PtK2细胞的核骨架—核纤层——中间纤维体系

本文用选择性系列抽提的方法结合整装细胞电镜技术和DGD包埋-去包埋超薄切片技术,在电镜下清晰地显示了PtK 2细胞的核骨架-核纤层-中间纤维体系的精细结构。处于分裂中期的细胞经抽提后可以看到,染色体残余与中间纤维仍然保持一定的联系。用免疫荧光技术对抽提后的PtK 2细胞进行分析结果表明:其中间纤维能同时与AE1和AE3反应;能与Lamin B反应的单抗可以特异地定位于其核周,而Lamin A(C)的单抗除了与其核纤层蛋白有很强的反应外还与中间纤维有交叉反应。此外,在分裂期细胞中可以看到Lamin A(C)可能与染色体能特异结合;与HeLa细胞不一样。PtK 2细胞的核骨架成份不能与280kD的核骨架蛋白单抗反应。双向电泳结果显示出PtK 2细胞的核骨架-核纤层-中间纤维体系的组成成份与HeLa细胞相比有较大的差异,而且这种差异主要反映在核骨架组份上,TdR的处理也能导致其组份发生变化。     

北京鸭B淋巴细胞的中间纤维—核纤层—核内骨架体系

以北京鸭腔上囊为实验材料,应用细胞分级抽提方法与非树脂包埋－去包埋剂的电镜制样技术相结合,显示出Ｂ细胞中相互连结的中间纤维－核纤层－核内骨架体系的超结构及其分布,中间纤维交织成网络状,纤维直径在９－１１ｎｍ,其成份是分子量为６７ｋＤ,等电点约为６．２的波形蛋白,核纤民支呈片层状结构环绕在核区周围,其主要成份是分子量为６７ｋＤ,等电点偏酸性的Ｌａｍｉｎ Ｂ。核内骨架由粗细不一的纤维形成网络结构,其上     

小鼠胚胎干细胞（ES—M13）核骨架—核纤层—中间纤维结构体系的研究

本文使用细胞的选择性抽提、ＤＧＤ包埋去包埋电镜制样、免疫荧光和免疫印迹技术研究了小鼠胚胎干细胞（ＥＳ－Ｍ１３）的核骨架－核纤层－中间纤维结构体系。在电镜下可以看到,ＥＳ细胞存在精细发达的核骨架结构,核骨架纤维同核纤层结构相连接,细胞质中有许多直径为１０ｎｍ的中间纤维单丝,细胞质中有许多直径为１０ｎｍ的中间纤维单丝,在免疫荧光分析中,使用角蛋白单克隆抗体有阳性反应,细胞质区域可以看到较强的荧光,没有     

波形蛋白、核纤层蛋白与排核关系的研究

以网织红细胞与Ｋ５６２细胞融合形成的胞质体杂种细胞Ｋ－ＲＲｎｅｏ为研究为象,对Ｖｉｍ－ｅｎｔｉｎ、Ｌａｍｉｎ蛋白与Ｋ－ＲＲｎｅｏ细胞分化排核的关系进行了研究。结果表明：随着Ｋ－ＲＲｎｅｏ细胞的分化,Ｖｉｍｅｎｔｉｎ ｍＲＮＡ、Ｌａｍｉｎ蛋白表达明显降低,与我们整装电镜观察及Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹分析所得到的结论相一致,证实了薛社普提出的Ｖｉｍｅｎｔｉｎ、Ｌａｍｉｎ蛋白在红系细胞分化排核中所起的作用,为     

四膜虫细胞的核骨架及类中间纤维

采用非树脂包埋去包埋剂超薄切片结合选择性生抽提方法显示,原生动物四膜虫细胞大核具有发达的核骨架纤维网络,核周是一层完整的核纤层结构,在四膜虫细胞小核中,亦存在核骨架和核纤层。四膜虫细胞皮层中存在水下溶性纤维网架,其中含有类中间纤维蛋白组分,４９ＫＤ蛋白。     

