多异瓢虫气味结合蛋白HvarOBP2的基因克隆及配体结合特性分析

【目的】本研究旨在克隆多异瓢虫Hippodamia variegata气味结合蛋白(odorant-binding proteins, OBPs)基因HvarOBP2,并解析这一蛋白的配体结合特征。【方法】采用BLAST和生物信息学技术从多异瓢虫成虫触角转录组中鉴定候选气味结合蛋白基因HvarOBP2,PCR特异扩增HvarOBP2基因全长cDNA序列;通过体外原核表达和亲和柱层析等手段获得HvarOBP2重组蛋白;运用荧光竞争结合实验测定重组蛋白HvarOBP2与40种植物挥发物组分以及24种蚜虫相关挥发物组分的结合能力;使用PyMOL1.9.0进行重组蛋白HvarOBP2与4种配体(β-紫罗兰酮、邻苯二甲酸二丁酯、油酸和橙花叔醇)的分子对接模拟。【结果】HvarOBP2(GenBank登录号：OK340816)开放阅读框(open reading frame, ORF)长447 bp,其编码蛋白N端有17个氨基酸组成的信号肽,具有6个保守的半胱氨酸位点,属于classical OBPs亚家族。荧光竞争结合实验结果表明,重组蛋白HvarOBP2与植物挥发物组分油酸(解离常数K     

光肩星天牛气味结合蛋白AglaOBP12的基因克隆、表达及配体结合特征

【目的】克隆和鉴定光肩星天牛Anoplophora glabripennis气味结合蛋白(odorant binding proteins,OBPs)基因,明确其表达特点及与寄主植物挥发物的结合特性,有助于阐明光肩星天牛嗅觉识别的分子机制。【方法】根据光肩星天牛雌成虫触角转录组数据,利用RT-PCR克隆OBP12基因,并进行生物信息学分析。通过实时定量PCR(qRT-PCR)测定OBP12在光肩星天牛成虫触角、头(移除触角)、胸、腹、足、翅中的转录水平。利用原核表达系统和Ni离子亲和层析技术表达和纯化OBP12重组蛋白,荧光竞争结合实验测定重组蛋白与39种气味配体的结合能力。【结果】获得光肩星天牛气味结合蛋白基因AglaOBP12(GenBank登录号:KX890109)的完整编码序列,其开放阅读框长414 bp,编码137个氨基酸,N末端具有18个氨基酸组成的信号肽序列,蛋白序列具有6个保守的半胱氨酸残基,Agla OPB12属于Classical OBPs亚家族基因。qRT-PCR测定结果表明,AglaOBP12主要在成虫触角中表达,在其他组织微量表达。在待测的39种寄主植物挥发物中,重组蛋白AglaOBP12仅与19种化合物具有结合活性,表明AglaOBP12对寄主植物挥发物具有明显的选择结合特性。重组蛋白AglaOBP12与十二烷醇、十四烷醇、法尼醇、十二醛、乙酸-顺-3-己烯酯和β-石竹烯的结合能力较强,结合常数分别为1.96,0.96,1.03,0.82,0.77和0.74μmol/L。【结论】明确了AglaOBP12的核苷酸和氨基酸序列组成,重组AglaOBP12蛋白与主链有12个碳原子的醇类、醛类和萜烯类挥发物有特异性的结合活性。根据AglaOBP12基因的表达特点和重组蛋白的结合特性,推测AglaOBP12在光肩星天牛成虫定位补充营养寄主植物中发挥重要作用。     

