高原鼢鼠神经型一氧化氮合酶基因编码区序列克隆与分析

高原鼢鼠是青藏高原特有的地下鼠,受到高原低氧以及洞穴低氧的双重低氧环境压力。经RNA 提取、RT-PCR、亚克隆与测序,本研究获得高原鼢鼠神经型一氧化氮合酶(nNOS)的编码区序列,并对其分子特征进行了分析。结果显示:高原鼢鼠nNOS 基因编码区(CDS)全长4 290 bp,编码1 429 个氨基酸残基;CDS 与大鼠、小鼠、兔、狗、人的同源性分别为90% 、89% 、87% 、87% 、89% ;结构域上,高原鼢鼠nNOS 具有PDZ蛋白结构域、氧化域、还原域及钙调素结合位点等nNOSs 所具有的典型结构域;基于nNOS 的最大似然树和贝叶斯树均支持高原鼢鼠与大鼠、小鼠具有最近的亲缘关系,与形态或其它分子标记构建的进化关系相符;分子进化分析检测到高原鼢鼠nNOS 中存在3 个正选择位点---332 T、1200 G 和1334 P,但均未达到统计显著水平。本研究为揭示高原鼢鼠nNOS 的表达特征及其在低氧适应中的作用与调控机制研究奠定了初步基础。     

高原鼠兔诱导型一氧化氮合酶cDNA克隆及序列分析

高原鼠兔Ochotona curzoniae,世居在青藏高原海拔3000~5000 m的地区,是一种典型的低氧耐受哺乳动物。一氧化氮(NO)作为一种有效的血管舒张因子,在预防低氧诱导的低氧性肺血管收缩反应和肺动脉高压中发挥着重要功能。诱导型一氧化氮合酶(iNOS)是一种催化L-精氨酸合成NO的重要酶,受低氧调控。本研究经RTPCR和cDNA 3’末端快速扩增(3’RACE)方法成功克隆了高原鼠兔iNOS基因cDNA序列,并对其分子特征进行了分析。结果显示:高原鼠兔iNOS cDNA全长为3981 bp,开放阅读框(ORF)为3450 bp,共编码1149个氨基酸残基;预测的蛋白序列与北美鼠兔、兔、人、大鼠、小鼠、狗以及猪的同源性分别为98%、87%、82%、78%、78%、82%和83%;蛋白结构预测结果显示高原鼠兔iNOS具有氧化域、还原域及黄素腺苷酸结合区域等iNOS所具有的典型结构域;基于iNOS的最大似然树和贝叶斯树均支持鼠兔与兔有最近的亲缘关系,与形态或其他分子标记构建的进化关系相符;分子进化分析检测到高原鼠兔iNOS中存在3个正选择位点——32T、33Y和46R,但不同模型的结果表明哺乳动物iNOS基因所受选择以净化选择为主,不支持iNOS在高原鼠兔支系发生适应性进化。该研究为揭示高原鼠兔iNOS的表达特征及其在低氧适应中的作用与调控机制研究奠定了初步基础。     

高原鼠兔脑红蛋白基因的克隆与组织表达

克隆高原鼠兔脑红蛋白(Neuroglobin,NGB)基因编码区并检测其在成年高原鼠兔脑组织和其他组织中的表达,同时探讨高原鼠兔低氧适应的分子生物学机制。从高原鼠兔脑组织中提取总RNA,通过RT - PCR 获得高原鼠兔NGB cDNA,将其与pGEM - T Easy 载体连接,构建重组质粒,蓝白斑筛选阳性克隆并进行鉴定和测序;制备地高辛标记的RNA 探针并采用原位杂交法(In suit hybridization,ISH) 分析脑红蛋白基因在高原鼠兔脑组织中的分布;采用RT - PCR 和蛋白印记(Western blot)检测高原鼠兔不同组织中脑红蛋白的表达含量。将含有目的片段的阳性克隆经测序和Blast 分析,显示其部分编码序列与GenBank 中绵羊、大鼠等同源性很高(大于84% ),表明本实验所克隆的序列为脑红蛋白基因;原位杂交结果显示NGB 在青藏高原土著动物高原鼠兔脑部分布较为广泛;高原鼠兔不同组织中都有NGB mRNA 表达,NGB 基因并不是中枢神经系统所特有的,睾丸和肾上腺也有较高的表达。NGB 基因在高原鼠兔脑组织和其他组织中分布较为广泛,推测NGB mRNA 可能在高原鼠兔机体较为广泛的区域中发挥着作用,同时为高原低氧适应相关基因的研究提供了实验依据。     

