大肠杆菌中从头合成白藜芦醇途径的设计及优化

白藜芦醇是一种极具药用价值的植物源芪类化合物。为了在E.coli实现白藜芦醇的从头合成,构建了由酪氨酸解氨酶(TAL),香豆酸-CoA合成酶(4CL)和白藜芦醇合成酶(STS)组成的非天然合成途径。经3天发酵后,白藜芦醇产量仅为2.67 mg/L,而其中间体香豆酸的积累达到了95.64 mg/L。为了进一步改善异源途径的效率,对4CL和STS模块采取融合表达、高拷贝表达及启动子工程改造的策略,最终使白藜芦醇产量提高到了9.6倍,达到了25.76 mg/L,同时香豆酸的积累减少到了20.38 mg/L。这些研究结果为更高效白藜芦醇从头合成工程菌的构建及最终实现白藜芦醇的微生物大规模生产奠定了基础。     

大肠杆菌His6融合表达载体及其表达产物的一步变化

构建了Ｔ７启动子控制下的融合表达载体,使外源蛋白以Ｎ端与６个连续的组氨酸残基融合的形式表达。这些载体含有强Ｔ７启动子,终止子,翻译起始区,多克隆位点以及噬菌体ｆ１复制起始区,使外源基因不仅可以得到高效表达而且可以利用ｈｅｌｐｅｒ ｐｈａｇｅ包装单链ＤＮＡ,从而不需亚克隆玉可以直接进行测序及点突变。     

T7启动子控制下的多功能大肠杆菌表达系统

构建了Ｔ７启动子控制下的多功能大肠杆菌表达载体系统,这些表达载含有强的Ｔ７启动子,翻译起始及终止元件,多克隆位点,线状噬菌体复制起始区等元件,使得该载体就仅可以有效地表达外源基因、还可能利用ｈｅｌｐｅｒ ｐｈａｇｅ诱导包装单链噬菌体,从而不需亚克隆就可以进行突变及ＤＮＡ序列测定。     

以4-香豆酸为底物转化白藜芦醇大肠杆菌工程菌的构建

白藜芦醇具有多种生物活性,在食品、化妆品及生物制药中具有广阔的应用前景。利用合成生物学生产白藜芦醇是未来的发展趋势。将白藜芦醇合酶(resveratrol synthase,RS)和4-香豆酰-CoA连接酶(4-coumaric acid-CoA ligase,4CL)的编码基因整合到共表达载体pETDuet-1上成功构建了重组质粒pETDuet-rs-4cl,转化大肠杆菌BL21(DE3),在M9培养基中添加4-香豆酸,在诱导条件下培养,发酵液中白藜芦醇含量为8.6 mg/L。本研究在大肠杆菌中实现了白藜芦醇的转化,为微生物法生产白藜芦醇奠定了基础。     

死亡肽基因的合成及在大肠杆菌中的表达

将人工合成的寡核苷酸片段,通过PCR扩增得到死亡肽（thanatin）基因,并将其克隆到表达载体pGEX-3X中,序列分析结果正确。经IPTG诱导,在大肠杆菌BL21中进行高效可溶性表达,表达量可达20%以上。融合蛋白通过GST亲和层析纯化,用肠激酶酶解表达产物,用Sephadex G-25初步纯化得到具有抗菌活性的死亡肽。     

大肠杆菌精氨酰—tRNA合成酶高表达条件的优化及酶…

控制培养基中氨苄青霉素的用量、ＰＨ和培养时间,从含Ｅ．ｃｏｌｉ ａｒｇｓ变种ＡＲＧＳ３８１ＫＡ的Ｅ．ｃｏｌｉ ＴＧ１转化子中,得到了Ｅ．ｃｏｌｉ ＡｒｇＲＳ变种ＡｒｇＲＳ３８１ＫＡ的高表达。从２升培养液中得到１５克湿菌体,粗抽液中ＡｒｇＲＳ３８１ＫＡ的比活为５０３单位／毫克。经过两次ＤＥＡＥ－Ｓｅｐｈａｃｅｌ柱层析,在４天时间内,可得到７８毫克电泳一条的纯酶,活力回收达８０％。该方法可以作为从含ａ     

