大麦β-1,3-葡聚糖酶基因(GⅢ)启动子在转基因水稻中的诱导表达

将大麦β-1,3-葡聚糖酶同功酶基因(GⅢ)启动子(PGⅢ)与其报告基因gus(β-葡聚糖酸醛苷酶基因)耦联,构建植物表达载体,通过农杆菌介导法转化水稻.PCR、DNA印迹法结果显示,构建的pGⅢ-gus表达载体已整合到水稻基因组DNA中.GUS组织化学染色、RNA印迹法及荧光法结果显示,该启动子驱动的gus在水稻叶片中为低水平表达;而用水扬酸(SA)与稻瘟菌来源的激发子处理,可诱导gus的高水平表达.T1代种子的GUS组织化学染色结果也表明,SA与激发子可以诱导高水平的PGⅢ活性.这些结果表明PGⅢ是一种强诱导型启动子,并可能是一种病原菌诱导型的启动子.     

花生β-1,3-葡聚糖酶基因启动子的克隆及功能分析

植物β-1,3-葡聚糖酶属于一种重要的植物病程相关蛋白（PR蛋白）,容易受到激发子的诱导而积累。用1.5 mmol/L水杨酸 （Salicylic Acid,,SA）对花生品种花育20号幼苗进行诱导处理,提取RNA利用 Real-time PCR技术检测β-1,3-葡聚糖酶基因的表达量。结果表明经诱导后24h,β-1,3-葡聚糖酶基因的表达量达到最高,是未经SA诱导的1.8倍。根据花生β-1,3-葡聚糖酶基因 cDNA序列（GenBank JQ801335）设计三个嵌套的5＇端特异引物,以花育20号基因组DNA为模板,利用TAIL-PCR方法扩增得到973bp的花生β-1,3-葡聚糖酶基因上游启动子片段, ,命名为Ah-Glu-Pro,,在NCBI网站注册序列号为GenBank KC290400。PLACE 和 PlantCARE 启动子在线预测分析表明,Ah-Glu-Pro序列中含有TATA-box和CAAT-box等核心元件,还含有病原菌及SA响应的顺式调控元件。根据Ah-Glu-Pro序列设计上下游引物,采用普通PCR法从花育20号基因组中扩增得到931bp的启动子序列,命名为Ah-Glu-P。将Ah-Glu-P取代pCAMBIA1301质粒中的CaMV35S启动子,构建植物表达载体 pCAMBIA1301-Ah-Glu-P。通过农杆菌介导法将 pCAMBIA1301-Ah-Glu-P 转化洋葱表皮细胞,经5.0 mmol/L SA诱导处理48h后进行GUS染色。结果表明：经SA诱导后的洋葱表皮细胞GUS染色显示为蓝色,未经诱导的洋葱表皮细胞GUS染色未显示蓝色,说明Ah-Glu-P是一个诱导型的启动子,可能含有对SA响应的顺式调控元件。     

高羊茅FaChit1基因启动子的功能分析

用含有不同长度FaChitl基因启动子区域与GUS基因融合构建植物表达载体pFaChitlP—I、pFaChitlP-Ⅱ以及pFaChitlP-Ⅲ并分别对烟草进行转化,经真菌激发子、干旱、机械损伤以及乙烯等多种胁迫处理后测定GUS活性。启动子缺失分析实验结果显示,真菌激发子对FaChitl基因启动子所介导的GUS诱导表达效果最强,而机械损伤只能微弱地诱导GL靥基因表达;FaChitl基因启动子-651bp以内的序列均能介导GUS基因的诱导表达,同时-935bp与-233bp之间的区域是该启动子响应真菌激发子、乙烯以及机械损伤胁迫所必需的。表明FaChitl启动子是一个多胁迫诱导型启动子。     

