大鼠卵巢促黄体激素受体膜外微区（1—341）在昆虫细胞中的表达…

促黄体激素／人绒毛膜促性腺激素受体（ＬＨ／ｈＣＧ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）Ｎ端膜外微区３４１个氨基酸残基（简称Ｒ３４１）与激素有很高的亲和力。本文报道编码Ｒ３４１的ｃＤＮＡ在昆虫细胞中的表达及其产物性质的初步研究。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ银染及其产物性质的初步研究。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ银染和免疫印迹结果显示,表达产物呈两条带：分子量为３８．５Ｋｄ的主带和分子量为４０．０Ｋｄ的次带。配基结合免疫印迹和１２５Ｉ－ｈＣＧ     

大鼠卵巢绒毛膜促性腺激素受体在CHO中的表达和扩增

本文报道了利用二氢叶酸还原酶放大系统将大鼠ＬＨ／ｈＣＧ受体（记为Ｆ－ｈＣＧＲ）及其胞外肽段（记为Ｔ－ｈＣＧＲ）在中国苍鼠卵巢细胞（ＣＨＯ）中的表达。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析表明,Ｆ－ｈＣＧＲ为一条蛋白质带,其表观分子量为９２ｋｄ,而Ｔ－ｈＣＧＲ为３５ｋｄ和３７ｋｄ两条带。表达受体对其配基ｈＣＧ表现出高的亲合力,Ｆ－ｈＣＧＲ的解离常数为７×１０－９ｍｏｌ／Ｌ,Ｔ－ｈＣＧＲ为６．４×１０－９ｍｏｌ／Ｌ。表达Ｆ－ｈＣＧＲ的转染ＣＨＯ细胞可结合１２５Ｉ－ｈＣＧ,而表达Ｔ－ｈＣＧＢ者不结合１２５Ｉ－ｈＣＧ。这提示Ｆ－ｈＣＧＲ主要存在于细胞质膜表面上。表达Ｆ－ｈＣＧＲ的转染ＣＨＯ细胞能刺激。ｃＡＭＰ的形成,而表达Ｔ－ｈＣＧＲ者不能刺激ｃＡＭＰ形成。免疫荧光定位结果表明,Ｔ－ｈＣＧＲ主要分布于质膜的细胞质侧以及胞内其他一些细胞器膜上。用免疫亲和层析可以得到纯化的Ｔ－ｈＣＧＲ。     

大鼠睾丸黄体生成素受体剪切变异体cDNA在昆虫细胞中的高效表达

研究了大鼠睾丸黄体生成素受体剪切变异体ｃＤＮＡ在昆虫细胞中的表达,并对其产物性质作了初步鉴定。ＳＤＳＰＡＧＥ银染和免疫印迹结果显示,表达产物呈两条带,分子量为３８.５ｋＤａ的主带和分子量为４０ｋＤａ的次带。^１２５Ｉ.ｈＣＧ结合印迹分析表明,表达产物Ｒ３１６具有与配基专一性结合的生物活力。竞争性配基结合曲线和Ｓｃａｔｃｈａｒｄ分析结果显示,重组受体Ｒ３１６和配基ｈＣＧ有较高的亲和力,平衡解离常数Ｋｄ为８.１５×１０^－１０ｍｏｌ／Ｌ。表达产物为与膜结合的蛋白,在条件培养基中未检测到它的存在     

人粒细胞集落刺激因子（hG—CSF）cDNA3‘—UTR对其表达的影响

利用人粒细胞集落刺激因子（ｈＧ－ＣＳＦ（）ｃＤＮＡ３＇端非翻译区（３＇ＵＴＲ）中存在的ＤｒａＩ酶切位点,通过部分酶切与完全酶切,删除３＇－ＵＴＲ不同长度构建了四种ｈＧ－ＣＳＦ ｃＤＮＡ瞬时重组表达质粒,转染ＣＯＳ－７细胞手,生物活性测定结果提示,ｈＧ－ＣＳＦｃＤＮＡ３＇－ＵＴＲ对其表达起负调控作用,其关键性序列位于紧接终止密码子ＴＧＡ下游的６５ｂｐ范围内,３＇－ＵＴＲ对ｈＧ－ＣＳＦ ｃＤＮＡ表达的     