梨小食心虫Minus-C气味结合蛋白的分子克隆、表达谱及结合特性分析

【目的】通过克隆梨小食心虫Grapholita molesta的Minus-C气味结合蛋白(odorant binding protein,OBP)基因,并测定其在成虫不同组织中的表达量及其重组蛋白对气味配体的结合能力,推测其嗅觉生理功能。【方法】基于梨小食心虫雌虫触角转录组测序数据,利用RT-PCR克隆MinusC OBP基因的完整编码区;qPCR测定该基因在成虫不同组织[触角、头(去除触角)、胸、腹、足、翅]中的表达量;构建原核表达系统表达重组蛋白,利用SDS-PAGE和Western blot检测蛋白的表达和纯度;运用荧光竞争结合实验测定重组蛋白与35种气味配体的结合能力。【结果】成功克隆了梨小食心虫的一个Minus-C OBP基因,命名为GmolOBP14(GenBank登录号:MF066361)。GmolOBP14开放阅读框长411 bp,编码136个氨基酸,成熟蛋白具有4个保守的半胱氨酸残基,属于Minus-C OBP亚家族。GmolOBP14在雌雄成虫的不同组织中均有表达,但在雄成虫翅和雌成虫触角中的表达量显著高于同性别的其他组织。重组蛋白GmolOBP14与气味配体的结合谱较窄,仅能与16种配体表现出不同程度的结合活性,其中与梨酯和十二醛的结合能力较强,解离常数Ki分别为6.92和12.74μmol/L;与癸醛、十四醛、顺-3-己烯-1-醇、苯甲醇和己酸丁酯有中等程度的结合活性,Ki分别为25.54,20.61,24.35,23.44和23.33μmol/L;GmolOBP14对性信息素组分没有结合活性,提示该蛋白不参与对性信息素的感受和识别。【结论】根据GmolOBP14基因的组织表达特点及其重组蛋白的结合特性,推测GmolOBP14除具有选择性结合和运输寄主植物挥发物的作用外,还参与与嗅觉无关的生理过程。     

核桃举肢蛾性信息素结合蛋白2的分子克隆和免疫荧光定位

【目的】明确核桃举肢蛾 Atrijuglans hetaohei Yang性信息素结合蛋白2(AhetPBP2)在核桃举肢蛾触角中的分布。【方法】本研究提取羽化后3-4 d的核桃举肢蛾成虫触角总RNA并反转录合成cDNA,设计简并引物进行RT-PCR获得cDNA片段,然后利用RACE技术获得 AhetPBP2全长cDNA序列。将去除信号肽序列的AhetPBP2进行原核表达,重组蛋白经镍柱纯化并免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体。制备的多克隆抗体作为一抗对核桃举肢蛾触角进行免疫组化分析。【结果】AhetPBP2基因cDNA序列全长923 bp,开放阅读框504 bp,共编码167个氨基酸,分子量为19.26 kD,等电点为5.47。1 mmol/L IPTG诱导10 h获得可溶性重组蛋白,Western blot结果表明重组蛋白诱导表达成功,ELISA检测显示抗体效价为1:1 024 000。免疫荧光定位结果显示核桃举肢蛾成虫触角部分感器被AhetPBP2抗体标记。【结论】核桃举肢蛾成虫触角的部分感器中可能存在AhetPBP2,推测该部分感器具有感受性信息素的功能。     

小地老虎化学感受蛋白AipsCSP8的表达及配体结合特性分析

【目的】本研究旨在解析小地老虎Agrotis ipsilon化学感受蛋白AipsCSP8的表达谱及配体结合特征。【方法】利用qRT-PCR方法测定了AipsCSP8在小地老虎成虫头、胸、腹、足、翅、性腺(附腺)、触角、喙和下唇须以及雌雄虫羽化前后触角中的表达水平。体外重组表达AipsCSP8蛋白,通过荧光竞争结合实验测定重组蛋白AipsCSP8对24种性信息素、22种植物挥发物和10种化学农药的结合特性。【结果】qRT-PCR检测结果显示,AipsCSP8在小地老虎雄成虫的足和下唇须中表达量最高,在附腺和触角中的表达量次之;在雌成虫的触角中表达量最高,在足、性腺、下唇须中的表达量次之。另外,雄、雌虫触角中AipsCSP8表达量分别在成虫羽化前1 d和羽化当天达到顶峰。荧光竞争结合实验结果表明,重组蛋白AipsCSP8对植物挥发物邻苯二甲酸-丁酯(解离常数Ki=14.6 μmol/L)、苯乙醛(Ki=17.2 μmol/L)以及化学农药阿维菌素(Ki=12.9 μmol/L)均有较强的结合能力。【结论】化学感受蛋白AipsCSP8可能参与小地老虎嗅觉行为及味觉识别,并可能在小地老虎感受化学农药的过程中发挥作用。     