甜瓜黄瓜素基因启动子表达载体的构建及分析

该研究构建了由黄瓜素基因5′端310bp启动子序列驱动β-葡萄糖醛酸酶(GUS)报告基因的植物表达载体pPZP-CGN,通过花粉管通道法将植物表达载体pPZP-CGN导入甜瓜,并采用荧光法定量测定转基因植株中GUS活性。结果显示,gus基因在果实中高表达,而在根、茎、叶等组织中表达活性很低,表明黄瓜素基因上游310bp启动子具有指导外源基因在果实中高效特异表达的特性。     

水杨酸诱导山葡萄Class Ⅲ几丁质酶基因VCH3启动子在转基因烟草维管组织中的表达

从山葡萄(Vitis amurensis Rubr.)叶片中分离到长度为1 216 bp的山葡萄ClassⅢ几丁质酶基因VCH3的5′端非编码区(GenBank number AF441123),并发现有两个反向水杨酸(SA)顺式作用元件(TGACG)分别位于转录起始位点上游-1 181 bp和-293 bp处.为了鉴定VCH3启动子的功能,我们将该启动子的4个缺失片段(-1 187 bp～ 7bp,-892 bp～ 7 bp,-589 bp～ 7 bp及-276 bp～ 7 bp)分别连接到β-葡糖苷酸酶基因(GUS)编码区的上游,构建成4个融合基因,并利用农杆菌介导叶盘转化法将这4个融合基因转入烟草(Nicotiana tobacum L.)栽培品种NC89中.SA处理的转基因烟草根系GUS酶活性的荧光检测结果表明:只含有TATA盒和CAAT盒而缺失了所有SA顺式作用元件的VCH3(-276)GUS表达盒对SA处理表现出较低程度的诱导性;只包含一个SA顺式作用元件的VCH3(-589) GUS或VCH3(-892)GUS表达盒表现出相似的较高水平的GUS酶活性;而包含两个SA顺式作用元件的全长启动子片段(-1 187 bp～ 7 bp)驱动了最强的GUS酶活性,这说明VCH3启动子诱导的GUS酶活性的最大量表达需要两个SA顺式作用元件的协同作用.GUS酶的组织化学分析结果表明,在SA处理的转基因烟草根横切面中,VCH3启动子4个缺失片段驱动的GUS酶活性在维管组织中的表达活性均强于在外皮层和内皮层的表达活性,因此SA诱导的VCH3启动子维管组织特异性表达元件可能位于-276 bp～ 7 bp之间.以上结果显示,该启动子将在基因工程中具有较大的应用潜力.     

拟南芥冷诱导型启动子CBF 3的克隆及活性检测

目的：构建冷诱导型启动子CBF3基因的植物表达载体,并将其转入烟草。方法：以拟南芥基因组DNA为模板,通过特异PCR扩增,克隆冷诱导表达启动子CBF3（C-repeat binding factor）。用CBF3启动子替换pBI121载体上的35S启动子构建新的载体pBC-GUS,通过农杆菌介导的叶盘法转化烟草。结果：获得了转基因烟草,转基因烟草的GUS组织化学染色及PCR分析结果表明,在低温诱导下,CBF3启动子可增强GUS基因表达。结论：CBF3启动子可应用于植物抗冷基因工程研究。     

玉米Ubi-1启动子在可育转基因玉米植株中的表达活性

本工作将玉米泛素基因-1启动子(Ubi-1)与大肠杆菌β-葡糖苷酸酶基因(gus,uidA)的编码区融合,通过基因枪粒子轰击方法转化来自玉米未成熟胚盾片组织的I-型愈伤组织,经PPT选择获得可育的玉米转基因植株,并采用组织化学方法分析了Ubi-1启动子驱动的gus基因在不同组织、细胞中的表达活性,发现gus基因在除花药壁以外的其它所试组织中均可以有效表达.UbiGUS在花粉、卵细胞和T1代转基因植株未成熟胚中的表达显示该启动子在植株发育的早期阶段即具有活性.对T0代转基因植株的花粉进行GUS组织化学染色,gus基因呈11分离,显示外源基因在转基因植株中以孟德尔方式遗传.同时发现,使用玉米本身的启动子Ubi-1可以降低外源基因在转基因玉米中的拷贝数,进而避免基因沉默现象的发生.目前已得到第二代转基因种子.     

