脑红蛋白在胶质瘤中表达的研究进展

脑红蛋白(neuroglobin,NGB)是2000年Burmester发现的神经系统特异的携氧蛋白,广泛分布于人和动物组织器官中,主要在脊椎动物脑组织高度表达。目前研究认为,NGB在脑缺血缺氧状态下对神经元保护起着重要作用,缺氧能够诱导NGB的表达,而高表达的NGB则能够保护神经元免受缺氧损伤,从而在神经系统缺氧、缺血损伤中具有重要的神经保护功能,可为脑中风、新生儿窒息等缺血缺氧性神经系统病变及帕金森病、阿尔茨海默病等神经系统退行性疾病的治疗带来新的希望。NGB在肿瘤细胞缺氧微环境中的作用也开始受到关注,其在肿瘤细胞中的表达研究开始成为这一领域内的研究热点。本文就NGB的生物学结构、功能和它在神经胶质细胞瘤中分布及其在临床医学中的应用等研究进展作一综述。     

含蛋白质转导域的Ngb融合蛋白的原核表达、纯化及其生物学活性的初步研究

以SD大鼠脑组织RNA为模板,利用RT-PCR技术,将HIV-1反式激活蛋白(TAT)中具有蛋白质转导功能的9个氨基酸序列,即蛋白质转导域(PTD)基因与脑红蛋白(Ngb)基因融合,应用T-A克隆技术将融合基因与pMD19-Tsimple载体连接,经测序正确后克隆至表达载体pET28b中,转化感受态E.coli BL21(DE3)plysS,得到的转化子经IPTG诱导后获得可溶性表达,并经蛋白质印迹检测进一步鉴定.表达产物经Ni2 亲和纯化层析、脱盐后在原代培养的大鼠皮质神经元进行生物学活性检测,结果显示,TATPTD-Ngb融合蛋白可以转运入皮质神经元内,在48h内可检测到其存在,并能提高缺氧条件下皮质神经元存活率、减少缺氧诱导的皮质神经元的凋亡.这一结果为进一步研究TATPTD-Ngb的神经保护机制提供了线索,并可能为神经系统疾病尤其是脑血管疾病、神经系统退行性疾病提供一个新的治疗策略.     

大鼠脑红蛋白(NGB)可溶性原核表达和单克隆抗体制备及鉴定

脑红蛋白 (NGB)是新发现的脑特异的携氧蛋白 .为了对其功能进行深入的研究 ,应用已构建大鼠NGB基因编码区原核表达载体pGEX 4T 2 NGB转化的大肠杆菌BL2 1 ,获得可溶性表达产物 .用谷胱甘肽S 转移酶 (GST)亲和层析柱纯化后作为抗原 ,免疫Balb c小鼠 .通过传统的细胞融合方法制备了抗大鼠NGB的单克隆抗体 ,并对全部 4株单抗进行了亚类和亚型、效价和特异性鉴定 .为NGB结构与功能的深入研究提供了重要工具     

Nodal蛋白的表达、纯化及多克隆抗体制备

斑马鱼心脏发育模型中Nodal编码转录因子调节心脏的左右不对称发育,为了进一步研究Nodal信号途径在心脏发育中的调控作用和心脏疾病发生的分子机制,需要获得斑马鱼Nodal蛋白并制备其抗体.采用从斑马鱼心脏组织中提取RNA,通过反转录得到心脏组织各种表达基因的cDNA为模板,PCR扩增得到Nodal部分编码区序列,然后将其连接到pET-28a载体上获得原核表达.经酶切及测序鉴定后,转化Rosseta细菌,并用IPTG诱导表达融合蛋白,Ni-IDA凝胶柱亲和纯化,将纯化的融合蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,并用Western blotting检测抗体.获得了Nodal原核表达重组融合蛋白及高效价的特异性兔抗Nodal多克隆抗体,为Nodal功能的进一步研究奠定了基础.     

