TCRBV12—3重组载体构建及其抗肿瘤作用的初步研究

目的：构建pEGFP．C3-TCRBVl2—3表达载体并初步研究其抗肿瘤作用。方法：TCRBVl2—3基因片段从pGEM-T—TCRBVl2-3载体上酶切并克隆至pEGFP—C3载体中,通过脂质体将pEGFP—C3．TCRBVl2-3表达载体转染外周血单个核细胞（PBMCs）,48小时后荧光显微镜观察转染效率。PBMCs细胞、pEGFP-C3载体转染的PBMCs细胞、pEGFP—C3-TCRBVl2-3表达载体转染的PBMCs细胞分别与肝癌细胞BEL-7402和宫颈癌细胞HeLa共培养24h,显微镜观察肿瘤细胞的生长情况。结果：测序证实TCRBVl2-3基因片段成功亚克隆至pEGFP—C3载体中,荧光显微镜证实重组体转染PBMCs细胞48h后可有效表达绿色荧光。显微镜观察发现pEGFP—C3-TCRBVl2-3载体转染的PBMCs对肝癌细胞有杀伤作用．但对宫颈癌杀伤作用不明显。结论：成功构建pEGFP—C3一TCRBVl2—3表达载体,初步证实TCRBVl2．3对肝癌细胞有杀伤作用。     

融合蛋白TCRαζβζ中CD3ζ分子与T细胞膜的共定位分析

[目的]构建融合CD3ζ的TCRαζβζ分子的双表达载体,并观察TCRαζβζ分子中的CD3ζ与细胞膜的共定位情况。[方法]设计重叠PCR引物,利用重叠PCR扩增携带荧光蛋白的融合基因TCRβζ-EYFP和TCRαζ,将其克隆到p IRES2-EGFP载体,构建双表达载体p IRES2-TCRβζ-EYFP/TCRαζ,将重组载体分别转染BEL-7402细胞和Jurkat T细胞,转染48 h后,细胞膜经Di D染料染色,共聚焦显微镜扫描并分析该TCRαζβζ分子的表达以及与细胞膜的共定位情况。[结果]重组双表达载体p IRES-TCRβζ-EYFP/TCRαζ经菌落PCR、酶切鉴定及测序分析证明载体构建成功;共聚焦显微镜扫描结果显示重组载体表达了融合蛋白TCRαζβζ分子;共定位程序分析显示TCRαζβζ分子中的CD3ζ与细胞膜存在共定位关系。[结论]成功构建了融合蛋白TCRαζβζ分子的双表达载体,TCRαζβζ分子中的CD3ζ与细胞膜存在共定位。     

共表达TCRα 12-2和TCRVβ 7.1重组腺病毒载体的构建及其杀伤肝癌细胞作用的研究

目的:构建共表达TCRα12-2和TCRVβ7.1重组腺病毒载体Ad.TCRα12.2-IRES-Vβ7.1,并研究其杀伤肝癌细胞的作用。方法:提取外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)总RNA,用RT-PCR的方法得到TCRα12-2基因。TCRVβ7.1基因由pCDN3.1-Vβ7.1扩增获得,将这两个基因以IRES相连克隆入腺病毒穿梭质粒pDC315中。穿梭质粒和腺病毒骨架质粒共转染HEK293细胞,包装出可同时表达TCRα12-2和TCRVβ7.1的重组腺病毒。然后提取病毒基因组DNA,对外源目的基因进行PCR鉴定;病毒感染宫颈癌细胞(HELA),48小时后提取细胞总RNA,通过RT-PCR鉴定目的基因表达;最后病毒感染PBMC,用流式细胞仪检测目的蛋白的表达。对鉴定正确的病毒进行大量扩增并测定滴度。用MTT比色法检测Ad.TCRα12-2-IRES-Vβ7.1感染的PBMC对肝癌细胞HEPG2和BEL-7402的杀伤作用。结果:从重组病毒基因组中扩增出目的基因TCRα12-2和TCRVβ7.1,RT-PCR和流式细胞仪检测表明目的基因可以有效的表达。Ad.TCRα12-2-IRES-Vβ7.1感染PBMC组对肿瘤细胞的杀伤率明显高于PBMC组和Ad-GFP感染组。结论:成功构建了双表达TCRα12-2和TCRVβ7.1基因的重组腺病毒载体Ad.TCRα12-2-IRES-Vβ7.1,且其感染后的PBMC可有效的杀伤肝癌细胞。     