兔网织红细胞与K562细胞胞杂交体（K—RRneo）核基质—中间纤维体系…

本文利用脂质体转基因技术与细胞融合相结合的方法所建立的杂交细胞为研究对象,采用选择性多步抽提配合整装电镜及Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹分析等技术,系统观察了兔网织红细胞,人红白血病Ｋ５６２细胞及两者融合形成的胞质杂交体Ｋ－ＲＲｎｅｏ细胞的核基质－中间纤维体系结构,着重分析比较了它们之间的胞质波形蛋白纤维成分的变化。实验结果表明：Ｋ５６２细胞的中间纤维为放射状分布,核纤层为网层状,兔网织红细胞胞质中间纤维胞质     

四膜虫（Tetrahymena thermophila）核纤层的研究

采用非树脂包埋去包埋超薄切片电镜技术,并结合选择性生化抽提方法以及间接免疫荧光染色方法显示,在四膜虫细胞内存在典型的核纤层结构。蛋白分离纯化与免疫印迹法分析结果说明四膜虫细胞核纤层可能主要由分子量为６６ＫＤ的多肽构成。蛋白分离纯化结果表明四膜虫细胞的核纤层蛋白可能不如高等动物细胞的丰富。     

急纤虫营养细胞和休眠细胞的中间纤维-核骨架体系

利用生化分级抽提、DGD包埋—去包埋透射电镜术和SDS—PAGE凝胶电泳,研究了膜状急纤虫营养细胞和休眠细胞内中间纤维—核骨架体系的分化特征及其蛋白组成。观察到营养细胞中,位于细胞质不同区域的中间纤维形成网状,其网络的密度不同;核骨架中,核纤层位于细胞核周缘,薄层状,厚约50nm;核内骨架由较致密的纤维网络组成。休眠细胞内该结构体系依然存在,但位于细胞内不同层次的纤维网比营养细胞的同种结构要致密得多,这可能与纤毛虫脱分化时细胞大范围的收缩有关;休眠细胞的包囊壁中层壁存在相当于中间纤维的网络结构。SDS—PAGE电泳图谱显示,休眠细胞内该体系的蛋白组成发生了较明显的变化,其中保留了营养细胞的部分蛋白条带,丢失了部分条带,同时还产生了一些特异性条带。分析表明,膜状急纤虫的中间纤维—核骨架体系是细胞在营养条件下和休眠状态下都稳定存在的结构;而纤毛虫形成休眠细胞后中间纤维—核骨架体系及蛋白组成上的变化提示,细胞在休眠状态下,基因的表达水平与营养细胞是不同的。     

鼠胚成纤维细胞中间丝—核纤层—核骨架结构体系的研究

本文以１２．５天小鼠胚胎成纤维细胞为材料,使用择性抽提和整装细胞电镜制技术,显示了鼠胚成纤维细胞的中间丝－核纤层－核内架（ＩＦ－Ｌ－ＮＭ）结构体系。细胞质中有非常发达的中间丝,有的纤丝结合为束状存在,纤丝沿着核呈一定方向平行排列。细胞中也可以观察到核纤层和核骨架结构,但同胞质中间丝相比,核骨架不发达。整装细胞电镜制样使观察到的ＩＦ－Ｌ－ＮＭ更具有真实感和立体感,应用音接免疫荧光技术检测细胞内的中间     

小鼠胚胎干细胞(ES-M_(13))核骨架-核纤层-中间纤维结构体系的研究

本文使用细胞的选择性抽提、DGD包埋去包埋电镜制样、免疫荧光和免疫印迹技术研究了小鼠胚胎干细胞(ES-Ml_(13))的核骨架-核纤层-中间纤维(NM-L-IF)结构体系。在电镜下可以看到,ES细胞存在精细发达的核骨架结构,核骨架纤维同核纤层结构相连接,细胞质中有许多直径为10nm的中间纤维单丝。在免疫荧光分析中,使用角蛋白单克隆抗体有阳性反应,细胞质区域可以看到较强的荧光,没有极性分布现象,也没有观察到纤维状的荧光染色。ES细胞对波形蛋白和结蛋白抗体呈阴性反应,同对照组一样,只能看到非特异性的很微弱的荧光染色。在免疫印迹分析中,使用角蛋白单克隆抗体AF6检测到三条角蛋白多肽,分子量分别为65KD,62KD和52KD。     