藏羚羊组蛋白去乙酰化酶1 基因编码区的克隆与序列分析

为探讨藏羚羊的低氧适应机制与高原低氧环境的相关性,采用RT-PCR 技术,首次从藏羚羊心肌组织总DNA 中克隆出组蛋白去乙酰化酶1 (Histone deacetylase1,HDAC1)基因的编码区序列。该序列全长为1 449 bp,
编码482 个氨基酸,预测其蛋白质分子量约为55 kDa。序列分析表明,藏羚羊HDAC1 基因的编码区序列与其它哺乳动物相似性超过90% ,其中与牛的相似性最高为98.27% ;它的氨基酸序列与其它哺乳动物的相似性达到
98.76% ～ 99.59%,显示出极高的保守性。利用邻接法(Neighbor-Joining,NJ 法)构建的分子系统进化树聚类结果表明,藏羚羊与牛先聚为一类,该聚类结果与传统的物种进化关系基本一致。藏羚羊HDAC1 基因编码区的成
功获得,为进一步揭示藏羚羊低氧适应的表观遗传机制奠定基础。     

高原鼠兔脑组织中精子特异性乳酸脱氢酶的作用

高原鼠兔对高原低氧环境有很强的适应性。研究发现,精子特异性乳酸脱氢酶(LDH-C4)基因在高原鼠兔脑组织中表达,为阐明LDH-C4在高原鼠兔脑组织中的作用,应用荧光定量PCR和Western blot方法,测定了Ldh-c基因在高原鼠兔脑组织中的表达水平;应用对精子特异性乳酸脱氢酶(LDH-C4)特异性的抑制剂(N-isopropyl oxamate),通过肌肉注射后,研究抑制剂对高原鼠兔脑组织中LDH比活力、乳酸和ATP含量的影响。结果表明,在mRNA和蛋白水平,Ldh-c基因在高原鼠兔脑组织中均有表达,相对表达水平分别为0.38±0.05和0.74±0.13;当肌肉注射1 m L 1 mol/L的抑制剂30 min后,血液中抑制剂浓度为0.08 mmol/L;与对照组相比,抑制剂组脑组织中LDH比活力、乳酸和ATP含量显著下降,抑制剂对LDH、乳酸和ATP的抑制率分别为30.78%、46.47%和21.04%。结果表明,精子特异性乳酸脱氢酶基因在高原鼠兔脑组织中表达。LDH-C4通过催化无氧糖酵解过程,为其脑组织生命活动提供至少20%的ATP,可能使高原鼠兔减小在低氧环境中对氧气的依赖,增强对低氧环境的适应能力。     

高原鼠兔低氧适应分子机制的研究进展

高原鼠兔（Ochotona curzoniae）是生活在青藏高原海拔3000-5000m地区的特有物种,具有极强的低温、低氧耐受能力。近十几年来,许多国内外学者从整体水平及分子水平对高原鼠兔的低氧适应机制进行了大量研究,认为该动物是研究低氧适应的理想动物模型。本文对高原鼠兔的低氧适应机制从血液学特征、肺血管的结构和功能及分子生物学研究等方面作一系统阐述,旨在阐明高原土生动物在高寒缺氧环境中生存的适应机制,这对人类适应高原及高原疾病的防治有着重要的指导意义。     

