真养产碱菌利用高果糖浆积累聚β-羟基丁酸的研究

真养产碱菌(Alcaligenes eutrophus)H16能以果糖为碳源在无机合成培养基上积累聚p-羟基丁酸(PHB)。将该菌用富含果糖的高果糖浆(HFS)培养,PHB的积累可达到果糖发酵水平,但发现高浓度的果糖和葡萄糖对菌体生长及PHB积累有抑制作用。采用补料分批培养技术可降低果糖和葡萄糖的抑制。并可大幅度提高产量,菌体干重达16—20g/L,PHB产量7.0—7.6g/L,PHB的产率达0.24g/g果糖。     

利用基因工程菌VG1(pTU14)产聚β-羟基丁酸酯的研究

本文对透明颤菌血红蛋白基因(vgb)和λ噬菌体裂解基 因(SＲＲz)在不同宿主大肠杆菌中的外源表达及其在聚β羟基丁酸酯(PHB)生产中的应用进行了研究。实验结果表明,同时携带vgb、SＲＲz和phbCAB三种基因的产PHB基因工程菌VG1(pTU14),经过82h的摇瓶补料分批培养,菌体浓度可以高达25.9g/L,PHB百分含量则可在52h时达到95%以上;此外,该菌株不仅可以实现摇瓶高密度发 酵培养和PHB产品的大量积累,还可以同时实现菌体细胞的可诱导裂解破壁,因此是一株具有潜在工业应用价值的多功能PHB生产菌株。     

透明颤菌血红蛋白基因在产PHB重组大肠杆菌中的引入

将透明颤菌血红蛋白基因 (vgb)采用插入染色体的方式引入产聚 β 羟基丁酸酯(PHB)重组大肠杆菌VG1 (pTU1 4)中 ,以从分子水平上提高克隆菌对氧的利用率 ,解决PHB发酵生产过程中的供氧矛盾 ,透明颤菌血红蛋白的一氧化碳差光谱分析明表 ,vgb基因可以在VG1 (pTU1 4)中成功表达 ,且其表达量受溶氧水平的调控。Vgb基因的引入可以同时促进菌体生长和PHB产品的积累 ,且溶氧水平越低 ,VHB表达量越高 ,这种促进作用就越明显     

真养产碱杆菌积聚-β-羟基丁酸发酵条件的研究

igenes eutrophus培养过程的研究表明,氮源的限制或缺乏可刺激细胞大量积累聚-β-羟基丁酸(PHB),但PHB合成期氮源的完全缺乏,会导致细胞的PHB合成速率迅速下降;氧的限制也可刺激A.eutrophus合成PHB,但胞内PHB的积累量远小于氮源控制下的情况。在细胞的不同生长期限制氮源的供应会明显影响PHB的发酵过程,当残留菌体浓度达到20g/L至30g/L时停止流加氨水,可以得到较好的发酵水平,细胞干重,PHB含量和PHB浓度可分别达到61.9g/L、80.5%和49.0g/L。     

真养产碱菌由丁酸积累聚β-羟基丁酸的研究

真养产碱菌(Alcaligenes eutrophus)H16(ATCC 17699)能以丁酸为唯一碳源在无氮合成培养基中积累大量生物可降解的聚β-羟基丁酸(PHS)。将此菌在丰富培养基中预培养36小时后转入无氮合成培养基甲,在30℃、pH8．0条件下培养48小时,积累的PHB可达细胞干重的63％(w／w)。较高浓度的丁酸对PHB的积累有抑制作用。采用丁酸自动流加法控制pH值的工艺可降低丁酸的抑制作用。此时PHB的产率达0．4g/g丁酸,PHB比产生率60)达0．1g·g生物量-1·h—-1。     

真养产碱杆菌聚羟基烷酸合成酶基因在欧文氏菌中的表达

将含有真养产碱杆菌(Alcaligenes eutrophus)合成聚羟基烷酸(PHA)基因(phaCA3)的质粒pTZl8U—PHB改造成为具有卡那霉素抗性的质粒pJMCl．并以电击法将pJMCl引入利用碳源广泛的胡罗卜软腐欧文氏茵(Erwinia carotovora)非致病菌系(Eccl3B)中,phaCAB可获得高效表达,膨大的转基因菌[Eccl3B(pJMCl)]细胞内几乎充满PHA颗粒。以蔗糖为碳源,初步在5L发酵罐中对转基因菌进行分批补料培养35h,菌体干重达28g／L,PHA占菌体干重的68％,具有生产潜力。将该菌合成的PHA提取纯化(纯度达99％)后,进行核磁共振分析,发现它只有单一的聚-β-羟基丁酸(PHB)组分。     