人粒细胞集落刺激因子（hG－CSF）cDNA3′－UTR对其表达的影响

利用人粒细胞集落刺激因子（ｈＧ－ＣＳＦ）ｃＤＮＡ３′端非翻译区（３′－ＵＴＲ）中存在的ＤｒａⅠ酶切位点,通过部分酶切与完全酶切,删除３′－ＵＴＲ不同长度,构建了四种ｈＧ－ＣＳＦｃＤＮＡ瞬时重组表达质粒。转染ＣＯＳ－７细胞后,生物活性测定结果提示,ｈＧ－ＣＳＦｃＤＮＡ３′－ＵＴＲ对其表达起负调控作用,其关键性序列位于紧接终止密码子ＴＧＡ下游的６５ｂｐ范围内,３′－ＵＴＲ对ｈＧ－ＣＳＦｃＤＮＡ表达的影响与转录水平的差别有一定关系。     

人粒细胞集落刺激因子hG—CSF cDNA在大肠杆菌中表…

在不改变编码蛋白质氨基酸序列的前提下,利用合成ＤＮＡ接头的方法,在原始ｃＤＮＡ克隆基础上,构建了５＇端密码子富含ＡＴ的ｈＧ－ＣＳＦ ｃＤＮＡ突变体,使ｈＧ－ＣＳＦ ｃＤＮＡ得以在大肠杆菌中表达,但表达水平很低,借助相同的手段,在ｈＧ－ＣＳＦ ｃＤＮＡ ５＇端增加２４核苷酸对的ＦＬＡＧ肽编码序列,构建了ｈＧ－ＣＳＦ杂合蛋白（在ｈＧ－ＣＳＦ成熟蛋白Ｎ末端增加８氨基酸残基ＦＬＡＧ肽,二者结合点为肠激肽酶     

大鼠酰胺化酶的信号肽引导的昆虫细胞表达外泌系统

将大鼠酰胺化酶的信号肽及前导肽编码序列引入昆虫核多角体病毒转移表达载体,构建ＰＡＢＣｈＧＲＦ（Ｇｌｙ）、ＰＡＢＣＩＧＦＩ融合基因的昆虫细胞分泌表达质粒ｐＢａｃＰＡＧ２、ｐＢａｃＰＡＩ,并与经修饰的银纹夜蛾核多角体病毒ＢａｃＰＡＫ６线性化ＤＮＡ共转染秋粘虫细胞Ｓｆ２１,通过同源重组、筛选和鉴定,得到它们的重组病毒ＢａｃＰＡＧ、ＢａｃＰＡＩ。将重组病毒感染Ｓｆ２１细胞,ＰＡＢＣｈＧＲＦ（Ｇｌｙ）和ＰＡＢＣＩＧＦＩ均得到有效外泌表达,表达产物通过ＩｇＧＳｅｐｈａｒｏｓｅ柱可获得快速纯化。     

用重组痘苗病毒表达pGHcDNA的研究

构建了含有ｐＧＨｃＤＮＡ的重组痘苗病毒,用ＥＬＩＳＡ证明该重组病毒在被感染的ｈ１４３细胞中,可表达出猪生长激素并将之分泌到培养基中,表达量约为１．０５μｇ／１０＾６细胞（２４ｈ）,用定位免疫化学法进一步证明该病毒可感染小鼠并在小鼠体内表达ｐＧＨｃＤＮＡ,同时还构建了含双拷贝ｐＧＨｃＤＮＡ的重组痘苗病毒,并证明其ｐＧＨ表达量比单拷贝重组病毒有明显提高,约为１．５０μｇ／１０＾６细胞（２４ｈ）     

用重组痘苗病毒表达pGHcDNA的研究

构建了含有ｐＧＨｃＤＮＡ的重组痘苗病毒,用ＥＬＩＳＡ证明该重组病毒在被感染的ｈ１４３细胞中,可表达出猪生长激素并将之分泌到培养基中,表达量约为１．０５μｇ／１０￣６细胞（２４ｈ）。用定位免疫化学法进一步证明该病毒可感染小鼠并在小鼠体内表达ｐＧＨｃＤＮＡ。同时还构建了含双拷贝ｐＧＨｃＤＮＡ的重组痘苗病毒,并证明其ｐＧＨ表达量比单拷贝重组病毒有明显提高,约为１．５０μｇ／１０￣６细胞（２４ｈ）。     