新型冠状病毒S蛋白表达、纯化及应用

[目的]克隆严重急性呼吸综合征冠状病毒2(Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2,SARS-CoV-2)刺突糖蛋白(Spike,S蛋白),纯化重组蛋白为制备鼠多克隆抗体提供免疫原,并鉴定抗体活性。[方法]依据对S蛋白的氨基酸序列解析,设计并构建了S蛋白重组质粒S713 pcDNA3.1(+)-C-6His,经酶切和测序正确后,转入中国仓鼠卵巢细胞(CHO-K1)中进行诱导表达,SDS-PAGE鉴定融合蛋白表达情况。表达产物利用Ni柱和分子筛纯化,目的蛋白混合免疫佐剂AS03免疫ICR小鼠,制备S蛋白多克隆抗体并对通过中和实验进行鉴定。[结果]成功构建重组质粒S713 pcDNA3.1(+)-C-6His,在CHO-K1细胞中S蛋白以可溶性形式表达。可溶性目的蛋白纯化后,蛋白纯度为94.4%,作为免疫原制备鼠多克隆抗体,抗体效价为1∶400,中和实验显示该多抗具有保护作用。[结论]成功诱导表达、纯化重组S蛋白并制备其多克隆抗体,为深入研究新冠病毒感染、发病机制及新型肺炎的防治奠定基础。     

胱天蛋白酶募集域蛋白9的可溶性表达及纯化

目的 制备可溶性TrxA-CARD9蛋白及其临床突变型。方法 将构建好的原核系统表达质粒转化至大肠杆菌感受态细胞后,通过不同诱导条件筛选合适的表达条件。使用精氨酸辅助目的蛋白进行非变性溶解,并通过聚乙烯亚胺和硫酸铵沉淀法去除核酸和杂蛋白,最终利用阴离子交换和肝素亲和色谱柱纯化融合蛋白。结果 成功构建表达质粒并纯化融合蛋白,酶切去除TrxA标签后通过质谱鉴定其为可溶性CARD9蛋白。结论 成功实现了全长CARD9序列在原核系统中的高可溶性表达,为研究CARD9蛋白生物结构和功能提供了基础,并为寻找治疗真菌感染的潜在靶点和治疗方法提供新思路。     

重组大肠杆菌表达水稻白叶枯病菌FtsZ蛋白

旨在通过现代分子生物学技术制备水稻白叶枯病菌FtsZ蛋白。以水稻白叶枯病菌总DNA为模板,采用巢式PCR方法扩增获得水稻白叶枯病菌fts Z基因,构建fts Z基因的表达载体p ET-22b-ftsZ,转化表达宿主E.coli BL21后,经PCR、Nde I/Xho I双酶切及测序鉴定、阳性克隆子经IPTG诱导表达,融合蛋白经镍柱纯化后,通过SDS-PAGE和Western blotting分析鉴定。结果显示,水稻白叶枯病菌ftsZ基因的重组表达载体构建成功,且阳性克隆子在IPTG的诱导下表达了Fts Z-6×His融合蛋白,并通过镍柱纯化获得了电泳纯的Fts Z-6×His融合蛋白。     

gcm蛋白的表达、纯化及多克隆抗体的制备

gcm(glial cells missing)是调控神经元细胞和神经胶质细胞相互转化的一个基因开关.在gcm功能缺损的突变体中,预期的神经胶质细胞发育成神经元细胞;而在gcm过表达的突变体中,预期的神经元细胞转化为神经胶质细胞.此外,gcm还调控血浆细胞发育.为了进一步研究gcm在发育中的功能,需要获得gcm蛋白并制备其抗体.根据已报道的gcm基因序列,以果蝇cDNA文库为模板进行PCR扩增得到gcm部分编码区序列,然后将其连接到pET-28a载体以获得原核表达载体.重组载体经酶切测序鉴定确认后,转化大肠杆菌(E.coli)BL21,并用IPTG诱导融合蛋白表达.采用Ni-IDA凝胶柱亲和纯化蛋白,将纯化的His-gcm融合蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,并用Western Blot检测抗体效价.获得的gcm原核表达重组融合蛋白及高效价的特异性兔抗gcm多克隆抗体,为gcm功能的进一步研究奠定了基础.     