启动子优化提高重组大肠杆菌PHA产量

聚羟基脂肪酸酯(PHA)是一类由微生物合成的高分子聚酯的统称,具有生物可降解性、生物可再生性和良好的生物相容性,应用前景广阔。PHA具有类似塑料的材料学性能,倍受到科学界和工业界的关注,但是生产成本较高等原因极大地限制了其大规模应用。本研究通过筛选优化在微氧条件下能够高效调控基因表达的启动子,能有效提高生产菌株在微氧条件下积累PHA的能力,减少生产能耗,降低成本。首先,在大肠杆菌基因表达库中筛选出5个在微氧条件下高效调控基因表达的启动子,与编码红色荧光蛋白的RFP报告基因相连,通过酶标仪检测RFP的荧光信号值,对5个不同的微氧启动子的表达强度进行评估,比较得到其中最高效的启动子Pslp。为进一步提高生产PHA的效率,将2个Pslp序列采用串联的方式构建得到一个新启动子P2slp,利用其调控PHA代谢合成途径中3个关键基因phbC、phbA和phbB的表达。通过发酵扩大生产,在启动子P2slp的调控下,重组大肠杆菌的细胞干重由22 g/L提高至29 g/L,PHA的产量由49.1%提高至81.3%。本研究通过筛选优化启动子提高了重组大肠杆菌生产PHA的产量,为PHA的产业化应用提供了一种有效的提高PHA产量的方法,具有实际价值。     

大肠杆菌精氨酰－tRNA合成酶高表达条件的优化及酶的纯化

控制培养基中氨苄青霉素的用量、ｐＨ和培养时间,从含Ｅ．ｃｏｌｉａｒｇｙ变种ａｒｇｒ３８１ＫＡ的Ｅ．ｃｏｌｉＴＧ１转化子中,得到了Ｅ．ｃｏｌｉＡｒｇＲＳ变种ＡｒｇＲＳ３８１ＫＡ的高表达。从２升培养液中得到１５克湿菌体,粗抽液中ＡｒｇＲＳ３８１ＫＡ的比活为５０３单位／毫克。经过两次ＤＥＡＥＳｅｐｈａｃｅｌ层析,在４天时间内,可得到７８毫克电泳一条带的纯酶活力回收达８０％。该方法可以作为从含ａｒｇｓ的Ｅ．ｃｏｌｉＴＧ１转化子中提纯Ｅ．ｃｏｌｉＡｒｓＲＳ的通用方法。     

大肠杆菌异源生产丁醇途径组装及启动子优化

启动子优化是合成生物学研究的重要工具,可以通过不同强度的启动子调控基因转录水平以优化生物途径。丁醇是一种多用途的基础化工原料,目前有很多代谢工程手段应用在大肠杆菌的丁醇异源表达中,但是并没有进行启动子的精细调控。文中以大肠杆菌为宿主构建异源丁醇合成途径,通过DNA assembler的方法一步组装不同强度启动子组合的丁醇合成途径以优化丁醇合成。以强启动子Alper PLTetO1或弱启动子Alper BB转录硫解酶,以强启动子Braatsch 20或弱启动子Braatsch 10转录丁醇合成操纵子,共构建成4种不同质粒。结果表明以AlperPLTetO1转录硫解酶,Braatsch 10转录丁醇合成操纵子的组合获得最高的丁醇产量28 mg/L,与其他组合相比丁醇产量提高了3~5倍。     

人Hepcidin融合表达载体的构建及在大肠杆菌中的表达

为了在大肠杆菌中表达生产hepcidin,根据大肠杆菌密码子偏好性,化学合成了人hepcidin的基因序列,并构建了hepcidin的融合表达载体pET -hpc。pET- hpc在大肠杆菌BL2 1 (DE3)中表达的hepcidin融合蛋白以包涵体形式存在,其N端带有 6个组氨酸。通过优化诱导表达条件,该融合蛋白表达水平显著提高,占总蛋白的 2 5 . 2 %。表达的包涵体经 1 %TritonX 1 0 0洗涤后溶于8mol L尿素,在变性条件下采用金属螯合层析进行纯化,所得融合蛋白纯度大于 95 %。     

Constructing E. coli Co‐Cultures for De Novo Biosynthesis of Natural Product Acacetin

Modular co‐culture engineering is an emerging approach for biosynthesis of complex natural products. In this study, microbial co‐cultures composed of two and three Escherichia coli strains, respectively, are constructed for de novo biosynthesis of flavonoid acacetin, a value‐added natural compound possessing numerous demonstrated biological activities, from simple carbon substrate glucose. To this end, the heterologous biosynthetic pathway is divided into different modules, each of which is accommodated in a dedicated E. coli strain for functional expression. After the optimization of the inoculation ratio between the constituent strains, the engineered co‐cultures show a 4.83‐fold improvement in production comparing to the mono‐culture controls. Importantly, cultivation of the three‐strain co‐culture in shake flasks result in the production of 20.3 mg L^?1 acacetin after 48 h. To the authors' knowledge, this is the first report on acacetin de novo biosynthesis in a heterologous microbial host. The results of this work confirm the effectiveness of modular co‐culture engineering for complex flavonoid biosynthesis.     