玉米Ubi－1启动子在可育转基因玉米植株中的表达活性

本工作将玉米泛素基因－1启动子（Ubi-1)与大肠杆菌β－葡萄糖苷酸酶基因（gus,uidA)的编码区融合,通过基因枪粒子轰击方法转化来自水成熟胚盾片组织的I－型愈伤组织,经PPT选择获得可育的玉米转基因植株,并采用组织化学方法分析了Ubi-1启动子驱动的gus基因在不同组织,细胞中的表达活性,发现gus基因在除花药壁以外的其它所试组织中均可以有效表达。Ubi：GUS在花粉,卵细胞中T1代转基因植株未成熟胚中的表达显示该启动子在植株发育的早期阶段即具有活性。对T0代转基因植株的花粉进行GUS组织化学染色,gus基因呈1：1分离,显示外源基因在转基因植株中以孟德尔方式遗传。同时发现,使用玉米本身的启动子Ubi-1可以降低外源基因在转基因玉米中的拷贝数,进而避免基因沉默现象的发生。目前已得到第二代转基因种子。     

ocs/mas|一个受损伤和植物激素诱导的嵌合启动子的构建与功能分析

选择适宜的转录调控序列以提高启动子的转录效率,增强外源基因在转基因植株中的表达,对改良作物的抗病虫性具有重要意义。将甘露碱合成酶基因(mas)启动子和章鱼碱合成酶基因(ocs)增强子杂合而成的嵌合启动子ocs/mas与GUS报告基因连接,构建了植物表达载体pOMS-GUS。对照载体pMAS-GUS仅携带mas启动子驱动的GUS基因。利用根癌农杆菌介导法,将以上植物表达载体分别转化烟草。应用半定量RT-PCR和GUS荧光定量分析法分别检测不同胁迫条件下启动子驱动的GUS基因表达量的变化。结果显示,未诱导处理的转基因植株GUS基因仅有微弱表达。伤害处理1h后,mas启动子驱动的GUS活性是未诱导处理的1.8倍,而嵌合启动子ocs/mas的诱导表达活性是未处理的5.7倍。植物激素水杨酸(SA)和茉莉酸甲酯(MJ)处理也诱导了较高水平的ocs/mas嵌合启动子活性;而且SA和MJ联合作用时呈现叠加效应,转基因烟草的GUS活性明显高于伤害处理后的GUS表达水平。以上结果表明,ocs/mas嵌合启动子是一种强诱导型启动子,可以接受多种刺激因子的诱导,从而为更有效地改良作物抗病虫的能力提供新的候选高效启动子元件。     

水稻Xa21基因启动子序列分析及其在不同条件下的表达特征

以水稻品种‘日本晴’(Oryza sativa‘Nipponbare’)为实验材料,根据GenBank上公布的同品种水稻的基因组DNA序列设计1对引物,对水稻Xa21基因启动子进行克隆并测序,通过PCR扩增获得的Xa21基因启动子序列长1 982 bp,其中除包含启动子基本元件外,还包含一些与逆境信号相关的元件(GCC-box、A-box、TC-rich repeats、MBS、LTR和W-box等)。利用GUS组织化学染色和定量分析方法,研究了转基因水稻T1代株系不同器官和发育阶段Xa21基因启动子的表达特异性及其在不同逆境和激素处理条件下的表达特征,结果显示:在转基因水稻的叶、茎和根部均能检测到GUS活性,但根部GUS活性最高,特别是在根尖的中柱区活性最强;随苗龄增长(3叶期、5叶期和8至9叶期)叶片中GUS活性逐渐增加,8至9叶期GUS活性最高;机械损伤和100μmol.L-1茉莉酸甲酯(MeJA)处理可使叶片中GUS活性显著或极显著提高,而干旱、500μmol.L-1水杨酸(SA)和100μmol.L-1脱落酸(ABA)处理则对叶片中GUS活性无明显影响。研究结果表明:外界逆境胁迫对水稻Xa21基因启动子的表达有诱导作用;该启动子的表达受水稻发育阶段的调控并具有一定的器官组织特异性,在根中的表达量最高;其介导的抗病反应依赖于茉莉酸(JA)信号通路。     