拟南芥中柯浩体蛋白Atcoilin的克隆、表达及纯化

旨在制备柯浩体的标志蛋白——Atcoilin蛋白,利用pET-28a与目的基因构建重组表达质粒,经DNA测序证实插入序列与设计完全一致后,将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG进行诱导表达,产物用SDS-PAGE及Western blotting分析鉴定。通过分别改变IPTG的浓度、培养时间、培养温度等来优化Atcoilin蛋白的表达条件。表达出的重组蛋白经过镍柱、分子筛进行纯化。结果显示,原核表达载体pET28a-At1g13030成功构建,可在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,得到相应的重组蛋白经Western blotting鉴定正确。在IPTG浓度为0.7 mmol/L,18℃培养20 h的条件下,目的蛋白表达量最高。经过SDS-PAGE分析鉴定,过镍柱、分子筛后得到的重组蛋白纯度较高。     

果蝇心脏发育标记基因lbe的多克隆抗体制备

lbe是已经证明的心脏标记基因。为了深入研究lbe在心脏发育中的功能,需要获得lbe蛋白并制备其抗体。首先提取野生型成体果蝇的总RNA,反转录获得其cDNA文库,通过PCR克隆出lbe编码区序列,将其连接到pET-28a原核表达载体上。经酶切及测序鉴定后,质粒构建成功。将重组质粒（pET-28a-lbe）转化大肠杆菌菌株Rosseta,用IPTG诱导表达出融合蛋白,经Ni-IDA凝胶柱纯化后,最后将纯化的融合蛋白免疫新西兰大白兔制备lbe多克隆抗体,并用Western blotting检测抗体的效价和特异性。结果显示获得了lbe原核表达重组融合蛋白及高效价的特异性兔抗lbe多克隆抗体,为lbe功能的进一步研究奠定了基础。     

大鼠脑红蛋白基因编码区的克隆、多态性分析及该基因组织表达谱研究

参考人和小鼠脑红蛋白（Neuroglobin,NGB)的cDNA序列设计简并引物,用RT－PCR方法从大鼠脑组织中扩增出大鼠NGB基因编码区的cDNA序列,该序列与小鼠NGB基因编码区的序列同尖性为96％,与人NGB基因编码区的序列同源性为88％,进一步分析表明,大鼠NGB基因编码区存在多个多态性位点;113t/c[138P],133a/g[N45D],388a/g[R130G],417t/c.该序列已被GenBank接受,登录号为AF333245,RT－PCR分析表明,该基因在大鼠脑,肝,肾,心肌和骨骼肌中均有较高水平表达,提示了其功能上的重要性。     

脑红蛋白与Na^＋，K^＋-ATP酶β2亚基的相互作用及作用位点的鉴定

为研究神经系统特异性携氧蛋白———脑红蛋白 (NGB)保护神经元耐受缺氧损伤的分子机制 ,利用酵母双杂交系统从人胎脑cDNA文库中筛选与其有相互作用的蛋白质。序列分析表明 ,其中一个克隆的编码产物与Na ,K ATP酶 β2亚基 (NKA1b2 )序列一致。随后采用PCR方法从人胎脑cDNA文库中扩增获得NKA1b2全长cDNA。蛋白质结合实验表明 ,原核表达的NGB与体外转录翻译得到的NKA1b2在细胞外有结合作用。免疫共沉淀实验证明二者在生理条件下能够以复合物的形式存在。利用NGB系列短截体研究相互作用的位点发现 ,NGB蛋白N末端 1～ 75位氨基酸可与NKA1b2结合 ,但结合力很弱 ,而其C末端 75个氨基酸则与NKA1b2无结合作用 ,由此推测NGB蛋白整体的三维结构是结合所必需的。     

Identification and characterization of putative tumor suppressor NGB, a GTP-binding protein that interacts with the neurofibromatosis 2 protein