一株新型高产PHB假单胞菌SCH17的分离和特征分析

通过丁醇富集筛选,从土壤样品中筛选到一株菌株SCH17。经过生理特性和16S rRNA分析,鉴定菌株SCH17属于假单胞菌属。透射电镜显示该菌细胞内聚集了大量颗粒状物质,经过氯仿抽提和核磁共振分析,确认这些颗粒物质是聚β-羟基丁酸(PHB)。通过对碳源和氮源的优化,得到最佳积累PHB的碳源是果糖,氮源是蛋白胨。在该培养基中仅需发酵14 h,菌体干重和PHB含量均达到最大,分别为3.52 g/L和2.69 g/L,PHB含量高达细胞干重的76%。     

Acetobacter xylinum NUST4合成细菌纤维素发酵条件的优化

采用均匀设计法优化了Acetobacter xylinumNUST4的基础培养基,向其中添加了Mg²⁺、Fe²⁺、对氨基苯甲酸、烟酸、生物素、乙醇,优化后的发酵培养基组成为:葡萄糖24g,蔗糖22g,蛋白胨16g,醋酸2.4mL,磷酸氢二钠3.5g,磷酸二氢钾1g,硫酸镁6g,硫酸亚铁0.015g,烟酸0.003g,生物素0.02g和乙醇20mL,纤维素产量达9.87g,定容至1L,比由S-H培养基发酵合成的纤维素产量(仅0.74g.L^-     

培养条件对头孢霉菌丝体脂肪酸组分的影响

研究了头孢霉(Cephalosporium sp.)菌丝体最大生产力和多不饱和脂肪酸形成积累的条件。菌丝体最适培养条件为：麦芽糖60g/L\,KNO33g/L、起始pH为60、500mL三角瓶装100mL培养基、接种25%、25℃培养10d则菌丝体达到最大干重。多不饱和脂肪酸形成积累的最适条件为：葡萄糖10～20g/L、(NH4)2SO4或NH4Cl 3g/L、培养基起始pH为40、500mL三角瓶装100mL培养基、接种10%～20%、10℃下照光培养。〖JP2〗因此,在整个生产流程中可采用不同条件分段掌握的技术原则。同时提出在多不饱和脂肪酸的形成和积累途径中油酸(18∶1)向亚油酸(18∶2)的转化是关键,为进一步探索最适培养条件和关键酶的调节提供依据。     

碱性β-甘露聚糖酶发酵工艺的研究

本文报道碱性β-甘露聚糖酶16L罐的发酵工艺。在发酵过程中,通气量影响菌体生长,最适通气量为1:0.75—1:1.0vvm。搅拌速度影响菌体产酶,最适搅拌速度为500r/min。碳源为魔芋粉,其适宜浓度为2%。发酵周期为40小时。发酵液中β-甘露聚糖酶的酶活力达300u/ml,比摇床上培养提高了2倍。     

氮源流加对Alcaligenes eutrophus积累聚β-羟基丁酸的影响

以真养产碱杆菌(Alcaligenes eutrophus)为 聚β羟基丁酸(PHB)的生产菌株,在分析了PHB发酵过程参数变化的基础上,进一步探讨了PHB合成期不同的硫酸铵流加速率对PHB合成的影响。研究结果表明,在PHB合成阶段,培养基中氮源的完全缺乏,导致细胞合成PHB能力的下降;在PHB合成期,不同的氮源流加速率对PHB合成过程存在着显著的影响,当流加速率较小时,尽管最终胞内PHB含量很高,但细胞干重、PHB浓度和PHB生产强度都较低。当氮源流加速率过大时,会导致最终胞内PHB含量显著下降,使PHB浓度和PHB生产强度降低。当硫酸铵流加速率在05g/h左右时,可以得到较好的发酵效果。     

E.aero高产1.3-丙二醇菌株发酵条件的研究(Ⅱ)