高原鼢鼠prestin基因的组织特异性表达与适应地下生活的关系

高原鼢鼠是青藏高原特有的地下鼠,地下鼠具有准确的空间定位能力。prestin蛋白是在耳蜗特异性表达且与回声定位有关的蛋白分子。为了探讨prestin基因与高原鼢鼠地下空间定位之间的关系,我们克隆了高原鼢鼠prestin基因的编码区序列,并与其他物种的prestin基因序列进行序列比对;运用PAML软件对高原鼢鼠的prestin基因进行进化分析;根据已克隆的序列,应用实时荧光定量的方法测定高原鼢鼠耳蜗、尾部、足垫和鼻垫组织中prestin基因mRNA的表达水平。研究结果表明,与人、大鼠、小鼠、裸鼢鼠、家兔和牛6种哺乳类动物相比,高原鼢鼠prestin基因编码的氨基酸序列显示存在9个氨基酸残基突变;Test2模型未检测到统计上显著的正选择位点;高原鼢鼠耳蜗prestin基因mRNA的表达水平显著高于高原鼠兔(P<0.05),高原鼢鼠耳蜗和尾部prestin基因mRNA的表达水平显著高于足垫和鼻垫（P<0.01）。以上结果说明,prestin基因不仅在高原鼢鼠耳蜗中表达,而且在尾部、足垫和鼻垫组织中也有表达。高原鼢鼠在地下洞道生活过程中,可能利用尾巴、前后足和鼻子辅助感知低频声波,从而准确地进行空间定位。     

高原鼢鼠肝脏组织细胞周期相关基因的进化和表达

高原鼢鼠Myospalax baileyi是一种世居青藏高原的地下鼠,对严重的低氧环境有很强的适应性。低氧诱导细胞周期G1、G2期阻滞。为了探讨高原鼢鼠适应低氧环境的分子机制,应用生物信息学方法对p53下游细胞周期基因p21、CyclinD1、CyclinE、CDK6、CDK2、14-3-3-σ、Gadd45α、B99和CyclinB1的序列和编码的氨基酸序列进行了进化分析,并以SD大鼠Rattus norvegicus为对照,研究了这些基因在不同海拔(3300 m、2260 m)条件下的表达模式。结果表明:(1)高原鼢鼠细胞周期相关基因的序列与以色列鼹鼠Nannospalax galili同源性最高,达到90%以上;p21、CyclinD1、CyclinE和CyclinB1编码蛋白与以色列鼹鼠存在明显的趋同进化位点;SIFT评估发现,p21和CyclinB1氨基酸序列分别在第27号位点和第105号位点的变异对细胞周期调控功能有显著影响;(2)与低海拔条件相比,在高海拔条件下,高原鼢鼠肝脏组织中与G1期相关的基因p21表达水平显著上升,p21下游基因CyclinD1、CyclinE、CDK6和CDK2表达水平显著下降,而在SD大鼠中没有显著变化;与G2期相关的基因Gadd45α、B99、14-3-3-δ和CyclinB1在高原鼢鼠和SD大鼠中随海拔变化不发生明显变化。在不同海拔条件下,高原鼢鼠肝脏组织中的上述细胞周期相关基因的表达水平均极显著高于SD大鼠(P<0.01)。以上结果提示,高原鼢鼠经过长期的低氧适应,通过上调p21基因的表达抑制下游CyclinD1、CyclinE、CDK6和CDK2基因的表达,导致细胞周期G1期阻滞,从而提供充足的时间进行DNA修复,保证了DNA复制的准确性;同时高原鼢鼠肝脏组织中细胞周期的调控不仅与细胞周期基因的表达水平有关,而且可能与细胞周期因子p21的第27号位点和CyclinB1的第105号位点的变异有关。     