Mutations of the neurofibromatosis 2 (NF2) tumor suppressor gene have frequently been detected not only in schwannomas and other central nervous system tumors of NF2 patients but also in their sporadic counterparts and malignant tumors unrelated to the NF2 syndrome such as malignant mesothelioma, indicating a broader role for the NF2 gene in human tumorigenesis. However, the mechanisms by which the NF2 product, merlin or schwannomin, is regulated and controls cell proliferation remain elusive. Here, we identify a novel GTP-binding protein, dubbed NGB (referring to NF2-associated GTP binding protein), which binds to merlin. NGB is highly conserved between Saccharomyces cerevisiae, Caenorhabditis elegans, and human cells, and its GTP-binding region is very similar to those found in R-ras and Rap2. However, ectopic expression of NGB inhibits cell growth, cell aggregation, and tumorigenicity in tumorigenic schwanomma cells. Down-regulation and infrequent mutation of NGB were detected in human glioma cell lines and primary tumors. The interaction of NGB with merlin impairs the turnover of merlin, yet merlin does not affect the GTPase nor GTP-binding activity of NGB. Finally, the tumor suppressor functions of NGB require merlin and are linked to its ability to suppress cyclin D1 expression. Collectively, these findings indicate that NGB is a tumor suppressor that regulates and requires merlin to suppress cell proliferation.     

EPR investigation of the role of B10 phenylalanine in neuroglobin - evidence that B10Phe mediates structural changes in the heme region upon disulfide-bridge formation

The function of neuroglobin, a member of the vertebrate globin family, is still unknown. In human neuroglobin (NGB), the formation of a disulfide bridge between the CysCD7 and CysD5 is known to affect the heme environment and its ligand-binding kinetics. Here, we show by means of EPR that the PheB10 residue plays a key role in transmitting the structural information from the disulfide bridge to the heme-pocket region. While formation of a disulfide bridge in ferric wild-type NGB leads to a considerable change of its EPR parameters, only minor changes are observed in the case of ferric PheB10Leu NGB. Furthermore, wild-type NGB is found to be much more stable in the presence of H₂O₂ than its PheB10Leu or its HisE7Leu mutants. While tyrosyl radicals are induced in HisE7Leu NGB by the addition of H₂O₂, this is not the case for wild-type and PheB10Leu NGB. The results will be discussed in terms of the protein's putative functions.     

大鼠脑红蛋白(NGB)的原核表达、抗体制备及其细胞分布

脑红蛋白 (NGB)是新发现的与脑内氧供应密切相关的分子 .为了检测细胞内脑红蛋白的表达、亚细胞分布从而对该分子进行深入的功能研究 ,成功地将大鼠脑红蛋白基因编码区构建于原核表达载体pGEX 4T 2 ,转化大肠杆菌BL2 1(DE3) ,获得融合表达产物 .对含有融合蛋白的包含体进行溶解和复性 ,用谷胱甘肽S 转移酶 (GST)亲和层析柱纯化 ,通过免疫家兔获得了兔源性抗NGB多克隆抗体 .采用Western印迹分析技术 ,用该抗体检测NGB基因的真核表达产物 ,证明该抗体有较好的针对NGB蛋白的专一性 ,可用于对NGB的结构和功能研究 .同时 ,用该抗体进行免疫组化分析发现 ,正常成年大鼠神经系统中有较多的NGB免疫反应阳性细胞分布 ,提示NGB是与神经系统功能密切相关的重要分子     

免疫组织化学方法检测脑红蛋白在大鼠中枢神经系统的分布

目的 探讨脑红蛋白（NGB）基因在中枢神经系统中的分布。方法 用免疫组织化学ABC法研究了NGB蛋白在成年大鼠脑内的分布和定位。结果 NGB蛋白在成年大鼠脑中有非常广泛的表达。其分布区域包括大脑皮质,海马,丘脑和下丘脑的部分核团,脑桥及小脑,NGB免疫反应阳性物质定位于神经元的细胞质。结论 NGB蛋白在大鼠脑中有非常广泛的表达,提示NGB基因在中枢神经系统的功能活动中可能起重要作用。     

NAS Grid Benchmarks: A Tool for Grid Space Exploration

We present a benchmark suite for computational Grids. It is based on the NAS Parallel Benchmarks (NPB) and is called NAS Grid Benchmark (NGB) in this paper. We present NGB as a data flow graph encapsulating an instance of an NPB code in each graph node, which communicates with other nodes by sending/receiving initialization data. These nodes may be mapped to the same or different Grid machines. Like NPB, NGB specifies several different classes (problem sizes). NGB also specifies the generic Grid services sufficient for running the suite. The implementor has the freedom to choose any Grid environment. We describe a reference implementation in Java, and present some scenarios for using NGB.