番茄Lehsp23.8启动子的热诱导表达调控序列鉴定

番茄线粒体小分子热激蛋白(Lehsp23.8)启动子是典型的热诱导启动子。为了研究热激条件下该启动子的调控序列,本研究将不同长度的Lehsp23.8启动子序列与gus基因融合,构建5′缺失植物表达载体。然后用农杆菌介导法转化烟草,PCR及Southern blotting结果表明融合基因已经整合到烟草基因组中。GUS组织化学染色结果表明:不同长度Lehsp23.8启动子转基因植株热激处理后,在幼苗根、茎、叶以及花和果实中均表现出GUS活性,只是染色强弱有差异。叶片中GUS荧光活性测定结果表明:在热激处理条件下,565bp的Lehsp23.8启动子介导的GUS表达最强;而255bp的Lehsp23.8启动子介导的GUS表达最弱。说明Lehsp23.8启动子中255bp的序列即能满足该启动子的热激表达,-565bp～-255bp之间存在明显的增强子元件,而-871bp～-565bp之间的片段具有一定的抑制作用。     

水稻几丁质酶基因RCH8创伤诱导转录及启动子功能分析

高等植物几丁质酶基因受病害侵染、真菌激发子、乙烯、机械创伤等因素诱导转录。我们已经测定过水稻(Oryza sativa L.cv.IR 36)Ⅰ类几丁质酶基因RCH 8的DNA序列。为了研究水稻中与防卫反应有关的几丁质酶基因启动子的活性、功能和表达调控,我们以RCH 8几丁质酶基因保守的编码区序列为探针,分别在创伤处理2—24h后提取水稻(Oryza sativa L.cv.IR 36)叶片的总RNA作Northern杂交,发现创伤处理6h可以检测到几丁质酶基因的表达,12h表达水平最高。合成了一个与RCH8翻译起始密码附近反义链DNA序列互补的21-mer的寡核苷酸引物(5'-GCTCTCA-TGGTGGCAATGCAA-3')作引物延伸实验,表明RCH8基因的转录受创伤诱导,RCH8转录起始位点位于翻译起始位点上游第42碱基A。在pUC 19载体质粒中构建了一组5'端不同程度缺失的RCH8基因启动子与GUS报告基因翻译融合的重组质粒,用PEG法转入烟草原生质体中,通过测定GUS酶活性发现RCH8启动子-1016-676之间的DNA序列缺失后表达活力显著下降,缺失到-68碱基处的启动子仅有很低的活力。     

杜氏盐藻DCA1启动子内GT重复序列在盐诱导调控中的作用

为了研究杜氏盐藻双拷贝碳酸酐酶（DCA1）启动子中高度重复的GT序列在盐诱导表达时的调控作用,设计不同的引物,通过PCR法获得6条不同长度的DCA1启动子片段,分别与gus报告基因融合后构建6个表达载体;电击法转化杜氏盐藻细胞。组织化学染色和荧光定量法检测GUS在不同盐浓度下的瞬时表达。结果显示,DCA1启动子内高度重复的GT序列无论与其上游、下游或上下游片段同时结合均能驱动gus基因的表达,并且其表达受氯化钠浓度调控,其中和上下游均结合时活性最强;无GT重复序列的融合片段及GT 重复的下游片段也能驱动gus基因的表达,但其表达不受氯化钠浓度调控;而GT重复的上游片段不能驱动gus基因的表达。结果提示:盐藻DCA1启动子中高度重复的GT序列在盐诱导调控中起重要作用,可能为一种新型的盐诱导元件。     

