艾氏乳腺癌腹水细胞质膜NADH-铁氰化钾氧化还原酶质子泵活性诱导细胞与脂质体融合

在本文中,我们用荧光能量共振转移分析和荧光显微技术证明,小鼠艾氏乳腺癌腹水细胞质膜NADH-铁氰化钾氧化还原反应的电子传递所偶联的质子泵活性能诱导细胞与人工脂质体融合。糖酵解代谢的抑制剂碘乙酸能抑制融合,同时融合过程是吸取质子的。近几年来,我们实验室已报道了多种生物膜质子泵均具有诱导膜融合的功能。因此,质子泵诱导膜融合可能具有比较广泛的生理意义。并为细胞中存在有受能量代谢控制的驱动膜融合的生理机制提供了实验证据。     

膜融合的分子机制:线粒体呼吸链不同偶联部位质子泵活性与膜融合程度之间的定量相关性(英文)

我们测定了鼠肝线粒体呼吸链不同偶联部位的质子系活性并通过荧光能量共振转移 法分析了鼠肝线粒体膜与脂质体（二油酰磷脂乙醇胺／心磷脂＝８／２）的膜融合程度。根据测量呼吸链第一段及第二段偶联部位的Ｈ＋／偶联部位的化学计量比值,观察到线粒体呼吸链质子泵的质子（Ｈ＋）泵活性及 Ｈ＋泵出量与膜融合程度呈现线性的定量相关性。这些实验结果进一步支持了我们提出的质子泵诱导膜融合的理论模型（刘树森等,１９８７、１９８９）。     

基于pH值敏感的荧光染料分析腺病毒诱导T淋巴细胞胞内体膜的裂解北大核心CSCD

【目的】探索基于pH值敏感的荧光染料分析腺病毒裂解T淋巴细胞胞内体膜的实验方法。【方法】本文以Jurkat细胞(T淋巴瘤细胞)为靶细胞,将pH值敏感的荧光染料pHrodo dextran与5型腺病毒(Ad5)共同孵育Jurkat细胞,对pHrodo dextran孵育的浓度与时间进行了优化,利用激光共聚焦显微镜分析胞内相对平均荧光强度百分比随时间的变化情况,反映Ad5诱导胞内体膜裂解情况。【结果】研究结果表明,在pHrodo dextran终浓度为80μg/m L,孵育时间为10 min条件下,在病毒感染后的30 min,相对平均荧光强度百分比出现显著下降;利用巴佛洛酶素A1抑制胞内体膜质子泵活性后,相对平均荧光强度百分比出现轻微下降。【结论】建立了基于pHrodo dextran分析腺病毒诱导T细胞胞内体膜裂解的新方法。     

融合蛋白TAT-RIG-I-GFP的原核表达及其跨膜递送

本研究旨在探讨融合蛋白TAT-RIG-I-GFP原核表达载体的构建并验证TAT在跨膜递送中的作用。首先设计了4对特异性引物,克隆了绿头鸭AnasplatyrhynchosRIG-I基因,构建了pET-TAT-RIG-I-GFP和pET-RIG-I-GFP原核表达载体;转化至感受态DE3细胞,经IPTG诱导表达,利用His60镍亲和层析柱纯化,进行SDS-PAGE;然后,将纯化后的上述两种表达蛋白分别孵育DF-1细胞;最后利用荧光显微镜观察是否在DF-1细胞产生相应的荧光。结果证实,携带有TAT的pET-TAT-RIG-I-GFP融合蛋白在DF-1细胞中显示出明显的绿色荧光;而不具有TAT的pET-RIG-I-GFP蛋白却不能显示绿色荧光。这表明携带TAT的融合蛋白已成功进入DF-1细胞,并在跨膜递送过程中发挥了关键作用。上述为进一步研制家禽的抗病毒药物奠定了基础。     