一种原位示踪外源目的基因表达载体的构建

应用分子克隆技术 ,分别将增强型绿色荧光蛋白 (enhancedgreenfluorescentprotein ,EGFP)、内部核糖体进入位点 (internalribosomeentrysite,IRES)和编码H-ras基因C端 2 0个氨基酸的DNA(rasc2 0 )片段插入真核表达载体pcDNA3,构建真核重组表达载体并将其命名为pZX。通过脂质体介导将该载体转染人宫颈癌细胞系HeLa ,培养过夜后在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白在细胞内的分布 ,并与pEGFP-C3质粒DNA转染该细胞系进行比较。结果表明 ,转染pZX载体的实验组细胞膜发出绿色荧光 ,而对照组绿色荧光则均匀弥散于整个细胞中 ,工具性载体pZX已构建成功     

重组逆转录病毒载体pLXPXSN-TCRα12-2-IRES-Vβ7.1的构建及其杀伤肝癌细胞作用的研究

目的:构建双表达逆转录病毒载体pLXPXSN-TCRα12-2-IRES-Vβ7.1,包装成病毒颗粒后有效地感染PBMC.方法:以实验室保存含TCRVB7.1基因和TCRα12-2基因的质粒为模板,分别扩增得到两个基因,亚克隆入栽体pLXPXSN,得到重组质粒pLXPXSN-TCRα12-2-IRES-Vβ7.1.重组体质粒经酶切鉴定后,将鉴定好的阳性重组质粒用脂质体介导转染PA317细胞,包装成完整的病毒后测定滴度,感染PBMC,用流式细胞仪和提取基因组DNA检测目的蛋白的表达.最后病毒感染PBMC,用流式细胞仪检测目的蛋白的表达.然后用流式细胞术细胞凋亡率,MTT比色法检测pLXPXSN-TCRα12-2-IRES-Vβ7.1感染的PBMC对肝癌细胞BEL-7402和HEPG2的杀伤作用.结果:从重组病毒基因组中扩增出目的基因TCRα12-2和TCRVβ7.1,流式细胞仪检测表明目的基因可以在PBMC中有效的表达.pLXPXSN-TCRα12-2-IRES-V137.1感染PBMC组对肿瘤细胞的杀伤率明显高于PBMC组和空载体感染组.结论:TCRα12-2和TCRVB7.1能够整合进宿主PBMC的基因组中,并能得到有效地表达.pLXPXSN-TCRα12-2-IRES-Vβ7.1感染PBMC后可提高其对肝癌细胞的杀伤活性.     

小鼠紧密连接蛋白ZO-2 真核表达载体的构建和表达

目的:克隆小鼠紧密连接蛋白ZO-2(zonula occludens protein2)基因构建其真核表达载体,并验证其在293T细胞系中的表达,为进一步研究其功能奠定基础。方法:从小鼠淋巴结来源的cDNA中分三段分别扩增,通过基因克隆方法获得紧密连接蛋白ZO-2基因全长,连接至pMD-18T载体中,酶切测序正确后,插入pEGFP-C2载体中,构建真核表达载体pEGFP-C2-ZO2。酶切正确后,瞬时转染入293T细胞中,48h后荧光显微镜观察其绿色荧光GFP融合蛋白的表达,并用Western blot检测其在转染细胞中的蛋白水平表达。结果:通过酶切鉴定和测序结果证明成功克隆了ZO-2基因,western blot结果表明成功构建了真核表达载体pEGFP-C2-ZO2。结论:小鼠紧密连接蛋白ZO-2基因的获得和真核表达载体pEGFP-C2-ZO2的成功构建为下一步研究其生物学功能奠定了基础。     