人生长激素基因逆转录病毒载体的构建及其对3T3和ES细胞的转化与表达

为了研究生长激素基因在异源细胞中的表达,构建了携带人生长激素基因（ｈＧＨ）的逆转录病毒载体ｐＩＮＳ－ＧＨ,并将其导入小鼠成纤维细胞３Ｔ３和小鼠胚胎干细胞（ＥＳ细胞）ＣＣＥ中。ｐＩＮＳ－ＧＨ转化３Ｔ３细胞,获得了高效表达的克隆,即用放射免疫法检测到克隆培养基中有大量的人生长激素蛋白富积,如ＧＨＳＮＣ２０,富积率高达３７８４ｎｇ／ｍｌ,而且外源基因的整合很稳定。不同的３Ｔ３转化克隆的表达率有显著的差异,Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交的结果表明,这种差异与外源基因整合的拷贝数无关。ｐＩＮＳ－ＧＨ转化ＣＣＥ细胞没有获得明显表达的克隆,而且外源基因的整合也不稳定。转化的ＥＳ细胞克隆总ＤＮＡ的Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交结果表明,ｈＧＨ基因的确整合到细胞基因组中。目前尚未发现明显的外源ＤＮＡ重排的迹象。     

人生长激素基因在昆虫细胞中的表达(英文)

近年发展起来的昆虫细胞－杆状病毒基因工程系统具有良好的优越性：（１）表达产量高,（２）产物的免疫原性、功能性类似于天然产物,（３）适用于悬浮及无血清培养。本实验中,将外源基因ｈＧＨ克隆至质粒ｐＶＬ１３９３,形成转移载体ｐＶＬ１３９３／ｈＧＨ（Ｆｉｇ．１＆２）。与昆虫核多角体病毒ＡｃＮＰＶ基因组ＤＮＡ共转染秋粘虫细胞Ｓｆ９（Ｆｉｇ．３）,ｐＶＬ１３９３／ｈＧＨ与ＡｃＮＰＶ基因组ＤＮＡ发生同源重组,取代多角体蛋白基因。经空斑分析纯化得到不含多角体,单一表达的重组病毒ｒＡｃＶｈＧＨ（Ｆｉｇ．４）,感染滴度达到２．０３ｘ１０８ＰＵＦ／ｍＬ。经反复实验,１０５细胞／ｍＬ感染６～７天后收获培养上清液,可得到表达量为４０μｇ／ｍＬ的ｈＧＨ蛋白（Ｆｉｇ．５,６＆７）。     

促性腺激素对猪卵丘细胞-卵母细胞复合体体外减数分裂恢复作用的研究

本实验利用猪卵母细胞体外无血清培养技术,选用猪卵泡液中自然存在的次黄嘌呤（ＨＸ）作为卵母细胞自发成熟的抑制剂,研究了促性腺激素对猪卵丘细胞－卵母细胞复合体（ＣＥＯ）减数分裂恢复的具体作用。ＣＥＯ在含有不同浓度的促性腺激素（ＦＳＨ,ｈＣＧ,ＦＳＨ＋ｈＣＧ）的培养液中培养２４ｈ,观察卵母细胞减数分裂恢复（ＧＶＢＤ）情况。实验结果如下：１．ＦＳＨ（１－５００ＩＵ／Ｌ）能够明显刺激ＣＥＯ克服ＨＸ的抑制作用而恢复减数分裂（Ｐ＜０．０５）,该作用具有剂量依赖性;２．ｈＣＧ（１－５００ＩＵ／Ｌ）对ＣＥＯ减数分裂的恢复无明显作用;３．ｈＣＧ（１０－５００ＩＵ／Ｌ）与ＦＳＨ（１０,１００ＩＵ／Ｌ）无协同作用。上述结果表明,猪ＣＥＯ减数分裂的恢复可能主要依赖于ＦＳＨ的作用,该作用能使猪卵丘细胞产生一种或几种阳性因子,作用于卵母细胞,从而克服ＨＸ的抑制作用而恢复减数分裂。ｈＣＧ无明显作用,可能是因为卵丘细胞上没有ＬＨ受体或ＬＨ受体的数量不足     