TAT介导多肽药物过表达纯化和穿膜活性检测

目的:获得NR2B羧基端多肽(NR2Pep),探讨TAT-NR2Pep在细胞中的跨膜特性。方法:利用酶切连接方法构建p Waldo-TAT-pep质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,检测不同浓度诱导剂和不同温度对蛋白质表达的影响;利用镍柱亲和层析及分子筛方法纯化TAT-NR2Pep-GFP融合蛋白,利用GFP发荧光的特性采用In-gel检测蛋白质的表达情况;以融合蛋白C端His标签特异性抗体,通过Western印迹确定融合蛋白的表达;荧光显微镜下观察TAT-NR2Pep-GFP融合蛋白在CHO和C2C12等细胞中的跨膜活性。结果:构建了TAT-NR2Pep-GFP表达载体,重组菌经0.1 mmol/L IPTG于22℃诱导20 h能够表达较多高质量的目标蛋白;In-gel荧光检测证实融合蛋白TATNR2Pep-GFP拥有正确构象,GFP能够发出绿色荧光;Western印迹分析表明融合蛋白相对分子质量符合预期;细胞穿膜实验证实TAT能够介导多肽穿过细胞膜。结论:原核表达并纯化得到TAT-NR2Pep-GFP融合蛋白,该蛋白散发绿色荧光,能够穿过细胞膜。     

植物生长素通过ABP1促进细胞膜泡的外排运输

为了研究植物生长素结合蛋白ABP1(auxin binding protein 1)对膜泡运输的调控,将烟草生长素结合蛋白基因ABP1 cDNA分别构建成可诱导型表达的过表达和干扰表达载体,并将绿色荧光蛋白GFP与烟草分泌载体膜蛋白SCAMP2(secretory carrier membrane protein 2)融合进行细胞的膜泡标记,转化植物模式细胞BY-2后分别获得了转ABP1和antiABP1的两类膜泡标记转基因细胞系。以雌二醇诱导ABP1、antiABP1表达后,结合生长素处理,通过扫描激光共聚焦观察了细胞的膜泡运输变化。当诱导ABP1在细胞内过量表达后,以吲哚-3-乙酸(indole-3-acetic acid,IAA)处理细胞,在细胞核膜及周围内质网膜、细胞质膜以及其他细胞内膜系统都观察到强烈的荧光信号,说明细胞内膜泡运输更为活跃;当诱导antiABP1在细胞内干扰表达时,在细胞核附近维持有较强烈的荧光信号,而细胞质膜及两细胞间隔的荧光信号明显减弱,表明抑制ABP1表达显著抑制了细胞膜泡的外排运输。在ABP1经诱导过表达后,加入IAA处理细胞,在0~6 min时间段内间隔性观察了细胞膜泡对生长素的时间响应,在这段时间内细胞核周围及内膜系统的荧光信号明显增强,细胞质膜的荧光强度没有明显的变化,表明细胞核与内膜系统间存在活跃的膜泡运输,内膜系统向细胞质膜间的外排膜泡运输也逐渐加强。因此,可以证明ABP1参与生长素信号响应,增强细胞膜泡的外排运输。     

肾小球系膜细胞间隙连接的通讯功能及其影响因素

本文利用激光扫描共聚焦显微镜及荧光漂白后荧光回复技术对人肾小球系膜细胞间隙连接的通讯功能及其影响因素进行了观察。结果发现,体外培养的肾小球系膜细胞在融合生长状况下,相邻两细胞有间隙连接结构形成。不同浓度的血管紧张素Ⅱ对肾小球系膜细胞间隙连接的通讯功能具有促进作用,而甲基强的松龙则具有抑制作用。     

聚乙二醇和金属离子诱导脂质体与细胞的融合

用荧光菜振能量转移技术检测ＰＥＧ和金属离子诱导脂质体和细胞的融合,发现有ＴＥＧ参与诱导时,虽然Ｃａ＾２＋对膜融合的促进作用仍专一地依赖于ＰＳ的存在,但其对ＰＳ的依赖性降低;Ｍｎ＾２＋促进含ＰＳ和ＰＥ的脂质体与细胞的融合,而Ｍｇ＾２＋无作用。以ＰＣ：ＣＬ：Ｃｈｏｌ为０．５：０．５：１的脂质体包埋天花粉蛋白,经ＰＥＧ诱导与骨髓瘤细胞ＳＰ２０融合,提高了天花粉蛋白对骨髓瘤细胞的杀伤力。     