高原鼠兔组织中精子特异性乳酸脱氢酶的作用机理

高原鼠兔Ochotona curzoniae具有很强的高原低氧适应能力。前期研究发现,精子特异性乳酸脱氢酶(LDH-C4)在高原鼠兔体细胞中表达。为阐明LDH-C4在高原鼠兔组织中的作用机理,应用RNA干扰技术沉默高原鼠兔心肌、肝脏和脑组织中的Ldh-c基因;应用荧光定量PCR和Western Blot方法,测定Ldh-c基因在心肌、肝脏和脑组织中的表达水平;应用生物化学方法测定沉默Ldh-c基因后,心肌、肝脏和脑组织中LDH比活力、乳酸和ATP的含量。结果表明,腹腔注射腺病毒p MultiRNAi-Ldhc能极显著降低高原鼠兔组织中Ldh-c基因的表达水平,在mRNA和蛋白水平,心肌中Ldh-c基因的表达分别下降48.11%和19.27%;肝脏中Ldh-c基因的表达分别下降70.16%和25.82%;脑中Ldh-c基因的表达分别下降49.08%和25.36%。沉默Ldh-c基因表达后,高原鼠兔心肌、肝脏和脑组织中LDH比活力、乳酸和ATP的含量也显著降低,分别下降25.58%、41.94%和21.23%,28.16%、15.90%和24.66%以及16.65%、12.78%和18.50%。这些结果说明,高原鼠兔在低氧环境中,其心肌、肝脏和脑组织通过LDH-C4催化无氧糖酵解获得部分ATP,增强对低氧环境的适应能力。     

高原鼢鼠和高原鼠兔骨骼肌糖酵解和肝脏乳酸代谢的差异(英文)北大核心CSCD

高原鼠兔(Ochotona curzoniac)和高原鼢鼠(Myospalax baileyi)是青藏高原地区特有的土著动物。本文旨在探讨高原鼠兔和高原鼢鼠骨骼肌糖酵解和肝脏乳酸代谢的不同生理机制。我们克隆出两种动物肝脏中的丙酮酸羧化酶(pytuvate carboxy-lase,PC)基因的部分序列;应用real-timePCR法测定两种动物肝脏和骨骼肌中PC、LDH-A和LDH-BmRNA的表达水平;使用苹果酸偶联法测定肝脏中PC酶活力,并测定两种动物骨骼肌和肝脏中乳酸含量、乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)活力;用聚丙烯酰胺凝胶电泳观察肝脏和骨骼肌LDH同工酶谱。结果显示:(1)高原鼢鼠骨骼肌LDH-BmRNA的表达量极显著高于高原鼠兔(P<0.01),而LDH-AmRNA的表达量没有差异(P>0.05);(2)高原鼠兔肝脏中PC、LDH-A和LDH-BmRNA的表达量都极显著高于高原鼢鼠(P<0.01);(3)高原鼠兔肝脏和骨骼肌中LDH和乳酸含量以及肝脏中PC活力均极显著高于高原鼢鼠(P<0.01);(4)LDH同工酶谱显示,高原鼠兔骨骼肌以LDH-A4、LDH-A3B、LDH-A2B2为主,而高原鼢鼠骨骼肌以LDH-AB3、LDH-B4为主;在高原鼠兔肝脏中LDH以LDH-A3B,LDH-A2B2,LDH-AB3和LDH-B4为主,而高原鼢鼠肝脏只有LDH-A4。以上结果表明,高原鼠兔通过提高骨骼肌无氧糖酵解的水平为其快速奔跑提供能量,通过提高肝脏中糖异生水平快速将骨骼肌运动所产生的乳酸转化为葡萄糖和糖原,所以减少了在低氧环境中对氧的依赖,而高原鼢鼠尽管生活在低氧的地下洞道,它通过提高骨骼肌有氧糖酵解的水平,为其持续的挖掘活动提供能量。     

