研究结论表明,绝经后骨质疏松症中TNF-α通过激活NF-κB来促进RANKL诱导的破骨细胞形成。     

遍在蛋白调节NF-κB信号转导通路的研究进展

NF-κB信号通路参与了多种基因的转录调控和很多重要的生理和病理过程.遍在蛋白在其中的不同的阶段发挥了不同的作用.一方面通过遍在蛋白化IκB,促使其被26S蛋白酶体识别而降解,从而释放出NF-κB进入核内,调控相应基因的表达;另一方面通过遍在蛋白化TRAF6来激活TAK1,然后进一步活化IKK.后一种途径为了解NF-κB信号通路的调控提供了新的线索,并为遍在蛋白功能的研究开辟了新的方向.     

乙肝病毒X蛋白结合蛋白(HBXIP)增强肝癌细胞NF-κB转录活性的实验研究

前期研究结果表明,乙型肝炎病毒X蛋白结合蛋白(hepatitis B virus X-interacting protein,HBXIP)具有促进细胞增殖的作用.为了进一步阐明其分子机制,观察了HBXIP对核因子κB(NF-κB)转录活性的影响.实验中通过基因共转染将NF-κB报告基因质粒pNF-κB-Luc和HBXIP真核表达载体pcDNA3-hbxip导入人肝癌H7402细胞系中,进行荧光素酶活性分析.结果显示:H7402细胞过表达HBXIP后NF-κB的转录活性明显增强;此外,基因转染后经免疫印迹检测显示,与NF-κB二聚体结合的抑制亚基IκBα的磷酸化水平明显增加;同时,提取H7402细胞的核蛋白,然后应用免疫印迹检测细胞核中p65/NF-κB的水平.结果显示,H7402细胞中HBXIP过表达后细胞核中p65/NF-κB的水平明显增加.当应用RNA干扰技术抑制了细胞内源性的HBXIP基因表达后,则出现与上述结果相反的效果.上述结果提示,HBXIP可增加核内p65/NF-κB蛋白水平,进而发挥NF-κB促转录调控的作用.因此,HBXIP可通过调控NF-κB信号途径而促进细胞增殖.     

银杏叶提取物对内毒素诱导巨噬细胞核因子-κB活化及炎性细胞因子表达的调节

探讨银杏叶提取物（EGb761）对内毒素（LPS）诱导RAW264．7细胞核因子-κB（NF-κB）活化及炎性细胞因子基因表达的调节,为银杏叶提取物的临床运用提供理论依据．分别用LPS或EGb761＋LPS处理体外培养的小鼠巨噬细胞系RAW264．7细胞,采用蛋白质印迹分析检测细胞中NF-κB活性,用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）和酶联免疫吸附法（ELISA）检测细胞中TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA和蛋白的表达．研究结果表明LPS组NF-κB活性和TNF-α、IL-1β、IL-6含量在刺激后2～12h明显高于正常对照组,而EGb761＋LPS组NF-κB活性和TNF-α、IL-1β、IL-6含量均显著低于LPS组．结果提示LPS可诱导RAW264．7细胞NF-κB活化,导致TNF-α、IL-1β、IL-6基因表达增强,而EGb761能抑制NF-κB活化而调节TNF-α、IL-1β、IL-6基因的表达．     

肿瘤坏死因子α通过激活NF-κB信号通路加快肝细胞周期进程

在慢性炎症部位有易发肿瘤的倾向,大约有20%的恶性肿瘤发生与慢性炎症相关,肝细胞癌是世界第三大癌症死亡病因,其患者多数有慢性炎症病史,当炎症慢性迁延,肝细胞癌发生率明显增加.但慢性炎症与肿瘤发生与发展的细胞和分子机制仍然不清楚.利用人肝细胞株L-02细胞,研究肿瘤坏死因子α(TNF-α)对细胞周期的影响及其机制,并探讨核因子κB(NF-κB)和ERK1/2活化对细胞周期的影响,以期能更确切地阐明炎症介质TNF-α在肝细胞癌发生发展中的作用.发现TNF-α能促进肝细胞从G0/G1期向S期转换.蛋白质印迹检测表明,TNF-α能以剂量依赖方式诱导cyclinD1表达,而对cyclinE的表达无明显影响.同时TNF-α能激活NF-κB,ERK1/2,抑制NF-κB活化降低了TNF-α诱导的cyclinD1表达,导致细胞周期阻滞于G0/G1期.抑制ERK1/2活化则对细胞周期和cyclinD1表达无显著影响.结果提示,TNF-α通过活化NF-κB信号通路,诱导cyclinD1表达,加快细胞周期进程,这可能是促进肿瘤的发生发展重要机制.针对TNF-α和NF-κB的治疗可能延长慢性炎症相关性肿瘤的潜伏期和抑制肿瘤的发展.     