人GM—CSF cDNA的克隆和在大肠杆菌中的表达

从诱导的人胚肺细胞ＨＦＬ株中提取总ＲＮＡ．经ＲＴ－ＰＣＲ反应获取了人ＧＭ－ＣＳＦｃＤＮＡ,ＤＮＡ序列测定表明其顺序与文献报道完全一致。为了获得高效表达,应用ＰＣＲ改造了人ＧＭ－ＣＳＦ的ｃＤＮＡ５’端核苷酸序列,并将改造的人ＧＭ－ＣＳＦ基因插入含Ｔ７启动子的质粒ｐＥＴ－１１ｄ构建成表达质粒ｐＥＴＣ－５,将此质粒转化大肠杆菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）得到表达菌株ＢＬＥＣ４。表达菌株用０．５ｍｏｌ／ＬＩＰＴＧ诱导２小时后,产生大量重组蛋白并形成包涵体。ＳＤＳ—ＰＡＧＥ电泳图谱扫描结果表明,ｒｈＧＭ－ＣＳＦ产量占菌体总蛋白量的１６％。ＥＬＩＳＡ和ＴＦ－１细胞培养测定表明,初步纯化和复性的ｒｈＧＭ－ＣＳＦ具有天然的ｈＧＭ－ＣＳＦ生物活性。     

逆转录病毒介导的TNFa基因在胶质瘤细胞系（C6）中的表达及对肿瘤细胞恶性生长的影响

利用逆转录病毒载体ＬＸＳＮ构建了含有完整编码ＴＮＦｃＤＮＡ的重组逆转录病毒质粒ｐＬＸＳＮ－ｔｎｆ,用Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ将重组质粒导入病毒包装细胞ｐＡ３１７,经Ｇ４１８筛选培养获得抗性克隆,用ＮＩＨ３Ｔ３细胞测定病毒滴度,获得滴度为５×１０５ＣＦＵ／ｍｌ的细胞克隆。利用病毒上清液感染大鼠胶质瘤细胞系Ｃ６,得到Ｇ４１８抗性克隆细胞Ｃ６ｐＬＸＳＮ－ｔｎｆ,经ＰＣＲ检测,ＴＮＦｃＤＮＡ完整地整合在细胞基因组中。测定Ｃ６ｐＬＸＳＮ－ｔｎｆ细胞上清中ＴＮＦ的生物活性,结果显示ＴＮＦ有相对稳定的表达（４８～１８０Ｕ／ｍｌ１０６ｃｅｌｌｓ／２４ｈ）。实验还显示经ＴＮＦ基因转导的Ｃ６ｐＬＸＳＮ－ｔｎｆ细胞生长速度较之亲本肿瘤细胞Ｃ６明显下降,基因修饰后的肿瘤细胞在Ｗｉｓｔａｒ大鼠体内形成肿瘤的能力明显受到抑制。进一步用超离心法浓缩病毒对胶质瘤移植模型进行了体内治疗研究。     