青藏高原5种害鼠D型肉毒素抗性相关基因VAMP1的序列分析

突触小泡相关膜蛋白1基因(VAMP1)的变异是导致鼠类对D型肉毒梭毒素灭鼠剂产生抗性的主要原因。本研究利用转录组测序的方法,分析青藏高原地区5种主要害鼠:高原鼠兔(Ochotona curzoniae)、高原鼢鼠(Eospalax baileyi)、长尾仓鼠(Cricetulus longicaudatus)、青海松田鼠(Neodon fuscus)和喜马拉雅旱獭(Marmota himalayana)的VAMP1序列信息。同时,分别采集来自5个地理种群的58只高原鼠兔和59只高原鼢鼠,对VAMP1基因第二外显子区序列进行分析。结果显示,从转录组组装文件中成功获得5种动物的VAMP1基因全序列,长度均为357 bp,共检测到46个核苷酸变异位点和4个氨基酸变异位点,但未发现与D型肉毒素抗性相关的氨基酸位点。对高原鼠兔群体和高原鼢鼠群体的VAMP1基因第二外显子序列的分析显示,高原鼠兔所有个体的序列高度保守,而在高原鼢鼠中则存在一个同义突变位点,但两物种在D型肉毒素抗性相关位点上都未监测出位点变异。该研究结果提示,D型肉毒杀鼠剂在青藏高原地区害鼠防治方面应该可以长期发挥重要作用。     

淡色库蚊ATP合酶B亚基基因克隆和序列分析及其与溴氰菊酯抗性的关系

【目的】克隆淡色库蚊Culex pipiens pallens ATP合酶B亚基基因编码区序列,并进行生物信息学分析,研究其与溴氰菊酯抗性关系。【方法】通过PCR方法扩增ATP合酶B亚基基因编码区序列;利用生物信息学网站在线分析工具,预测ATP合酶B亚基基因编码蛋白的理化性质和功能特征;通过实时定量PCR方法比较ATP合酶B亚基基因在室内筛选的淡色库蚊溴氰菊酯敏感品系和抗性品系中的表达,并在现场种群溴氰菊酯敏感和抗性个体中做进一步验证。【结果】成功克隆淡色库蚊ATP合酶B亚基基因编码区序列(Gen Bank登录号:KY783434),长717 bp,编码238个氨基酸。生物信息学分析表明,其编码蛋白理论相对分子量为26.96 k D,等电点为8.97,在第70-231位氨基酸具有ATP合酶B亚基结构域,未发现信号肽和跨膜区。实时定量PCR结果显示,ATP合酶B亚基基因在室内筛选的淡色库蚊抗溴氰菊酯品系和现场种群溴氰菊酯抗性个体中表达量均上调。【结论】本研究获得了淡色库蚊ATP合酶B亚基基因编码区序列,进行了生物信息学分析,并证实其在溴氰菊酯抗性个体中高表达,为进一步研究该基因在蚊抗药性中的作用奠定了基础。     

高原鼠兔低氧诱导因子-1α蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备

高原鼠兔生活在青藏高原海拔3 000～5 000 m的区域,具有极强的低温、低氧耐受能力.低氧诱导因子-1(HIF-1)是一种由HIF-1α和HIF-1β组成的异源二聚体转录因子,在生物体的低氧适应性调节中起着关键作用.低氧主要通过调节HIF-1α蛋白水平来影响HIF-1α的转录活性.本研究用DNA重组技术将高原鼠兔HIF-1α(pHIF-1α)(538/822)编码基因序列亚克隆至原核表达载体PGEX- 4T-1中,并在大肠杆菌BL21菌株中进行高效诱导表达,获得可溶性表达产物.将纯化后的GST-pHIF-1α(538/822)融合蛋白作为免疫原免疫家兔制备多克隆抗体.免疫印迹结果表明,制备的抗体能够识别高原鼠兔HIF-1α蛋白.进一步利用亲和纯化的方法对此多克隆抗体进行了纯化.免疫印迹和免疫染色的结果表明,纯化的抗体可以用于检测外源以及内源的高原鼠兔HIF-1α蛋白的表达和定位,为后续的研究提供了重要的实验材料.     