甘薯蚁象气味结合蛋白CforOBP8的基因表达谱及配体结合特性分析

【目的】明确甘薯蚁象Cylas formicarius气味结合蛋白(odorant binding protein, OBP) OBP8的基因表达谱及与配体化合物的结合特性。【方法】基于甘薯蚁象成虫转录组数据,利用RT-PCR方法从甘薯蚁象成虫触角中克隆了气味结合蛋白OBP8基因,并进行生物信息学分析;采用qPCR方法测定该基因在甘薯蚁象成虫触角、口器、翅和跗节中的表达谱;构建原核表达载体,进行诱导表达及蛋白纯化。利用荧光竞争结合实验测定纯化的重组蛋白与16种配体化合物(1种性信息素和15种植物挥发物)的结合特性。【结果】获得甘薯蚁象气味结合蛋白基因CforOBP8(GenBank登录号:MH549528)的完整编码序列,其开放阅读框长414 bp,编码138个氨基酸,预测分子量为15.56 kD,等电点为4.71,N末端具有21个氨基酸组成的信号肽序列,蛋白序列具有4个保守的半胱氨酸,CforOBP8属于Minus-C OBPs亚家族。荧光定量PCR结果表明,CforOBP8在甘薯蚁象成虫触角中特异性表达,在其他组织中微量表达。SDS-PAGE结果显示融合蛋白成功表达。CforOBP8与配体化合物的结合力测试表明,CforOBP8与性信息素(E)-2-丁烯酸顺-(Z)-3十二烯基酯结合能力最强,解离常数K_i为4.13μmol/L;其次与5种植物挥发物也有一定的结合能力,依次为乙酸顺-3-己烯酯(K_i=7.54μmol/L)、柠檬烯(K_i=15.23μmol/L)、橙花醇(K_i=16.31μmol/L)、壬醛(K_i=28.71μmol/L)和苯乙醛(K_i=29.54μmol/L)。【结论】CforOBP8可能是甘薯蚁象性信息素结合蛋白,并且在感受性信息素和寄主植物挥发物的过程中都发挥作用。     

枣飞象对枣树七种挥发物EAG和嗅觉行为反应

【目的】枣飞象Scythropus yasumatsui Kono et Morimoto是枣树重要害虫之一。近年来,在陕北黄河沿岸枣区暴发成灾,造成了严重的经济和生态损失。为了明确枣树挥发物在枣飞象寄主定向过程中的作用,以便为开发植物源引诱剂奠定理论基础。【方法】采用触角电位仪和Y型嗅觉仪测定了枣飞象对枣树7种挥发物的触角电位和嗅觉行为反应。【结果】EAG试验结果表明:枣树的7种挥发物在一定的浓度下,都能引起枣飞象雌雄成虫明显触角电位反应,当刺激浓度为50μg/μL时,枣飞象对测定的7种挥发物的触角电位值达到最高,其中枣飞象雌雄虫对罗勒烯的EAG反应相对值均为最大,分别达2.87和2.53。嗅觉行为反应试验结果表明:罗勒烯、α-法呢烯均对枣飞象雌雄虫有明显的引诱作用,其中枣飞象雌雄成虫对罗勒烯趋向率高达70.8%、70.4%,而反-2-己烯醇仅对其雌虫表现引诱作用,对雄虫未表现出引诱作用。【结论】罗勒烯和α-法呢烯为吸引枣飞象雌雄成虫的活性物质,本反-2-己烯醇为吸引枣飞象雌虫的活性物质。     

棉铃虫气味结合蛋白HarmOBP16的组织表达谱及配基结合特性分析

【目的】揭示棉铃虫Helicoverpa armigera气味结合蛋白(odorant binding protein,OBP)基因Harm OBP16的组织表达谱及其重组蛋白与气味化合物的结合特性。【方法】基于棉铃虫触角转录组数据,利用PCR技术从棉铃虫成虫触角中PCR克隆气味结合蛋白基因,并进行生物信息学和系统进化分析;采用qPCR对其进行组织[头部(去除触角和喙)、胸部、腹部、足、翅、触角和喙]表达谱分析;进一步采用原核表达系统表达和纯化重组蛋白;最后采用荧光竞争结合实验测定该重组蛋白与85种候选气味物质的结合能力。【结果】从棉铃虫成虫触角中克隆得到一个Atypical OBP家族基因Harm OBP16(Gen Bank登录号:JQ753074),其开放阅读框长441 bp,编码146个氨基酸,推断的编码蛋白等电点为6.87,具有10个保守的半胱氨酸。组织表达谱结果表明,Harm OBP16在雌成虫翅中高表达。纯化后的重组蛋白Harm OBP16对植物花的挥发物香叶基丙酮(Ki=14.2μmol/L)、β-紫罗兰酮(Ki=15.2μmol/L)、辛醛(Ki=15.3μmol/L)、芳樟醇(Ki=16.8μmol/L)、(R)-(+)-柠檬烯(Ki=14.9μmol/L)和β-蒎烯(Ki=17.3μmol/L)有较强的结合能力。【结论】Harm OBP16可能在棉铃虫识别寄主植物的过程中发挥一定的作用,可为基于气味物质的棉铃虫引诱剂或驱避剂的研发提供潜在的分子靶标。     