特殊涡鞭毛虫—尖尾藻的核骨架

采用分级抽提,DGD包埋-去包埋剂电镜技术在特殊涡鞭毛虫——尖尾藻的细胞核内显示出了一个纤维网络结构。此网络结构不溶于CSK液和可抽去微管与微丝的溶液,不被DNase所酶解和热三氯醋酸所抽提,因而是一个非DNA性质的纤维蛋白网络结构。它的一系列形态结构特征——整个呈网络形态,纤维的粗细为2.8—24nm,与细胞质内的中间纤维有广泛的连接,含有少量对维持其结构完整性所必需的RNA成分等,都十分相似于典型真核细胞的核骨架结构,但所显示的核纤层为一层不均匀、不连续的结构,这有别于典型真核细胞的核纤层。 本工作首次证实了特殊涡鞭毛虫——尖尾藻已进化产生了核骨架结构,且与典型真核细胞的核骨架在形态结构上已很接近。     

植物细胞中NuMA类似蛋白的分布及其在细胞周期中的变化

免疫荧光染色结果说明植物细胞核内含有与抗动物ＮｕＭＡ多抗呈阳性交叉反应的多肽。选择性抽提并结合免疫荧光染色结果说明这种多肽位于核基质纤维蛋白网络上。免疫印迹反应显示胡萝卜（ＤａｕｃｕｓｃａｒｏｔａＬ．）悬浮培养细胞核基质蛋白与抗动物ＮｕＭＡ蛋白多抗的阳性反应条带为７４ｋＤ和７６ｋＤ。有丝分裂各期免疫荧光染色的结果表明植物细胞中的ＮｕＭＡ类似蛋白在有丝分裂过程中呈现有规律的变化。结合选择性抽提的有丝分裂各期的免疫荧光染色的结果表明核基质在此过程中也发生明显变化。应用选择性抽提并结合ＤＧＤ包埋去包埋电镜技术对植物细胞间期及有丝分裂期核基质的形态结构进行了观察。结果显示胡萝卜悬浮培养细胞间期核内存在一个非染色质性的纤维蛋白网络体系,而在正处于分裂的细胞中则未观察到。以上结果说明ＮｕＭＡ类似蛋白是核基质的组分之一并与有丝分裂密切相关。     

痘苗病毒的复制与中间纤维的关系

应用细胞选择性抽提与核酸点杂交技术业示,痘苗病毒的DNA 存在于中间纤维-核纤层-核基质组分(IF-L-NM)中。进而用DGD包埋-去包埋和电镜放射自显影技术相结合,结果表明新合成的病毒的DNA 优先结合在中间纤维上。在此基础上采用DNA 与蛋白质的体外吸附杂交实验,进一步说明痘苗病毒DNA序列与中间纤维及某些核基质蛋白质有较高的亲和性。     

免疫胶体金标记显示波形纤维与核孔复合体的结合

中间纤维与细胞核的关系是一个亟待解决解决的重要问题。本文采用火鸡红细胞作为研究材料,首先用细胞分级抽提结合免疫印迹反应显示火鸡红细胞中间纤维蛋白为波形纤维蛋白。然后,我们采用细胞分级抽提结合包埋前免疫胶体金标记的方法显示胞质中间纤维被抗波形纤维蛋白抗体－蛋白Ａ－胶体金特异标记。同时,我们显示结合于核孔复合体上的胞质纤维被抗波形纤维蛋白抗体－蛋白Ａ－胶体金所特异标记。本文结果表明,结合于核孔复合体上     

植物细胞核纤层的研究

应用细胞成分选择性抽提方法,结合非树脂包埋去包埋电镜技术显示悬浮培养的胡萝卜细胞和银杏雄性生殖细胞均具有核纤层结构,免疫印迹反应证明这两种细胞的核纤层由A型和B型核纤层蛋白组成;至少分别含有66ku,84ku和66ku,86ku多肽,免疫胶体金标记将这些蛋白定位在核周缘,光镜和电镜原位分子杂交显示植物细胞具有与动物细胞核纤层蛋白cDNA同源的序列存在;其mRNA分选的部位主要分布在靠近核膜周围的胞质部分,实验结果证明植物细胞确实存在核纤层.     