牦牛Endothelin-1基因CDS序列克隆及其真核表达质粒构建

Endothelin-1主要通过促进血管平滑肌细胞增殖引起血管结构和功能的改变,从而刺激血管收缩,Endothelin-1在动物血管生成和低氧适应等关键发育和生理过程发挥重要的作用。为了进一步探讨高原动物脑Endothelin-1对其极端低氧适应调控的分子机理,本研究对牦牛(Bos grunniens)脑Endothelin-1基因CDS全长序列进行了克隆及其真核表达载体的构建。结果表明,牦牛Endothelin-1基因的CDS全长序列含有一个609bp的开放阅读框,编码202个氨基酸,该蛋白分子量为22.98 kDa,理论等电点（pI）为9.63;成功构建出带有CMV启动子,绿色荧光蛋白标记的牦牛Endothelin-1真核表达质粒pEGFP-C1-Endothelin-1;牦牛Endothelin-1基因CDS全长序列编码的氨基酸序列与黄牛(Bos taurus)、藏羚羊（Pantholop shodgsoni）、绵羊(Ovis aries)、野猪(Sus scrofa)、小鼠(Mus musculus)、人(Homo sapiens)的同源性分别为100%、95%、93%、81%、77%、70%;且该氨基酸序列的系统进化情况与其亲缘关系远近一致。因此,我们认为高原动物牦牛Endothelin-1的结构和功能在进化上均具有高度保守性,其在低氧适应中的作用可能是通过表达差异或转录后修饰实现的,且本研究构建的真核表达质粒为进一步探讨该基因在青藏高原动物脑对极端低氧生境适应中的生物学功能及其调控机理提供了支持。     

高原鼢鼠的学习记忆能力与其脑组织中foxP2基因的高表达有关(英文)

高原鼢鼠(Myospalax baileyi)终生营地下洞道生活,具有较强的学习记忆能力和定位洞道中障碍物的能力。叉头框蛋白P2(forkhead box p2,FOXP2)是一种与口面部协调、运动协调功能有关,并且与学习记忆、以及定位功能有密切联系的转录因子。为了研究和探讨foxP2基因与高原鼢鼠发达的学习记忆能力之间的关系,我们克隆了高原鼢鼠foxP2基因的编码区序列;以地面动物高原鼠兔为对照,应用real-time PCR和Western blot分别测定高原鼢鼠脑组织中foxP2 mRNA和FOXP2蛋白的表达水平;应用免疫组织化学法检测FOXP2蛋白在高原鼢鼠脑组织不同区域中的表达。结果显示:(1)与其它哺乳类动物相比,高原鼢鼠foxP2编码区序列相对保守,但其编码的氨基酸序列显示存在两个特殊的氨基酸残基突变;(2)高原鼢鼠foxP2mRNA的表达量极显著高于高原鼠兔(P0.01);(3)高原鼢鼠FOXP2蛋白的表达量极显著高于高原鼠兔(P0.01);(4)FOXP2蛋白在高原鼢鼠脑组织不同区域均有表达,其中以大脑皮层、丘脑和纹状体区域表达量较高。本研究结果提示,高原鼢鼠发达的学习记忆能力与foxp2基因在脑组织中的高表达有着密切的联系。     