光肩星天牛气味结合蛋白AglaOBP1的克隆、表达及结合特性

利用RT-PCR技术克隆了光肩星天牛Anoplophora glabripennis Motschulsky气味结合蛋白(odorant binding proteins,OBPs)基因AglaOBP1(Gen Bank登录号:KX660670),AglaOBP1的开放阅读框长435 bp,编码144个氨基酸,其中N端有21个氨基酸组成的信号肽序列,成熟蛋白序列具有4个保守的半胱氨酸残基,AglaOPB1属于Minus-C OBP亚家族基因。AglaOBP1主要在成虫触角中表达,且雌虫触角中的表达量显著高于雄虫触角。重组蛋白AglaOBP1与34种气味配体的竞争结合实验表明,AglaOBP1具有广泛的结合谱,能与五角枫挥发物中的醇类、醛类、萜烯类和酮类物质结合,其中与顺-3-己烯-1-醇、顺-2-己烯-1-醇、1-己醇、反-2-己烯醛、反-2-癸烯醛、β-石竹烯、(+)-桧烯、α-蒎烯、1-(2,3-二甲基苯基)-乙酮的结合能力较强,结合常数分别为5.88、8.33、12.29、12.55、11.90、7.47、9.07、10.29和13.12μM。此外,配体的官能团、碳链长度、空间构型也影响AglaOBP1对气味分子的结合。AglaOBP1基因在成虫触角中高丰度表达,其重组蛋白能够与五角枫挥发物的多种组分结合,表明AglaOBP1在成虫寄主定位选择中起重要作用。     

绿豆象气味受体基因的克隆和时空表达谱

【目的】本研究旨在克隆绿豆象Callosobruchus chinensis触角4个普通气味受体(odorant receptor, OR)基因,明确这些OR基因在绿豆象不同日龄雌雄成虫组织中的表达谱,为进一步研究基因功能奠定基础。【方法】基于绿豆象成虫触角转录组数据,预测绿豆象OR候选基因;利用RT-PCR克隆绿豆象4个OR基因的全长cDNA序列,并对其进行生物信息学分析;利用qPCR检测这4个OR基因在绿豆象雌雄成虫不同组织(触角、不含触角的头、腹、足和翅)中以及1, 3和5日龄雌雄成虫触角中的表达量。【结果】根据预测的基因序列,克隆得到4个绿豆象气味受体基因的cDNA全长序列,分别命名为CchiOR8,CchiOR10,CchiOR16和CchiOR39,GenBank登录号分别为MW732665, MN832705, MW732664和MN832706;编码的氨基酸数目分别为369, 352, 400和367。系统发育树分析表明,CchiOR8, CchiOR10和CchiOR16均与大猿叶甲Colaphellus bowringi的同源蛋白亲缘关系较近,而CchiOR39与果...     