天麻抗真菌蛋白基因的克隆及其启动子活性

通过构建和筛选天麻(Gastrodia elata Bl.)基因组文库,克隆了一个天麻抗真菌蛋白基因组DNA.该基因组DNA含有一个516碱基组成的编码区,没有内含子结构.其启动子区含有保守的TATA盒及CAAT盒.为研究启动子活性,构建了-1 157 bp启动子区与GUS基因的融合表达载体.并将其用农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的遗传转化方法导入烟草(Nicotiana tabacum)中,获得了稳定转化的烟草.利用荧光检测及组织化学染色法对GUS表达进行了分析.结果表明,该启动子能够启动GUS基因在转基因烟草中组织特异性地表达.GUS基因在根中的表达水平最高,茎中次之,叶中只有低水平表达.而且该启动子具有诱导表达活性,可被真菌及水杨酸、茉莉酸强烈诱导表达.     

基于启动子捕获系统的水稻基因的分离

为了分离水稻的基因及其启动子,该实验室构建了T-DNA(GUS)结构的水稻启动子捕获系统,对其中编号为113#、T-DNA单拷贝插入、GUS报告基因为组成型表达的阳性捕获系进行了进一步分析。潮霉素筛选结合GUS组织化学染色获得了T-DNA插入的纯合株(113#-22和113#-26);Inverse法分离得到T-DNA插入位点水稻基因组DNA旁邻序列,测序和BLAST结果表明,T-DNA反方向插在水稻基因组4号染色体预测基因的内含子中;扩增T-DNA插入位点上游2kb左右DNA片段,构建启动子分析质粒转化水稻‘中花11’胚性愈伤组织,获得转基因植株,GUS组织化学染色模式与113#阳性株系一致。结果表明,该预测基因及其启动子是利用启动子捕获系统所捕获到的候选基因。     

獐茅HAK基因表达调控区的分离及其在水稻中的功能分析

獐茅高亲和性K+转运蛋白基因(AlHAK1)是从单子叶禾本科盐生植物獐茅(Aeluropus littoralis(Gouan)Parl)中克隆,对于细胞营养和离子渗透调节起关键作用。为了进一步了解AlHAK1基因的表达调控机制,文章采用基因组步移法分离了AlHAK1基因转录起始位点上游长度约1.3 kb的启动子区域。启动子顺式元件分析显示该序列具有典型的TATA和CAAT盒,以及一些与植物生长发育和环境响应相关的顺式元件。为了明确AlHAK1启动子的功能,将其与GUS基因融合构建到植物表达载体pCAMBIA1301上,通过农杆菌介导转化法导入水稻中。对转基因植株进行GUS组织化学染色,结果显示在转化AlHAK1启动子水稻的根、茎、叶、花药和内外稃部位均检测到GUS活性。GUS荧光定量分析显示AlHAK1启动子调节GUS表达活性低于组成型启动子CaMV35S和Ubiquitin,但其根部和茎部的GUS活性相对较高。对转化植株进行不同胁迫处理后检测GUS活性,结果表明受到ABA、干旱、高温的诱导后其茎部和根部GUS活性有所提高,推测位于该启动子-682 bp的HSE元件和-1 268 bp的MybBS元件可能在高温、ABA和干旱诱导的表达调控中起作用。     

利用水稻启动子捕获系筛选水稻胚发育相关基因的初步研究

通过对2227个启动子捕获系中报道基因β-葡萄糖苷酸酶(β-glucuronidase,gus)表达活性检测,筛选到7个水稻胚中表达GUS活性的启动子捕获系,对其中编号为W9154的捕获系作了进一步分析。Southern杂交分析表明W9154是一个单拷贝T-DNA插入系,其T-DNA插入在水稻基因组第3号染色体上一个未知蛋白基因的第2个内含子中。对该未知蛋白基因上游调控序列生物信息学分析显示,其调控序列除含有TATA-box和CAAT-box等常见启动子元件外,还含有RY基序、E盒、G盒及AACA等种子特异性启动子的特征性元件。表达特征分析发现,编码上述未知蛋白的基因在野生型水稻的胚和茎中表达,这与捕获系W9154中GUS表达活性完全一致。这些表明启动子捕获系w9154捕获的候选基因可能是一个水稻胚发育相关基因。     