细胞松驰素B促微丝解聚对DNA合成的作用

利用微丝（ｍｉｃｒｏｆｉｌａｍｅｎｔ,ＭＦ）解聚药物细胞松驰素Ｂ（ｃｙｔｏｃｈａｌａｓｉｎＢ,ＣＢ）处理Ｇ_０期小鼠Ｃ_３Ｈ_（１０）Ｔ_（１／２）成纤维细胞,对Ｇ_０至Ｓ期ＤＮＡ合成,胸腺嘧啶核苷激酶（ｔｈｙｍｉｄｉｎｅｋｉｎａｓｅ,ＴＫ）活性、ＴＫ基因表达、钙调素（ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ,ＣａＭ）水平和一些细胞周期早期基因的表达进行了观察,Ｇ_０期细胞经３ｍｇ／ＬＣＢ处理２ｈ,促ＭＦ解聚增强了血清对Ｓ期细胞ＴＫ活性、ＴＫ基因表达和ＤＮＡ合成的刺激作用,并促进细胞提前进入Ｓ期．血清刺激Ｇ_０期细胞进入晚Ｇ_１期和Ｓ期时,ＣａＭ水平明显升高,而ＣＢ预处理则使ＣａＭ含量进一步增加,特别是ＣＢ处理促使Ｓ期ＣａＭ增加向核内转移．ＣＢ处理明显增强血清对ｃ－ｊｕｎ、ｃ－ｆｏｓ和ｃ－ｍｙｃ基因表达的刺激作用,而ＰＫＣ抑制剂Ｈ_７则抑制ＣＢ处理对这些基因转录的刺激作用,说明ＣＢ使Ｇ_０期细胞ＭＦ解聚刺激ｃ－ｊｕｎ、ｃ－ｆｏｓ和ｃ－ｍｙｃ的转录活性与ＰＫＣ的作用有关．结果表明Ｇ_０至Ｓ期早期ＭＦ的重组可促进细胞进入Ｓ期,增强ＤＮＡ合成．     

人铜锌超氧化物歧化酶cDNA的克隆,测序及表达

用逆转录聚合酶链反应（ＲＴＰＣＲ）,以人胎肝组织总ＲＮＡ为模板,扩增了人铜锌超氧化物歧化酶（ｈＣｕ,ＺｎＳＯＤ）的ｃＤＮＡ,并进行序列分析,将该ｈＣｕ,ＺｎＳＯＤｃＤＮＡ重组到Ｔ７启动子控制下的分泌型表达载体ｐＥＴ２２ｂ（＋）中,构建表达质粒ｐＥＴＳＯＤ,并转化大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）。ＳＤＳＰＡＧＥ及蛋白质印迹分析表明,经１ｍｍｏｌ／Ｌ异丙基硫代βＤ半乳糖苷（ＩＰＴＧ）诱导后,可高效表达一分子量为１９ｋＤ的蛋白质,与抗人ＳＯＤ多抗有特异的免疫反应,表达量约为菌体总蛋白质的３０％,具有特异性ＳＯＤ酶活性,酶活力可达１７９７ｕ／ｍｌ培基。     

人主动脉硫酸乙酰肝素蛋白聚糖对培养的人血管壁细胞生长的作用

通过培养的人主动脉平滑肌细胞（ｈＡＳＭＣ）及脐静脉内皮细胞（ｈＵＶＥＣ）,应用３Ｈ－ＴｄＲ参入、Ｎｏｒｔｈｅｒｎｂｌｏｔ分析、逆转录多聚酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）、放射免疫分析（ＲＩＡ）、和紫外比色法等技术观察了人主动脉中硫酸乙酰肝素蛋白聚糖（ＨＳＰＧ）对ｈＡＳＭＣ和ｈＵＶＥＣＤＮＡ合成的作用及对血小板源生长因子（ＰＤＧＦ）、ＰＤＧＦ受体、转化生长因子β（ＴＧＦ－β）、内皮素－１（ＥＴ－１）或碱性成纤维细胞生长因子（ｂＦＧＦ）基因表达和肾素－血管紧张系统（ＲＡＳ）的影响,结果显示,ＨＳＰＧ明显抑制培养的ｈＡＳＭＣ基础的ＤＮＡ合成（ｃｐｍ值为：１０３８５±３２６３ｖｓ,２５５４１±６４２１,Ｐ＜０．０１）及外源性ＰＤＧＦ诱导的ＤＮＡ合成（ｃｐｍ值为：９８７８±１９４７ｖｓ．１３４８１±４４ｌ０,Ｐ＜０．０５）;抑制ＰＤＧＦＡ链、ＴＧＦ－Ｂｐ和ＥＴ－１ｍＲＮＡ表达,提高ＰＤＧＦａ和β受体ｍＲＮＡ的表达;显著降低ｈＡＳＭＣ培养液中血管紧张素Ⅱ（ＡｎｇⅡ）的浓度和血管紧张素转换酶（ＡＣＥ）的活性,推测ＨＳＰＧ抑制ＰＤＧＦＡ链、ＴＧＦ－β及ＥＴ－１ｍＲＮＡ表达,降低ＡＣＥ活性及ＡｎｇⅡ浓度是其抑制ｈＡＳＭＣ增殖的重要机     