基因工程半成品中大肠杆菌蛋白残余量测定方法研究—双抗体夹心ELISA法

用大肠杆菌ＤＨ５α菌体蛋白免疫家兔制备抗血清,建立了双抗体夹心ＥＬＩＳＡ方法。经初步测定,该方法的灵敏度为１．５ｎｇ／ｍｌ,与间接ＥＬＩＳＡ法的灵敏度相似,比聚丙烯酰胺凝胶电泳的考马斯亮兰染色方法的灵敏度高将近７００倍,比银染色方法的灵敏度高将近３０倍。在２０～１００００ｎｇ／ｍｌ范围内呈直线关系,直线相关系数为０．９９６。经八次重复测定,显示很好的重复性。该方法可用于测定基因工程产品中ＤＨ５α菌体蛋白的残余量。     

重组人甲状旁腺激素肽（1-34）在大肠杆菌中的高效融合表达及纯化

人工合成人甲状旁腺激素1-34肽段 (PTH1-34)的cDNA序列,克隆到大肠杆菌蛋白表达载体pThioHis中,获得了高表达菌株。经发酵、破菌、金属鳌合层析、反相层析和凝胶层析后获得了纯度大于95%的hPTH1-34。hPTH1-34肽N端测序和质谱分子量测定结果与天然PTH1-34一致。生物学活性研究表明,hPTH1-34在体外具有刺激腺苷酸环化酶的作用。     

大肠杆菌腺苷脱氨酶基因的克隆表达

将大肠杆菌K12菌株来源的腺苷脱氨酶基因(add)克隆到载体pET-28a中,并转化至大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达。通过IPTG诱导,SDS-PAGE检测和酶活性的测定发现,重组菌表达产生大量腺苷脱氨酶,活性达到51.07U/mg蛋白。通过酶性质的研究,腺苷脱氨酶对腺苷最适pH和温度分别为7.5和40℃,且在40℃下维持稳定。     

多表位恶性疟疾疫苗M.RCAg-1在大肠杆菌表达的条件优化和大规模培养

通过以培养基配方、IPTG浓度、金属离子复合液浓度、镁离子浓度、表达时间、接种量、诱导时间点等发酵的重要条件对重组蛋白表达量影响的研究,确定多表位恶性疟疾疫苗M.RCAg-1蛋白最佳表达条件为以改良TB培养基培养、最优Mg2+,诱导剂IPTG和金属离子复合液浓度分别为10mmol/L,0.5mmol/L,6μl/ml,接种量为10%,表达时间为4.5h,将优化后的参数用于50L发酵罐进行连续3批中试规模的发酵,最终收获菌体湿重平均为31.8±1.78g/L,目的蛋白表达量可占菌体总蛋白的50%左右,试验确定了恶性疟疾多表位随机组合蛋白M.RCAg-1在大肠杆菌中的最优表达条件,该条件能够适合大规模培养需要。     

Biosynthesis of paromamine derivatives in engineered Escherichia coli by heterologous expression

Aims: Paromamine is a vital and common intermediate in the biosynthesis of 4,5 and 4,6‐disubstituted 2‐deoxystreptamine (DOS)‐containing aminoglycosides. Our aim is to develop an engineered Escherichia coli system for heterologous production of paromamine. Methods and Results: We have constructed a mutant of E. coli BL21 (DE3) by disrupting glucose‐6‐phosphate isomerase (pgi) of primary metabolic pathway to increase glucose‐6‐phosphate pool inside the host. Disruption was carried out by λ Red/ET recombination following the protocol mentioned in the kit. Recombinants bearing 2‐deoxy‐scyllo‐inosose (DOI), DOS and paromamine producing genes were constructed from butirosin gene cluster and heterologously expressed in engineered host designed as E. coli BL21 (DE3) Δpgi. Secondary metabolites produced by the recombinants fermentated in 2YTG medium were extracted, and analysis of the extracts showed there is formation of DOI, DOS and paromamine. Conclusions: Escherichia coli system is engineered for heterologous expression of paromamine derivatives of aminoglycoside biosynthesis. Significance and Impact of the Study: This is the first report of heterologous expression of paromamine gene set in E. coli. Hence a new platform is established in E. coli system for the production of paromamine which is useful for the exploration of novel aminoglycosides by combinatorial biosynthesis of 4,5‐ and 4,6‐disubtituted route of DOS‐containing aminoglycosides.