PTD4-GFP-VP3融合蛋白在人肝癌细胞HepG2中的定位观察及凋亡诱导效应的实验研究

目的 观测PTD4-GFP-VP3融合蛋白诱导人肝癌细胞HepG2的凋亡效应及其在肿瘤细胞中的定位与其凋亡效应关系的研究.方法 构建PTD4-GFP-VP3融合蛋白的原核表达载体,利用人源肝癌细胞株HepG2,经细胞透膜实验在激光共聚焦显微镜下观察PTD4介导的融合蛋白透膜效应,DAPI染色观测该蛋白在细胞中的定位;利用TUNEL法观察PTIM-GFP-VP3融合蛋白诱导肿瘤细胞的凋亡效应,并利用流式细胞仪检测其凋亡率.结果 PTD4-GFP-VP3融合蛋白在孵育细胞0.5 h后即可透过细胞膜进入到细胞质中,12 h后定位于细胞核并诱导肿瘤细胞凋亡,48 h达到最高凋亡效应.结论 PTD4能携带GFP-VP3融合蛋白穿透细胞膜,在肿瘤细胞中具有核定位效应,并能诱导肿瘤细胞凋亡,为后期进一步研究VP3的凋亡机制及其抗肿瘤治疗奠定了基础.     

杆状病毒SpltMNPVSl136基因的克隆、表达及其产物功能

计算机分析斜纹夜蛾核多角体病毒（SpltMNPV)基因组序列,发现第136个读码框基因表达产物具有病毒囊膜蛋白的基本特征,计算机预测的SL136蛋白氨基酸序列N端具有信号肽,C端具有跨膜区,N端区还有一个许多病毒融合蛋白共有的卷曲螺旋结构。通过PCR扩增,我们克隆了Sl136基因并分别构建了原核表达载体pBVSl136及重组病毒表达载体,SDS-PAGE结果表明Sl136基因在大肠杆菌和昆虫细胞中均获得了较高的表达,另外,我们还构建了一个瞬时表达载体pUCSl136。单独转染Sl-zsu-1细胞后,低pH值环境可诱导细胞发生膜融合并形成合胞体,这些实验结果表明,Sl136基因表达的产物是一个病毒膜融合蛋白。     

H+参与茉莉酸调控蚕豆气孔运动的信号转导

以BCECF-AM为pH的荧光探针,结合激光共聚焦扫描显微技术,研究H 可能参与茉莉酸(JA)调控气孔运动信号转导途径的结果表明,0.1~100μmol·L~(-1)浓度的(-)JA可诱导蚕豆气孔关闭,在引起气孔孔径改变之前,(-)JA能引起蚕豆保卫细胞胞质的碱化;而(±)JA可诱导气孔适当开放,它未引起蚕豆保卫细胞胞质中pH的明显改变。药理学实验证明,质膜上质子泵的抑制剂矾酸钠能减弱(-)JA诱导气孔关闭的作用;而质膜上质子泵的激活剂壳梭孢菌素(fusicoccin)基本上未改变(±)JA的作用趋势。(-)JA和(±)JA刺激保卫细胞胞质Ca2 变化则表现出不同趋势。说明不同异构体形式的JA在调节气孔运动中的作用和信号转导途径有所不同。     

Tat蛋白转导区域位于融合蛋白C端时的跨膜递送作用

对Tat蛋白转导区域(PTDTat)的C端融合蛋白的跨膜递送作用进行探讨.采用DNA重组技术将PTDTat融合在绿色荧光蛋白(GFP)的羧基(C)端,构建重组表达质粒pGEXGFPTat,IPTG诱导其表达后,采用谷胱甘肽Sepharose4B(GS4B)亲和层析,获得纯化的谷胱甘肽S转移酶(GST)融合的重组蛋白GSTGFPTat.该蛋白与HeLa细胞共培养,荧光显微镜观察其荧光强度随着蛋白浓度的增高而增强.流式细胞仪分析发现,在4.0μmolL蛋白浓度下,转导效率高达80.0%;而在GFP氨基(N)端含有PTDTat的融合蛋白GSTTatGFP的阳性对照组,转导效率只有32.9%.实验结果表明,C端融合的PTDTat同样具有对外源蛋白的跨膜递送作用.该结果可能为PTDTat在蛋白药物递送方面的有效应用提供理论依据.     