大蒜油抗肿瘤作用的流式细胞光度术分析

用流式细胞光度术（ｆｌｏｗｅｙｔｏｍｅｔｒｙ,ＦＣＭ）+Ｓ０．２ｍｌ／日。吐温对照组ｌＰ吐温８００．２ｍｌ／日,以排除大蒜油制剂中溶剂（吐温８０）的影响。实验组ｌＰＧＯ１００ｍｇ／ｋｇ／．日。于连续４次注射后的６ｈ,２、３、５、１０天及１０次注射ＧＯ后７天取材,行ＦＣＭ样品制备。三、ＦＣＭ样品制备与测定中国中医研究院基础所腹水癌细胞用ＰＢＳ洗涤,７０％酒精固定,ＲＮａｓｅ消化细胞中的ＲＮＡ,ＰＩ染色。用腹腔内淋巴细胞作标准二倍体细胞。用４２０型荧光激活细胞分选仪（美国Ｂｅｃｔｏ－Ｄｉｃｋｓｏｎ公司产品）测单个肿瘤细胞的ＤＮＡ含量,用组方图显示肿瘤细胞ＤＮＡ倍体性质。图中第一个是ＤＮＡ二倍体（ＺＣ）峰,处于该峰的细胞为Ｇ;／Ｇ。期细胞,第二个峰为４ＣＤＮＡ峰,该处细胞为Ｇ。－Ｉ－－Ｍ期细胞,从２。到４。之间的细胞为Ｓ期细胞。大于４。ＤＮＡ峰细胞为高倍体细胞‘’：。根据不同峰值大小判定用药后肿瘤细胞倍体性质的变化。结果ＮＳ与吐温对照组肿瘤细胞都为非整倍体性,且呈多倍体性（图１,２）。连续４次给药后６ｈ,绝大部分多倍体肿瘤细胞被杀伤,残存肿瘤细胞以二倍体为主,多倍体肿瘤细胞峰值显著下降,甚至在组方图上几乎显不出多倍     

用细菌/杆状病毒系统在昆虫细胞中表达GFP与HCV抗原融合蛋白

用细菌／杆状病毒（Ｂａｃ－ｔｏ－Ｂａｃ）系统在昆虫细胞中高效表达了绿色荧光蛋白（ＧＦＰ）与ＨＣＶ抗原的双功能融合蛋白,经ＥＬＩＳＡ测定和荧光显微镜观查证实,表达产物既能发射易于检测的绿色荧光,又具有ＨＣＶ的抗原活性,实现了用绿色荧光蛋白等分子标记抗原,为免疫诊断新方法的建立打下了理论基础．     

高活性重组hG-CSF的制备

我们构建了新的硫氧还蛋白（Ｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ）融合表达载体ｐＥＴＴｒｘＬ和ｐＥＴＴｒｘ－ＨｉｓＬ,它们可使功能蛋白在大肠杆菌胞质中以可溶性形式高效表达。利用此表达系统成功地获得的ｈＧ－ＣＳＦ－硫氧还蛋白融合蛋白的高效可溶性表达,表达水平达总细胞可溶蛋白的４１％以上。所表达的ｈＧ－ＣＳＦ－硫氧还蛋白融合蛋白可通过Ｃｕ２＋－ＩＤＡＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦ固相金属螯合层析柱,方便地从细胞破碎可溶上清中直接纯化。所获得的融合蛋白具有ｈＧ－ＣＳＦ特异的生物活性,其比活性达到０．５－１．３３×１０７ｕ／ｍｇ融合蛋白。这样表达的ｈＧ－ＣＳＦ融合蛋白能被ＩｇＡ蛋白酶特异地切割,将ｈＧ－ＣＳＦ从融合蛋白上切下获得与天然蛋白一级结构完全一致的重组ｈＧ－ＣＳＦ 。