高原鼢鼠肺组织细胞凋亡相关 基因的进化分析及其在不同 海拔条件下的表达模式

高原鼢鼠（Myospalax baileyi）是青藏高原特有的地下鼠,其地下洞道严重缺氧。一般来说,低氧会促进细胞凋亡。为了探讨高原鼢鼠适应低氧环境的分子机制,本文应用生物信息学方法对p53下游凋亡促进基因Pidd、Fas、Bax、Puma、Apaf-1、Scotin、Perp、Igfbp3和凋亡抑制基因Bcl-2的序列和编码的氨基酸序列进行了进化分析,并以SD大鼠（Rattus norvegicus）为对照,研究了这些基因在不同海拔环境条件下（3 300 m和2 260 m）的表达模式。结果表明：（1）高原鼢鼠细胞凋亡基因的序列与以色列鼹鼠（Nannospalax galili）同源性最高;预测的PIDD、PUMA、Apaf-1、IGFBP3和BCL-2编码蛋白结构域与以色列鼹鼠的存在明显的趋同进化位点;SIFT评估发现,高原鼢鼠和以色列鼹鼠与其他物种相比,p53、PIDD、PUMA、Apaf-1和IGFBP3氨基酸序列分别在78、853、157、320和285号位点的变异对其功能有显著影响;（2）在高海拔条件下（3 300 m）,高原鼢鼠肺组织中凋亡促进基因Pidd、Bax、Puma和Apaf-1表达水平显著下降,凋亡抑制基因Bcl-2表达水平显著升高,而在SD大鼠中凋亡促进基因和凋亡抑制基因的表达水平均没有变化;高原鼢鼠中Bcl-2/Bax比值随海拔的升高显著上升,而在SD大鼠中没有变化。以上结果提示,高原鼢鼠p53结构变异可能导致其下游基因表达模式与SD大鼠不同,其中凋亡促进基因Pidd、Bax、Puma和Apaf-1表达水平下降,凋亡抑制基因Bcl-2表达水平上升,从而抑制了细胞在低氧条件下的凋亡;在长期低氧的作用下,高原鼢鼠p53下游基因产物PIDD、PUMA、Apaf-1和IGFBP3产生了影响其功能的变异位点,这可能改变了它们与发挥功能的复合物的结合力,从而抑制了细胞凋亡。因此,通过长期的低氧适应,高原鼢鼠肺组织中与细胞凋亡相关的基因产物结构发生变异,导致其基因表达水平发生变化,从而抑制细胞凋亡,这是高原鼢鼠适应地下低氧洞道生境的分子机制之一。     

牦牛AQP4基因CDS序列的克隆及其生物信息学特征分析

为了研究高原动物对青藏高原高寒、低氧等极端生境的适应机理,进一步探讨高原动物对高原反应——高原脑水肿抗性的分子机理,运用基因克隆与生物信息学相关技术和方法,对牦牛脑AQP4(水通道蛋白4,AQP4)基因CDS全长序列进行克隆、基因序列比对及其生物信息学特征分析。结果表明,牦牛AQP4的CDS含有一个966 bp的开放阅读框,编码322个氨基酸;牦牛AQP4基因编码蛋白分子量34.69 k D,理论等电点(p I)7.59,其编码蛋白含有6次跨膜结构,属于疏水性蛋白;二级结构主要由α-螺旋、延伸及无规则卷曲构成;AQP4基因编码产物氨基酸同源性及系统进化分析发现,牦牛AQP4基因编码氨基酸序列与黄牛、绵羊等物种间同源性较高,系统进化情况与其亲缘关系远近一致。     

藏羚羊肌红蛋白(MGB)基因编码区的克隆与分析

为了探讨藏羚羊低氧适应的分子生物学机制,从藏羚羊(Pantholops hodgsonii)骨骼肌组织中提取总RNA,通过逆转录聚合酶联反应(RT-PCR)技术扩增出MGB基因编码区cDNA片段,并与pGEM-T Easy载体连接构建重组质粒,转化DH5α菌。扩增培养后鉴定阳性质粒并进行序列测定,结果与NCBI数据库进行比较。结果显示,MGB基因编码区由465bp组成,编码154个氨基酸。其序列与绵羊、牛、猪、人、小鼠、大鼠的同源性分别是98%、97%、90%、86%、82%、81%。推测出的氨基酸序列与绵羊、牛有98%同源性,而与猪、人、小鼠及大鼠分别有89%、85%、80%、79%的同源性。与NCBI数据库登录的绵羊的MGB cDNA序列比较发现,藏羚羊MGB基因的21位和78位密码子分别发生了突变(GGT→GAT和GAA→AAG),其对应的氨基酸分别由甘氨酸变为天冬氨酸及谷氨酸变为赖氨酸。至此,成功克隆出藏羚羊MGB基因编码区,为进一步揭示藏羚羊低氧适应的分子机制打下基础。     