建立了1.3-丙二醇高产菌株(Enterobacter aerogenes简写为E.aero-N-56)1.3-PD厌氧发酵最适pH值、温度、时间、接种量分别为7.0、30℃、48h、9％;在最适发酵条件下,30L发酵罐中E.aero-N-56菌株1.3-PD产量为47.36g/L,生产率为23.68g/L·d。     

真养产碱菌利用甜菜糖蜜发酵产聚β－羟基丁酸的研究

探讨了以廉价原料甜菜糖蜜培养真养产碱菌（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓｅｕｔｒｏｐｈｕｓ）Ｈ１６生产聚β－羟基丁酸（ＰＨＢ）的可行性。对培养基优化试验表明,菌体产量可达２０ｇ／Ｌ,ＰＨＢ产量达９．８ｇ／Ｌ,糖转化率为２７．５％。用２升自控发酵罐进行验证,在良好的供氧条件和特定的ｐＨ值自控条件下发酵周期从４８小时缩短到４０－４２小时,菌体和ＰＨＢ量都有提高。菌体最高产量２６ｇ／Ｌ,ＰＨＢ最高产量１３ｇ／Ｌ,糖转化率为２０．４％。ＰＨＢ占细胞的含量,摇瓶和罐上结果都在５０％左右。     

E.aero高产13-丙二醇菌株选育及发酵培养基研究(Ⅰ)

以淡水湖泊泥土中分离出的 30 0多株肠杆菌 (Enterobacter)为出发菌株 ,利用常规筛选方法选出 2株 1 3 丙二醇产生菌 (Enterobacteraerogenes)。经UV、DES、NTG、EMS、LiCl单独及复合诱变 ,选育出一株 (E aero N 56) 1 3 PD高产突变株。通过单因素实验 ,确定了E aero N 56菌株 1 3 PD发酵培养基为 :甘油 90g L ,NH4Cl₁ 50g L     

利用重组Pichia pastoris生产腺苷甲硫氨酸

为改造甲醇利用型酵母Pichia pastoris来生产腺苷甲硫氨酸（SAM,S-adenosylL-methionine）,我们将一个带有SAM合成酶基因的胞内表达质粒转化入Pichia pastoris菌株GS115,经过G418抗性筛选得到一株有两个基因拷贝的转化子。该菌在含有甲醇和甲硫氨酸的培养基中生长5d后,其细胞内的SAM的产量比原始菌株提高了30余倍。对该菌生产SAM的培养基中的碳源与氮源进行了优化,结果显示碳源的控制对该菌SAM产量的影响很大。在试管水平,该菌在含有0.75％的L-methionine并且碳源和有机氮源经过一定程度优化的培养基中,生长6d后SAM产量达到1.58g/L。     

应用聚合酶链式反应快速特异鉴定假单胞菌和伯克霍尔德氏菌（R）-3-羟基酯酰载酯蛋白-辅酶A转酰基酶基因

聚羟基脂肪酸酯 (PHA)是一类具有广泛应用前景的可降解生物塑料。因其可以以葡萄糖等廉价底物直接发酵生产PHA而日益受到重视。目前的研究表明在积累中长链PHA的假单胞菌中 ,由phaG基因编码的（R）3 羟基酯酰载酯蛋白 辅酶A转酰基酶 (PhaG)起关键作用 ,但目前为止对该蛋白还知之甚少。通过聚合酶链式反应 (PCR)建立了一种快速、特异鉴定phaG基因的方法 ,应用该方法成功地从两株积累不同PHA的假单胞菌Pseudomonasstutzeri 1317和Pseudomonasnitroreducens 080 2中分别克隆得到phaG基因 ,并在phaG基因突变株PseudomonasputidaPHAG_N-21中表达成功。同时 ,还首次报道了从非假单胞菌菌株Burkholderiacaryophylli AS 1.274 1中鉴定得到phaG基因 ,提示PhaG介导的中长链PHA合成途径作为一种通用的代谢模式在细菌中广泛存在 ,为进一步实现从廉价的非相关底物合成中长链PHA提供了必要的分子生物学基础。     