梨小食心虫气味结合蛋白GmolOBP3的cDNA克隆、表达谱及结合特性分析

【目的】为了更好地了解昆虫气味结合蛋白（odorant binding proteins, OBPs）在梨小食心虫Grapholita molesta（Busck）嗅觉识别中的作用,并明确其与寄主挥发物的结合特性。【方法】利用RT-PCR和RACE技术克隆梨小食心虫OBP基因;采用RT-PCR和实时定量PCR对该基因在成虫不同组织和羽化后不同日龄成虫中的表达情况进行了测定;以N-phenyl-1-naphthylamine（1-NPN）为荧光探针,采用荧光竞争结合试验对GmolOBP3蛋白的结合特性进行了分析。【结果】得到梨小食心虫一个新的气味结合蛋白基因,命名为GmolOBP3（GenBank登录号：KF395363）。GmolOBP3开放阅读框全长492 bp,编码163个氨基酸残基,预测分子量和等电点分别为18.72 kDa和4.93,呈酸性,具有典型的6个半胱氨酸位点。GmolOBP3在雌、雄成虫触角和腹部均有表达,成虫在羽化后5 d内,雌蛾触角中GmolOBP3表达量随羽化后日龄而增加,但雄蛾在羽化后第5天触角中 GmolOBP3表达量显著降低。通过构建GmolOBP3原核表达载体,在大肠杆菌Escherichia coli中诱导表达并获得了GmolOBP3重组蛋白。荧光竞争结合实验对GmolOBP3蛋白与16种寄主挥发物及4种性信息素类似物的结合力发现,在供试的4种梨小食心虫性信息素类似物中,GmolOBP3蛋白与反-8-十二碳烯醋酸酯和十二烷-1-醇不结合,而与顺-8-十二碳烯醋酸酯和顺-8-十二碳烯醇结合,但结合力较弱,结合常数分别为83.00和103.70 μmol/L;与16种寄主挥发物结合能力也不强,其中结合最强的是β 紫罗酮,结合常数为49.36 μmol/L。【结论】由此推断,GmolOBP3具有选择性识别和结合各种配基的特性。     

豌豆蚜触角转录组化学感受蛋白的鉴定、表达和结合特性分析

[目的]本研究旨在鉴定豌豆蚜Acyrthosiphon pisum触角转录组中化学感受蛋白(chemosensory protein,CSP)基因,明确触角中高表达的豌豆蚜CSP蛋白与蚜虫报警信息素、性信息素以及植物挥发物的分子结合特性.[方法]通过对豌豆蚜成蚜触角进行转录组测序,鉴定触角中候选CSP基因;采用RPKM...     

枣飞象对枣树植物挥发物的EAG和行为反应

【目的】枣飞象Scythropus yasumatsui是枣树Zizyphus jujuba主要害虫。近年来,在陕西和山西枣区暴发成灾,造成了严重的经济和生态损失。本研究旨在明确枣树挥发性物质在枣飞象成虫化学通讯中的作用,为该虫植物源引诱剂开发和研制提供基础资料。【方法】利用顶空吸附法收集5个枣树品种(木枣、狗头枣、赞皇枣、骏枣和酸枣)的枣芽挥发物,采用气质联用(GC-MS)进行化学指纹谱的鉴定和分析;随后分别利用触角电位(electroantennogram, EAG)仪和Y型嗅觉仪测定枣飞象成虫对17种枣树挥发性物质的EAG和行为反应。【结果】5个品种枣树的枣芽中共鉴定出挥发性物质6类26种,包括9种萜烯类、6种酯类、4种醇类、4种烷类、2种醛类和1种酚类;不同品种枣芽挥发性物质种类和含量具有差异。EAG试验结果表明,枣飞象成虫对测试的17种枣树挥发性物质的EAG反应相对值有明显差异。枣飞象成虫对D-柠檬烯、正十三烷、正十四烷、正十五烷、壬醛、棕榈酸甲酯、油酸甲酯7种挥发性物质的EAG反应较强。当挥发性物质浓度为0.1~100 μg/μL时,随着浓度增加,枣飞象成虫的EAG反应相对值先增加后下降,刺激浓度为50 μg/μL时EAG反应相对值达到最大。50 μg/μL浓度下,枣飞象雌成虫对棕榈酸甲酯和壬醛EAG反应相对值分别为3.84和3.67,雄成虫对棕榈酸甲酯和壬醛EAG反应相对值分别为3.47和3.21,极显著高于对其他挥发性物质的EAG反应相对值。行为反应结果表明,枣飞象雌雄成虫对棕榈酸甲酯和壬醛有明显趋向性, 选择率均大于65%,雄成虫对十五烷有明显趋向性,雌雄成虫对其他供试的物质无明显趋向性。【结论】棕榈酸甲酯和壬醛对枣飞象雌雄成虫均有明显吸引作用,十五烷对雄成虫有明显吸引作用。结果提示棕榈酸甲酯和壬醛可能与枣飞象对不同品种枣树偏好性选择密切相关。     

桃蛀螟气味结合蛋白CpunOBP3和CpunOBP4的基因克隆、原核表达及配体结合特性分析

[目的]本研究旨在明确气味结合蛋白(odorant binding proteins,OBPs)在桃蛀螟Conogethes punctiferalis化学感受过程中的生理功能,为以OBPs蛋白为防治靶标的桃蛀螟绿色防控提供理论依据.[方法]基于前期桃蛀螟触角转录组测序数据,利用PCR技术从桃蛀螟触角中获得桃蛀螟气味结...     