磷脂酶C诱导膜融合的初步研究

用光散射、电镜和荧光共振能量转移技术研究了ＰＬＣ诱导两种单一膜脂组分的模型膜即二油酸磷脂酰胆碱（ＤＯＰＣ：ｄｉｏｌｅｏｙｌｐｈａｐｈｅｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）脂质体和二豆蔻酰磷脂酰胆碱（ＤＭＰＣ：ｄｉｍｙｒｉｓｔｏｙｌｐｈｏｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｅｌｏｎｅ）脂质体膜融合的可能性。结果表明：ＰＬＣ可以引起ＤＯＰＣ脂质体的融合。在相同的条件下,未见到ＤＭＰＣ脂质体的融合。这就首次证明了ＰＬＣ诱导单一组分脂质体融合的可能性。结果还表明：ＰＬＣ诱导脂质体膜融合的可能性大小与膜脂结构有关。用大鼠血影膜、人红细胞膜、大鼠巨噬细胞膜和大花萱草花瓣原生质体膜等天然生物膜作为材料,研究了磷脂酶Ｃ（ＰＬＣ：ｐｂｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅＣ）诱导上述各种天然膜融合的可能性,均未观察到膜融合现象。提示ＰＬＣ不易诱导天然细胞膜的融合。     

细胞穿膜肽pep-1与vMIP-Ⅱ的融合表达与纯化

细胞穿膜肽是一类能携带大分子物质进入细胞的短肽,其穿膜能力不依赖经典的胞吞作用。本研究构建了含有细胞穿膜肽pep-1和病毒巨噬细胞炎症蛋白-Ⅱ(viral macrophage inflammatory protein-Ⅱ,vMIP-Ⅱ)的融合表达质粒pET15b-pep-1-vMIP-Ⅱ,并将其转化大肠杆菌BL21(DE3)plysS中经IPTG诱导表达,经SDS-PAGE和Western-blot鉴定出可溶性的融合蛋白pep-1-vMIP-Ⅱ。通过对IPTG浓度、温度等诱导表达条件进行优化,确定在IPTG浓度为0.2mmol/L、28℃下诱导7h可溶性蛋白的表达量相对较高,经Ni-NTA亲和层析,超滤除盐纯化获得高纯度的融合蛋白pep-1-vMIP-Ⅱ,将该蛋白作用于Hela细胞,激光共聚焦显微镜观察结果显示该融合蛋白能够携带目的基因穿透细胞膜。本文结果将为进一步研究vMIP-Ⅱ的功能和细胞穿膜肽技术的应用奠定基础。     

热锻炼能提高菜豆细胞可溶性蛋白、SOD、膜ATP酶和质子泵在体外的热稳定性

以菜豆为实验材料,研究了蛋白质分子和生物膜在体外热稳定性的变化和原因。实验结果表明：热锻炼可增加细胞的耐热性,并赋予ＳＯＤ、膜ＡＴＰ酶和生物膜质子泵在体外的热稳定性;通过对可溶性蛋白热变性后的浊度分析和用ＡＮＳ荧光探针探测蛋白质的结构变化,发现蛋白热变性的原因是疏水区的暴露和分子相互团聚,~（３５）Ｓ－Ｍｅｔ标记分析和二维电泳谱揭示,热锻炼诱导合成的热激蛋白具有阻止蛋白质热变性和生物膜热破坏的功能。     