菜豆重金属响应基因PvSR2在烟草中的表达及镉抗性分析

重金属特异诱导基因PvSR2(Phaseolus vulgaris stress-related)是从法国菜豆中克隆出来的, 为了研究该蛋白能否提高植物的抗重金属能力, 将PvSR2基因插入到植物转化中间载体pCAMBIA2301中CaMV 35S启动子的下游, 用根癌农杆菌介导的叶盘法将其导入烟草中, 在含有100 mg/L Kan的MS培养基上筛选, 获得了转基因植株. PCR和Southern杂交结果表明PvSR2已整合在烟草基因组中, GUS和Northern分析表明PvSR2在转基因烟草中获得表达. 重金属抗性实验表明: 与野生型烟草相比, PvSR2转基因烟草具有较高的抗重金属镉(Cd)的能力. 组织Cd含量分析显示: 在低浓度Cd (0.5~0.75 mmol/L)处理时, Cd在PvSR2转基因烟草与野生型烟草根中的累积量没有明显的差别, 而在高浓度Cd(0.1 mmol/L)胁迫下, 转基因烟草根中Cd的累积量低于野生型烟草, 说明PvSR2的表达能够提高植物的抗重金属能力, 同时表明PvSR2可能与重金属在植物中的运输和积累有一定关系.     

hprK 基因敲除及对其枯草芽孢杆菌核黄素发酵的影响

枯草芽孢杆菌在葡萄糖丰富的环境中,胞内糖分解代谢物浓度的提高将引起碳分解代谢物阻遏效应（CCR）及糖吸收 的抑制,对核黄素等发酵过程产生不利影响。通过缺陷细胞的分解代谢物控制蛋白A（CcpA）可以解除CCR效应,但不能解除糖吸收的抑制。磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸转移酶系统（PTS）是枯草芽孢杆菌主要的糖吸收方式,HPr蛋白和双功能的HPr激酶/HPr-Ser46-P 磷酸酶（HprK/P）参与PTS系统的调控。在葡萄糖丰富的条件下,K96SRQ 的激酶活性受1,6二磷酸果糖激活,催化HPr蛋白46位丝氨酸残基磷酸化,形成HPr-Ser46-P.HPr-Ser46-P抑制某些碳源透过酶基因的表达;同时HPr-Ser46-P难以被酶I在His15磷酸化,不能在PTS系统中发挥转移磷酸基团的作用,使细胞的糖吸收受到抑制。在CcpA缺陷的背景下,敲除核黄素生产菌株B.subtilis24Al/Pmx45 的HprK/P 编码基因hprK,构建了CcpA和HprK/P双缺陷的重组菌B.subtilisZHc/Pmx45.摇瓶发酵显示,B.subtilisZHc/Pmx45核黄素发酵的最适葡萄糖浓度由24Al/Pmx45的8%提高到10%;核黄素产量达到4.374mg/Ml,比24Al/Pmx45提高了19.2%。结果表明,CcpA和HprK/P的双缺陷可有效解除高浓度葡萄糖所引起的CCR效 应和糖吸收抑制,有助于提高细胞对葡萄糖的耐受力,并提高核黄素产量。     

球形红杆菌积累聚β-羟基链烷酸(PHA)的研究

通过对球形红杆菌(Rhodobacter sphaeroides)生长和积累聚卢-羟基链烷酸(PHA)条件的研究,确定采用两段培养法提高PHA的产量。第一阶段提供适合菌体生长的条件:以葡萄糖作碳源,尿素为氮源,光照微好氧培养。第二阶段则提供使菌体积累PHA的条件:补加乙酸钠厌氧光照培养。经两段培养后菌体PHA含量可占细胞干重的45％,PHA产量每升发酵液可达1.7g。     

利用基因工程菌VG1(pTU14)产聚β-羟基丁酸酯的研究

本文对透明颤菌血红蛋白基因 (vgb)和λ噬菌体裂解基因 (S RRz)在不同宿主大肠杆菌中的外源表达及其在聚β 羟基丁酸酯 (PHB)生产中的应用进行了研究。实验结果表明 ,同时携带vgb、S RRz和 phbCAB三种基因的产PHB基因工程菌VG1 ( pTU1 4) ,经过 82h的摇瓶补料分批培养 ,菌体浓度可以高达 2 5 9g/L ,PHB百分含量则可在 52h时达到 95%以上 ;此外 ,该菌株不仅可以实现摇瓶高密度发酵培养和PHB产品的大量积累 ,还可以同时实现菌体细胞的可诱导裂解破壁 ,因此是一株具有潜在工业应用价值的多功能PHB生产菌株。