拟南芥γ-生育酚甲基转移酶(γ-TMT)启动子的分离及表达特性分析

维生素E是一类人体所必需的脂溶性的维生素,具有重要的生理功能。γ-生育酚甲基转移酶(γ-TMT)是维生素E生物合成途径中的关键酶之一,催化γ、δ-生育酚甲基化,生成α、β-生育酚。从拟南芥中分离了γ-生育酚甲基转移酶基因1552bp的启动子序列,构建了含有该启动子和GUS报告基因的植物表达载体,通过农杆菌介导转化拟南芥,获得了转基因植株。GUS组织化学染色结果表明,在γ-TMT启动子的驱动下,报告基因GUS在拟南芥的叶、茎以及花均有表达,且在茎尖、雄蕊和幼叶中表达最强,而在根、种子和种荚中则没有检测到GUS基因的表达,表明γ-TMT基因可能仅在拟南芥某些组织中特异性高表达。     

水杨酸诱导山葡萄Class Ⅲ几丁质酶基因VCH3启动子在转基因烟草维管组织中的表达(英文)

从山葡萄(Vitis amurensis Rubr.)叶片中分离到长度为1216 bp的山葡萄Class Ⅲ几丁质酶基因VCH3的5’端非编码区(GenBank number AF441123),并发现有两个反向水杨酸(SA)顺式作用元件(TGACG)分别位于转录起始位点上游-1 181 bp和-293 bp处。为了鉴定VCH3启动子的功能,我们将该启动子的4个缺失片段(-1187 bp～ 7bp,-892 bp～ 7 bp,-589 bp～ 7 bp及-276 bp～ 7 bp)分别连接到β-葡糖苷酸酶基因(GUS)编码区的上游,构建成4个融合基因,并利用农杆菌介导叶盘转化法将这4个融合基因转入烟草(Nicotiana tobacum L.)栽培品种NC89中。SA处理的转基因烟草根系GUS酶活性的荧光检测结果表明:只含有TATA盒和CAAT盒而缺失了所有SA顺式作用元件的VCH3(-276)GUS表达盒对SA处理表现出较低程度的诱导性;只包含一个SA顺式作用元件的VCH3(-589)GUS或VCH3(-892)GUS表达盒表现出相似的较高水平的GUS酶活性;而包含两个SA顺式作用元件的全长启动子片段(-1187bp～ 7bp)驱动了最强的GUS酶活性,这说明VCH3启动子诱导的GUS酶活性的最大量表达需要两个SA顺式作用元件的协同作用。GUS酶的组织化学分析结果表明,在SA处理的转基因烟草根横切面中,VCH3启动子4个缺失片段驱动的GUS酶活性在维管组织中的表达活性均强于在外皮层和内皮层的表达     

杜氏盐藻硝酸盐还原酶基因5′上游序列的克隆与功能分析

目的:克隆杜氏盐藻硝酸盐还原酶(NR)基因5′上游序列,并对其功能进行分析。方法:利用BamHI、EcoRI、HindIII、PstI、SalI、Xbal6种限制性内切酶分别酶切盐藻基因组DNA,并与接头连接,构建成盐藻基因组步行文库。采用LA-PCR方法,从上述盐藻步行基因组文库中扩增NR基因5′上游序列,测序并进行分析。为检测其表达特性,构建了该片段与GUS嵌合基因的表达载体pNR-GUS,通过电击法将所构建的重组表达载体转化盐藻,组织化学染色法观察GUS的表达。结果:从盐藻基因组步行文库中扩增出约1200bp特异片段,序列分析表明5′上游序列含有启动子的特征性序列。GUS瞬时表达染色结果显示,该DNA片段具有硝酸盐诱导和铵抑制的启动子活性。结论:所克隆的盐藻的5′上游序列可能是一种具有“开关”活性的可控性启动子。