MicroRNA122真核表达载体的构建及在HepG2细胞中的表达与检测

为进一步研究microRNA的功能及作用靶标提供技术平台,构建microRNA真核表达载体。从HepG2215细胞基因组DNA扩增microRNA122前体,克隆到pEGFP-C1的载体上,经测序鉴定后转染至HepG2细胞中,荧光显微镜观察绿色荧光蛋白表达情况并提取基因组总RNA,RT-PCR检测microRNA122表达,TA克隆鉴定。结果表明,成功构建microRNA122真核表达载体,并证实其在真核细胞HepG2中表达。此方法成功构建microRNA表达,并为后续研究提供良好的技术平台。     

SCG10基因重组质粒的构建及蛋白表达和定位

目的构建SCG10真核表达载体并证实融合蛋白在细胞内表达及定位。方法以人胎脑cDNA文库为模板,PCR扩增SCG10全长编码基因,亚克隆至pEGFP-C1表达载体中。将构建的重组质粒测序并转染到人胚肾HEK293中,提取细胞蛋白进行Western blot检测。利用共聚焦激光扫描显微镜观察pEGFP-SCG10在HEK293细胞内定位。结果 SCG10全长基因序列克隆到了真核表达载体pEGFP-C1中,酶切鉴定片段大小540bp。Western blot检测到了融合蛋白表达,分子量约为48kD。pEGFP-SCG10在细胞内定位以细胞浆为主,在细胞核少量表达。结论成功构建了SCG10全长基因真核表达载体,pEGFP-SCG10蛋白主要定位于HEK293细胞浆内。     

MIC3-EGFP融合蛋白真核表达质粒的构建及其在COS-7细胞中的表达

目的:构建以绿色荧光蛋白(greenfluoreseeneeprotein,GFP)为报告基因的重组表达质粒pEGFP-C2-MIC3并检测MIC3-EGFP融合蛋白其在COS-7细胞中的表达及定位.方法:通过基因重组的方法构建pEGFP-C2-MIC3重组真核表达质粒,并通过酶切和基因测序鉴定.脂质体法转染体外培养的COS-7细胞,转染后24h在活细胞状态下用倒置荧光显微镜直接观察MIC3-EGFP融合蛋白在COS-7细胞中的分布.结果:PCR检测,酶切鉴定及测序证实目的基因MIC3正确连接到pEGFP-C2的多克隆位点.pEGFP-C2-MIC3重组体转染COS-7后,在细胞质表达.结论:成功地构建了pEGFP-C2-MIC3融合蛋白真核表达质粒,在COS-7细胞中获得表达.     

Selection with two alleles and complete dominance

For a plant selection model with frequency-independent viabilities, fertilities and selfing rates, it is shown that apart from global fixation, for certain parameter combinations a protected polymorphism and facultative fixation (either allele may become fixed according to initial frequencies) may both occur. Facultative fixation requires different selling rates for the dominant and recessive type. Protection of the polymorphism requires resource allocation for male and female function. In this connection the problem of purely genetically caused population extinction is discussed.
For general frequency dependence and regular segregation, the chances for establishment of a completely recessive gene are compared to those of a completely dominant gene. It is proven that the process of establishment of the recessive gene, despite a fitness advantage, may be considerably endangered by drift effects if random mating prevails. The recessive gene may reach the same effectivity in establishment as a dominant gene, only if the recessive homozygote mates exclusively with its own type during the period of establishment.     

杆状病毒出芽病毒粒子膜融合蛋白的研究进展

杆状病毒是一类感染节肢动物的病原微生物,其基因组为双链环状DNA,大小为80～180kb.     

Inception of the Modern Public Health System in China and Perspectives for Effective Control of Emerging Infectious Diseases: In Commemoration of the 140th Anniversary of the Birth of the Plague Fighter Dr. Wu Lien-Teh

In this article, we systematically review Dr. Wu Lien-Teh's academic achievements and outstanding contributions in the prevention and control of the plague epidemic in northeast China and introduce the development of the earliest public health epidemic prevention system in China in order to commemorate the 140th anniversary of Dr. Wu Lien-Teh's birth. We hope that this article will provide insights into the effective prevention and control of emerging infectious diseases as well as the current worldwide pandemic of COVID-19, facilitating the improvement and development of public health systems in China and around the globe.