桃蛀螟性信息素结合蛋白Cpun-PBP1的cDNA克隆、表达谱及其与配体化合物的结合特性分析

【目的】为了更好地了解性信息素结合蛋白（pheromone binding proteins, PBPs）在桃蛀螟Conogethes punctiferalis （Guenée）嗅觉识别过程中的作用,明确其与配体化合物的结合特性。【方法】本研究利用RT-PCR结合RACE方法克隆了桃蛀螟一个性信息素结合蛋白基因;采用Real-time PCR方法分析了该蛋白在桃蛀螟不同发育阶段及雌雄蛾间的表达差异;利用荧光竞争结合实验对Cpun-PBP1蛋白与16种配基化合物的结合特性进行了分析。【结果】克隆了一个桃蛀螟性信息素结合蛋白基因,命名为Cpun-PBP 1（GenBank登录号：KP027486）。Cpun-PBP 1开放阅读框全长510 bp,编码 169个氨基酸,预测分子量为19.12 kDa,等电点为5.09,N-末端包括由起始位置开始的30个氨基酸组成的信号肽。蛋白特征分析显示,该氨基酸序列具有昆虫气味结合蛋白的典型特征,即含有6个保守的半胱氨酸残基。Cpun-PBP 1在桃蛀螟成虫阶段表达量最高,且几乎全部在触角中表达,卵期微量表达,幼虫期和蛹期均不表达。通过构建Cpun-PBP 1原核表达载体,诱导并获得Cpun-PBP 1重组蛋白。荧光竞争结合实验对2种性信息素组分和14种寄主植物挥发物的结合力发现,Cpun-PBP1不但能有效地与桃蛀螟性信息素组分（顺-10-十六碳烯醛和十六醛）结合,结合常数分别为7.32和9.39 μmol/L;还能与8种寄主植物挥发物有效结合;其中,与莰烯的结合能力最强,结合常数为3.76 μmol/L。【结论】根据这些结果,我们推测Cpun-PBP1在桃蛀螟感受性信息素和寄主植物挥发物的过程中发挥着双重作用。     

基于微卫星标记的中国枣食芽象甲地理种群遗传多样性分析

【目的】枣食芽象甲Scythropus yasumatsui是我国北方枣树Zizyphus jujuba上的一种重要的灾害性害虫,在陕西、山西、河北、河南等枣树主产区普遍发生。本研究旨在揭示我国枣食芽象甲不同种群间的遗传分化和基因交流规律。【方法】利用枣食芽象甲转录组测序的SSR序列,使用荧光标记PCR及毛细管电泳分型方法,筛选出8个微卫星位点,对我国5个省份(山西、陕西、宁夏、河北和河南)10个地理种群共308头枣食芽象甲样本进行种群遗传多样性分析。【结果】8个SSR位点均存在无效等位基因且偏离哈迪 温伯格平衡。各位点的有效等位基因数(Ne)为2.113~8.016,多态信息含量(PIC)为0.561~0.908,期望杂合度(He)为0.476~0.865;种群间遗传分化系数(Fst)平均值为0.151;基因流(Nm)平均值为1.594。枣食芽象甲种群间遗传分化系数与地理距离之间显著正相关(r=0.596, P=0.0035),基于Nei’s遗传距离和Cavalli-Sforza & Edwards余弦遗传距离的系统进化树将10个地理种群均聚为3个相同的分支。【结论】结果说明,枣食芽象甲种群遗传多样性较高,不同地理种群间存在高度的遗传分化,且有一定的基因交流;地理隔离是影响枣食芽象甲地理种群遗传分化和基因交流的重要因素。     