高原鼠兔肝中Ldh-c基因的表达及其对无氧糖酵解水平的影响

高原鼠兔(Ochotona curzoniac)对高原低氧环境有很强的适应性。我们研究发现,精子特异性乳酸脱氢酶(LDH-C4)在高原鼠兔肝组织中表达。为了阐明LDH-C4对高原鼠兔肝组织无氧糖酵解水平的影响,将20只高原鼠兔随机分为抑制剂组和空白对照组,每组10只。抑制剂组注射1 mol/L LDH-C4特异性抑制剂N-异丙基草氨酸盐(N-isopropyl oxamate)于高原鼠兔股二头肌,双侧各注射500μl,空白对照组注射等剂量的0.9%生理盐水。应用荧光定量PCR和western blot方法,测定了精子特异性乳酸脱氢酶基因(Ldh-c)在高原鼠兔肝组织中的表达水平,应用高压液相色谱法测定了血液中抑制剂的浓度,用生物化学方法测定了抑制剂组和空白对照组高原鼠兔肝组织中乳酸脱氢酶(LDH)比活力以及乳酸(LD)和ATP含量。结果表明,在m RNA和蛋白水平,Ldh-c基因在高原鼠兔肝组织中均有表达,m RNA相对表达水平为0.22±0.04,蛋白相对表达水平为0.97±0.20;当肌肉注射1 mol/L的抑制剂30 min后,血液中抑制剂浓度为0.08 mmol/L,肝组织中乳酸脱氢酶比活力抑制剂组和空白对照组分别为(4 990±290)U/g和(7 360±420)U/g,抑制剂组和空白对照组乳酸含量分别为(0.38±0.05)mmol/g和(0.53±0.03)mmol/g,抑制剂组和空白对照组ATP含量分别为(5.84±0.83)μmol/g和(7.78±1.06)μmol/g,经单因素方差分析,抑制剂组的乳酸脱氢酶比活力和乳酸及ATP含量均显著下降(P0.01);抑制剂对乳酸脱氢酶比活力和乳酸及ATP含量的抑制率分别为30.19%±3.90%、32.22%±8.70%和24.94%±7.80%。以上结果说明,Ldh-c在高原鼠兔肝组织中表达,LDH-C4通过催化无氧糖酵解过程,为其肝组织生命活动提供至少24%的ATP,这可能使高原鼠兔减小了在低氧环境中对氧气的依赖,增强了对低氧环境的适应力。     

常氧下高原鼠兔HIF-1αmRNA的表达

低氧诱导因子—1(HIF—1)是一种由低氧诱导因子—1α(HIF—1α)和芳香烃核受体转录因子(ARNT)组成的二聚体转录因子,在生物体氧平衡调节中起关键作用。高原鼠兔(Dchotorua curzoniae)是生活在青藏高原海拔3000m以上区域,有着极强的低氧、低温耐受能力的特有自然种群。它通过高的基础代谢率和高的氧利用率来适应高原低温、缺氧环境。将高原鼠兔带到北京,常氧室温条件下适应7d。RT—PCR扩增高原鼠兔HIF—1α cDNA片断,^32P标记作为特异性探针,Northern杂交检测了常氧条件下高原鼠兔HIF—1α的组织特异性表达。结果显示,HIF—1α mRNA在高原鼠兔多种组织中均有表达,并且表现出明显的组织差异性。其中脑的表达量最大,肾其次,心、脾和肝的表达相对较少。