小麦根H^＋—ATPase与脂质体的重组方法研究

液泡是植物细胞中的大型细胞器,除了维持细胞的渗透压和贮存代谢的中间产物外,其内部还含有多种水解酶、pH值偏酸且具有类似溶酶体的功能。液泡膜ATPase是一种新类型的质子泵。由质子泵作用形成的跨液泡膜质子电化学梯度和质子驱动力为各种溶质(如阳、阴离子、氨基酸和糖类等)分子的主动跨膜转运提供了动力,使液泡成为植物细胞内离子平衡的调节器。液泡膜ATPase和线粒体膜ATPase都具有泵质子的功能,而且都受阴离子激活,其生化性质有许多相似     

HL-60细胞诱导分化期间细胞表面ConA受体结合量变化的研究

 <正> 在用二甲亚砜(DMSO)诱导人急性早幼粒细胞性白血病细胞系(HL-60 Cell)沿粒系统分化成熟的实验基础上,我们用受体荧光标记技术和荧光分光光度法,进一步观察了HL-60细胞诱导分化期间,细胞膜流动性动态降低对膜上伴刀豆球蛋白(ConA)受体结合量的影响。     

结构域B在鼠冠状病毒S蛋白的抗原性及膜融合中的作用

棘突(spike, S)蛋白是冠状病毒表面必不可少的跨膜糖蛋白,在病毒进入宿主细胞时具有结合受体和诱导膜融合的双重作用。大部分冠状病毒S蛋白的受体结合域位于S1-CTD(即相对应的结构域B),而经典的乙型冠状病毒模型鼠肝炎病毒(mouse hepatitis virus, MHV)的受体mCEACAM1a与S1-NTD(即相对应的结构域A)结合,其结构域B的作用仍未完全清楚。本研究通过构建结构域B和S2膜融合元件的缺失突变体,并使其在鼠神经母细胞瘤细胞系Neuro-2a内成功表达,证实了结构域B对病毒S蛋白导致的细胞-细胞间膜融合是必需的。用不同方法处理的病毒颗粒作为抗原免疫小鼠,所获得的多克隆抗体进一步显示,结构域B不但是S蛋白的主要抗原决定簇,而且能诱导中和抗体明显抑制病毒感染和S蛋白介导的膜融合作用。此结果为阐述不同冠状病毒的致病性与感染性差异提供了新思路。     

嵌合重组caspase-3诱导表达促进肿瘤细胞凋亡

通过稳定转染人宫颈癌HeLa细胞,建立了野生型caspase-3（wt-casp3）,大小亚基序列颠倒的重组caspase-3 (r-casp3),和N端融合绿脓杆菌外毒素（PE）转膜肽段的嵌合重组caspase-3 (cr-casp3)的诱导表达细胞系.蜕皮素诱导后细胞中检测到目的基因的表达,MTT检测和细胞计数结果表明,r-casp3和cr-casp3诱导表达后有效地导致HeLa细胞死亡,通过测定细胞中caspase-3活性,以及细胞周期检测、DNA梯状电泳条带检测(DNA ladder)、电镜观察等证实r-casp3和cr-casp3诱导表达后细胞发生了凋亡,且二者的促凋亡活性相当,而wt-casp3诱导表达细胞并未出现上述效应.结果表明,与野生型caspase-3活化需要上游分子的切割不同,重组caspase-3具有自发的促凋亡活性,而N端PE肽段的融合不影响这种活性,因此PE转膜结构域和重组caspase-3有望参与构建能转膜进入细胞内部,并杀伤细胞的新型肿瘤治疗分子.     

菜豆下胚轴质膜微囊和液泡膜微囊体外热稳定性的研究

从抗热潜势较高的“８５ＣＴ－４９７６２”菜豆（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ Ｌ．）的下胚轴分离出微粒体、质膜微囊和液泡膜微囊。通过比较正常细胞的膜微囊、热锻炼细胞的膜微囊以及热锻炼过程中放线菌酮抑制了蛋白质合成的细胞膜微囊的质子泵在体外的热稳定性,发现热锻炼可使细胞膜微囊质子泵体外热稳定性提高,热锻炼过程中合成的蛋白质与此效应有关。进一步分析膜外周蛋白对质子泵体外热稳定性的影响,证明热激蛋白ＨＳＰ７０ 和小分子量热激蛋白（ＬＭＷ ＨＳＰ）对质子泵有热保护功能