松墨天牛OBP基因MaltOBP2和MaltOBP6的克隆、序列分析及组织表达谱和原核表达研究

【目的】本研究旨在探索松墨天牛Monochamus alternatus Hope在嗅觉识别寄主植物过程中扮演重要角色的气味结合蛋白(odorant binding proteins,OBPs)的结构及功能。【方法】利用生物信息学方法对得到的Malt OBP2和Malt OBP6基因序列和蛋白结构进行分析,并通过实时荧光定量PCR分析Malt OBP2和Malt OBP6在松墨天牛雄虫不同组织和时空中的表达差异,利用p ET32a(+)原核表达载体对Malt OBP2和Malt OBP6进行了诱导蛋白表达。【结果】本研究得到两个松墨天牛气味结合蛋白基因——Malt OBP2(Gen Bank登录号:KP120891)和Malt OBP6(Gen Bank登录号:KP120892),ORF长度分别为402 bp和408 bp,翻译的氨基酸序列均含有4个保守的半胱氨酸位点,表明得到的两个OBP基因的编码蛋白均属于Minus-C OBP亚家族;推导的两个OBP蛋白均有6个α螺旋区域,且α螺旋区域在两个蛋白的位置非常相似,但是两个OBP蛋白推测的配体结合位点和位点极性却完全不同。组织表达模式表明,Malt OBP2和Malt OBP6在成虫头部、触角、下颚(唇)须、腹部末端和足中均有表达,表达程度不一,但都在头部显著表达,触角中的表达量相比其他组织中较低或只是持平。发育表达结果表明,Malt OBP2在蛹触角中的表达量最高,而Malt OBP6在幼虫头部的表达量最高。本研究成功构建了原核表达载体p ET32aMalt OBP2和p ET32a-Malt OBP6,并进行了OBP蛋白诱导表达,低温(16℃和20℃)条件利于蛋白表达在上清液中,延长诱导表达时间(12 h)可以增加蛋白的表达量。【结论】本研究从松墨天牛体内得到了Minus-C OBP蛋白亚家族的两个基因Malt OBP2和Malt OBP6,通过配体结合位点推测它们具有不同的生理功能;通过组织表达谱结果推测这两个OBP基因在松墨天牛中的功能不仅仅局限于嗅觉识别,或还有味觉感受、化学感受等其他生理功能。本研究结果为两个OBP蛋白的结构和功能研究奠定了基础,为探索松墨天牛的化学感受机制提供了条件。     

中华蜜蜂气味结合蛋白AcerOBP14的表达及配体结合特性分析

[目的]气味结合蛋白(odorant binding proteins,OBPs)在昆虫寄主定位、产卵地选择等行为中发挥着重要作用,明确中华蜜蜂Apis cerana cerana AcerOBP14与配体的结合特性有助于阐明中华蜜蜂嗅觉识别的分子机制.[方法]通过qRT-PCR测定OBP14在20日龄中华蜜蜂成年工蜂...     

疆夜蛾Plus-C气味结合蛋白PsauOBP7的组织表达谱及配体结合特性分析

【目的】明确疆夜蛾Peridroma saucia Plus-C气味结合蛋白PsauOBP7在不同化学感受器官中的表达谱，解析PsauOBP7重组蛋白的气味结合特异性。【方法】通过qRT-PCR检测PsauOBP7在疆夜蛾雌蛾和雄蛾的触角、口器、足和翅中的表达谱。原核表达并纯化PsauOBP7重组蛋白，利用Western blot检测PsauOBP7在疆夜蛾不同龄期幼虫头部及成虫不同组织中的表达情况；通过荧光竞争结合实验检测PsauOBP7重组蛋白对39种气味化合物的结合能力。【结果】成功表达并纯化PsauOBP7重组蛋白。qRT-PCR及Western blot检测显示PsauOBP7表达于4-6龄幼虫头部及雌雄成虫的触角、口器、足和翅中。荧光竞争结合实验显示PsauOBP7与反-2-己烯醛的结合能力最强，Ki=1.4 μmol/L。此外，PsauOBP7与5种酯类化合物乙酸月桂酯、顺-3-己烯乙酸酯、乙酸苯乙酯、苯甲酸己酯和肉桂酸甲酯有一定的结合能力，Ki值分别为5.7, 6.5, 8.9, 9.5和10.2 μmol/L。PsauOBP7与两种醇类化合物顺-3-己烯-1-醇和法尼醇也有较强的结合能力, Ki值分别为5.8和5.9 μmol/L。【结论】疆夜蛾Plus-C气味结合蛋白PsauOBP7表达于其幼虫和成虫的多种化学感受器官中，且能结合多种植物气味化合物，说明其在疆夜蛾寻找寄主植物过程中发挥重要作用。