灰飞虱中IKK相关基因的鉴定及其在水稻条纹病毒侵染中的功能

【目的】本研究旨在鉴定灰飞虱Laodelphax striatellus中的IκB激酶(IκB kinase,IKK)相关基因,并调查其在灰飞虱抗病毒中的作用,以进一步深入理解传毒介体应对植物病毒的先天免疫机制。【方法】通过生物信息学鉴定了灰飞虱基因组中IKK相关基因;以无毒及水稻条纹病毒(rice stripe virus,RSV)侵染的灰飞虱为材料,利用RT-PCR方法检测IKK相关基因在无毒灰飞虱各个龄期(卵、1-5龄若虫、雄成虫和雌成虫)及成虫不同组织(肠道、唾液腺、血淋巴、脂肪体、卵巢和精巢)中的表达量;利用qRT-PCR方法检测无毒以及RSV侵染后的灰飞虱IKK相关基因在各个龄期及成虫不同组织中的表达量;通过对3龄若虫注射IKK基因dsRNA进行RNA干扰后,利用qRT-PCR检测带毒灰飞虱中表示病毒含量的RSV外壳蛋白(CP)基因转录水平。【结果】在灰飞虱基因组中鉴定到了两个IKK相关基因即IKKα(GenBank登录号:MK903504)和TANK结合激酶1(TANK-binding kinase1)基因TBK 1(GenBank登录号:MN124506)。IKKα开放阅读框长2379 bp,编码792个氨基酸;TBK 1开放阅读框长1551 bp,编码516个氨基酸。两个基因编码的蛋白都具有1个保守的丝氨酸/苏氨酸激酶结构域和1个泛素折叠结构域。RT-PCR结果表明,IKKα和TBK 1在无毒灰飞虱各个龄期及成虫不同组织中均有表达。qRT-PCR分析结果表明,IKKα和TBK 1在RSV侵染后的灰飞虱各个龄期及成虫不同组织中的表达水平与其在无毒灰飞虱中的表达量之间存在明显差异。进一步将RSV侵染后的灰飞虱3龄若虫中的IKKα和TBK 1干扰后,带毒灰飞虱中的RSV含量显著上升。【结论】本研究结果表明,NF-κB信号途径中的两个重要基因IKKα和TBK 1在灰飞虱中广泛表达,且在灰飞虱抵御RSV的侵入过程中可能具有重要功能。这些结果为今后进一步深入研究NF-κB免疫通路在灰飞虱抗病毒中的功能提供了丰富的基础信息。     

酪蛋白激酶Iα与细胞信号通路

酪蛋白激酶Ⅰα(Casein kinase 1α,CK1α)广泛分布于各类真核生物中,是CK1家族的7个成员(CK1α、β、γ1、γ2、γ3、δ和ε)之一,序列结构高度保守。在哺乳动物中,CK1α参与多种细胞生理过程,包括膜转运,细胞周期,染色体分离,细胞凋亡和细胞分化等。此外,CK1α还参与Wnt/β-Cat,Hh及NF-κB等信号通路。将CK1α在各类信号通路的具体功能作一综述,为进一步研究其在信号通路中的地位提供参考。     

IKKα参与表皮分化和皮肤癌中的信号通路

IKK(inhibitor of NF-κBkinase)复合体的催化亚基IKKα,调节NF-κB激活。在表皮组织中,IKKα已被证明是一个调节角质细胞增殖、分化和致癌性转化的关键调节子,它在阻止皮肤角质层角质细胞和真皮层成纤维细胞转化为恶性肿瘤方面扮演了重要角色,这一发现为预防皮肤癌提供了新的治疗标靶。本文总结了IKKα在表皮分化和皮肤癌中有关的信号通路,以及它们所形成的一个以IKKα为中心的信号网络,这为研究皮肤分化及皮肤癌的发病机理提供了理论基础和新视角。     

NF-κB“圈套”抑制PC12细胞中NF-κB活性模型的建立

目的:观察NF-κB"圈套"(κB-decoy)寡核苷酸对LPS诱导PC12细胞中NF-κB活化的抑制过程,建立κB-de-coy抑制NF-κB活化的细胞模型。方法:将培养于6孔板的PC12细胞进行分组转染,实验组:LF2000+κB-decoy(6μg/well);对照组:LF2000+错配-decoy;正常组:LF2000。转染48h后,加入LPS(200ng/ml),作用0.5～4h。分别用免疫细胞化学染色和Westernblot方法检测PC12细胞内NF-κB的表达及活化。结果:与正常组相比较,转染错配-decoy的对照组细胞,随着LPS刺激时间的延长,NF-κB的表达和活化明显增加(P0.01),2～4h达到高峰;与对照组相比较,转染κB-decoy实验组的PC12细胞,随着LPS刺激时间的延长,NF-κB的表达处于较稳定水平,在LPS刺激的各时间点中明显低于对照组(P0.01)。结论:κB-decoy可以降低生理状态下PC12细胞内NF-κB的正常表达水平,抑制病理状态下NF-κB的活化。     

NF-κB荧光素酶报告基因系统的构建及验证

为了定量检测NF-κB的活化效果及筛选与NF-κB活化调控相关的药物,通过去除逆转录病毒载体pQCXIP原有的CMV启动子,并分别插入NF-κB增强子序列及荧光素酶NanoLuc报告基因序列,构建了一种新的含有NF-κB增强子序列和NanoLuc(NLuc)报告基因序列的表达载体,并进一步建立受NF-κB调控的稳定表达NLuc荧光素酶的细胞系。酶切鉴定及测序结果表明成功构建了重组质粒pQCXIP-NF-κB-NLuc;NF-κB信号通路的刺激物肿瘤坏死因子TNF-α作用于构建的稳定表达NLuc的细胞系后出现特异性的荧光素酶反应,且该酶反应与TNF-α的刺激呈良好的时间、剂量依赖性,该结果表明受NF-κB调控的稳定表达NLuc荧光素酶的细胞系构建成功。实例验证中,NF-κB抑制剂雷公藤甲素对此细胞系NLuc荧光素酶表达的抑制呈剂量效应。综上,本实验构建的受NF-κB调控的稳定表达NLuc荧光素酶的报告基因系统可用于NF-κB的活化效果的定量检测及筛选与NF-κB活化调控相关的药物,具有研究和应用价值。