构建基因工程菌发酵产生维生素C的前体2-酮基-L-古龙酸

从棒状杆菌ＳＣＢ３０５８克隆得到两个２,５－ＤＫＧ＾＊＊还原酶基因后,构建了两个能够表达２,５－ＤＫＧ还原酶的基因工程大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ＰＥＴ９ａⅡ和ＤＨ５α（ｐＢＬ４）和一个基因工程欧文氏菌ＥＲ９７。２,５－ＤＫＧ还原酶基因分别受控于ＰＬ或Ｔ７启动子,通过加入ＩＰＴＧ或提高温度进行诱导,ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和酶活测定确定它们在诱导后得到了高表达,用细胞抽提液在加入辅酶ＮＡＤＰＨ的体外实验中转     

拟南芥细胞中存在中间纤维的研究

利用整装电镜制样与选择性抽提技术,在拟南芥（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ （Ｌ．） Ｈｅｙｎｈ） 愈伤组织细胞质中观察到直径１０ ｎｍ 左右的纤维网络结构。免疫印迹分析表明纤维的主要成分是６ 种多肽,它们分别与动物角蛋白单克隆抗体ＡＥ１ 、ＡＥ３ 有免疫交叉反应。利用间接免疫荧光技术,与ＡＥ１ 和ＡＥ３ 反应的抗原呈弥散状定位于整个细胞质中,而且１０ ｎｍ 纤维可以在体外重新组装。以上结果表明,在拟南芥细胞质中存在类角蛋白的中间纤维。以动物中间纤维基因的保守序列为引物,采用ＲＴ＿ＰＣＲ技术,进一步从这一模式植物中克隆到一个ｃＤＮＡ片段,这可能为从分子水平上证明植物中间纤维的存在提供了一个线索     

含人IL—2基因的真核表达质粒的构建及其在真核细胞…

本工作用ＰＣＲ由人的外周血单个核细胞ｃＤＮＡ中获取了带有信号肽的ＩＬ－２全ｃＤＮＡ克隆,并构建了不同的表达质粒：带有ＳＶ４０启动子的以质粒为载体的ｐＳＶＫ３－ＩＬ２和以逆转录病毒为载体的ｐＬＮ－ＩＬ２系列?ｐＬＮＣＩＬ２,ｐＬＮＳＩＬ２,ｐＬＩＬ２ＳＮ,它们分别带有ＣＭＶ、ＳＶ４０和ＬＴＲ启动子。用ＤＥＡＥ－Ｄｅｘｔｒａｎ法、ＳＡ－脂质体法和电穿孔等方法分别将这些ＩＬ－２表达质粒转染入ＣＯＳ－７及     

LFA—1／ICAM—1在ConA诱导的小鼠胸腺细胞活化中的作用

用抗ＬＦＡ－１／ＩＣＡＭ－１粘附分子单克隆抗体和ＣｏｎＡ联合刺激小鼠胸腺细胞,初步研究了该膜分子在经ＴＣＲ／ＣＤ３介导的胸腺细胞活化信号传导以及胸腺细胞亚群选择中的作用。在ＣｏｎＡ刺激系统中,抗ＡＬＦＡ－１／ＩＣＡＭ－１单抗均能抑制胸腺细胞的增殖应答,且以抗ＬＦＡ－１单抗均能抑制胸腺细胞的增殖应答,且以抗ＬＦＡ－１单抗的作用更为显著,而在ＰＡＭ加钙离子载体Ａ２３１８７刺激体系中,抗ＬＦＡ－１单抗却     

小眼虫的核骨架研究

小眼虫细胞经轻度超声处理、选择性抽提后,利用DGD包埋-去包埋剂电镜技术及Westernblot分析技术对其核骨架、核纤层进行了研究.结果显示;细胞核内存在一个不被DNase所降解和热三氯醋酸所去除的纤维蛋白性网架结构;核的周围有一层明显的核纤层结构;Westernblot分析表明其核纤层有两种阳性蛋白成分,一为相当于高等真核细胞核纤层蛋白laminB的强阳性成分,另一为相当于laminA的弱阳性成分,但无相当于laminC的成分.本文认为小眼虫这种低等的单细胞真核生物已具有了核骨架、核纤层结构,其核纤层的蛋白组成应该代表了核纤层进化历程中早期的一个阶段.