戊型肝炎病毒衣壳蛋白中和表位间的构象诱导

重组蛋白NE2包含了戊型肝炎病毒(HEV)衣壳蛋白(pORF2)的aa394～606片段.在NE2上已鉴定出了2个HEV中和表位,并获得了3个识别中和表位的单克隆抗体(MAb)8C11、13D8和8H3.这3个MAb间的交叉阻断ELISA实验发现,8C11和13D8可以彼此完全阻断,8H3对8C11和13D8均不能阻断,而8C11非但不能阻断8H3,反而显著增强了8H3与抗原的结合.用生物传感器进行的抗体与抗原结合的动力学分析也证实了这一现象.这些结果提示,在NE2上8H3表位区域受到抗原上某些结构的掩盖,而8C11与NE2的结合引起了抗原空间结构的改变,导致了掩盖8H3表位的结构的去除和8H3表位的充分暴露.免疫捕获RT-PCR发现,8C11同样可以显著增强8H3对天然HEV病毒的捕获能力,提示这种结合诱导的衣壳蛋白空间构象改变在天然HEV病毒颗粒上同样存在.     

重组戊型肝炎病毒衣壳蛋白工程菌的高密度培养

在10L发酵罐中对戊型肝炎病毒衣壳蛋白在重组大肠杆菌中表达发酵工艺进行了研究,用分批培养方法探讨了不同培养基、培养基中磷酸盐浓度和Mg^2＋浓度等因素对菌体生长与重组蛋白表达的影响;用分批补料培养研究了不同的补料工艺对菌体生长与重组蛋白表达的影响,同时对重组菌诱导时期、诱导持续时间以及不同诱导温度表达包含体在尿素溶液中的溶解性进行了研究。结果表明,在优化后的培养基中,磷酸盐浓度、Mg^2＋浓度分别为80mmol/L 与20mmol/L时菌体生长与表达效果较好;分批补料培养中,37℃培养9h菌体达到对数期中期(约45OD600)为适宜诱导时期,加入终浓度为10mmol/L IPTG后诱导5h,OD600达到80以上,重组蛋白表达量达到29.74％,为最适收获菌体时间;37℃表达的包含体80％以上溶解在4mol/L的尿素溶液中,最终浓度达到14mg/mL; 10L发酵罐中确定的发酵工艺参数在30L发酵罐中进行了放大培养,10L发酵罐中确定的发酵工艺参数在30L发酵罐上具有可放大性与重复性, 可以应用于工业生产。     

HepG2细胞中与戊型肝炎病毒衣壳蛋白相互作用蛋白的初步研究

利用重组戊型肝炎病毒(HEV)衣壳蛋白片段p239(368~606 aa)形成的类病毒颗粒作为亲和层析诱饵蛋白,HepG2为细胞模型,筛选与p239类病毒颗粒特异性相互作用蛋白。经过二维电泳分离,MALDI-TOF-MS分析鉴定得到GRP78/Bip,HSP90,alpha-tubulin及P43四个与p239有相互作用的候选蛋白。GRP78/Bip为热休克蛋白家族成员,体外免疫共沉淀实验结果证实,其与p239有特异性的结合。此研究结果为深入研究HEV的感染过程如吸附、入胞,以及HEV的致病机理提供了有益线索。     

戊型肝炎病毒ORF3及其蛋白的研究进展

戊型肝炎病毒(HEV)是发展中国家急性肝炎流行的重要病原体之一,由于缺少有效的细胞培养系统和廉价的小型动物模型,对病毒的生物学特性及发病机理了解较少。近几年在HEV ORF3及其蛋白的分子生物学特性和功能研究方面取得了一些进展,为深入了解HEV的感染和致病机理提供了新的理论依据,对这些研究成果进行了综述。     

颗粒化重组戊型肝炎病毒衣壳蛋白及其抗原性与免疫原性

过去的研究发现大肠杆菌表达的戊型肝炎病毒（HEV）衣壳蛋白ORF2的aa394-606片段NE2可以形成同源多聚体,并具有良好的免疫保护性,但纯化后的免疫原性较弱。这里表达了3个NE2蛋白的N端延伸突变体,发现对应于ORF2 aa368_606的重组蛋白HEV239在体外可以形成颗粒性抗原。HEV 239抗原颗粒与戊肝患者血清反应性良好,对中和性单克隆抗体8C11的反应性与NE2抗原相当,而对另一中和性单克隆抗体8H3的反应性较NE2抗原有显著提高,表明HEV 239抗原颗粒具有比NE2更好的抗原性。纯化后的HEV 239抗原颗粒直径约为15～30nm。铝佐剂吸附的HEV 239免疫Balb/c小鼠的半数有效剂量（ED50）在0.08～0.25μg之间,而同样以铝佐剂吸附的NE2抗原60μg剂量免疫的抗体阳转率仅25%,表明HEV 239抗原颗粒具有更好的免疫原性。     

戊型肝炎病毒衣壳蛋白结合CYP 2A6并降低其底物催化能力

肝炎病毒的感染常常导致人体肝脏代谢能力变化,研究表明甲型肝炎病毒(Hepatitis A Virus,HAV)、乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus,HBV)和丙型肝炎病毒(Hepatitis C Virus,HCV)的感染都会影响肝细胞对药物的代谢能力。在本研究中,通过酵母双杂交系统在人肝cDNA文库中筛选与戊型肝炎病毒重组衣壳蛋白E2结合的蛋白,发现了与细胞色素P450 2A6(CYP2A6)部分片段高度同源的蛋白序列。通过pull-down、免疫共沉淀以及特异性底物催化反应评价等方法进一步证实了CYP2A6与重组衣壳蛋白E2、p239间的相互作用,并发现与p239结合可以降低CYP2A6对其特异性底物香豆素的催化能力。上述结果提示CYP2A6可能在戊肝病毒入侵细胞后的细胞病变过程中起作用。     

戊型肝炎病毒的分子生物学研究现状

本文介绍了戊肝病毒的分子生物学方面的最新进展,详细阐述了ＨＥＶ的基因结构、调控序列和其功能,以及相应蛋白的抗原位点。并对ＨＥＶ的分型、分类进行了比较。     

CD63在戊型肝炎病毒感染中的作用机制

本研究旨在寻找戊型肝炎病毒(hepatitis E virus,HEV)衣壳蛋白ORF2的相互作用蛋白,探讨其在HEV感染中的作用。采用酵母双杂交方法从人肝细胞文库中筛选与HEV ORF2相互作用的蛋白,结果显示CD63与HEV ORF2相互作用。Pull-down实验提示原核表达的ORF2与CD63结合较弱,而免疫共沉淀实验提示真核表达的ORF2能与CD63结合。流式细胞术检测结果显示,HEV易感细胞PLC/PRF/5细胞膜表面的CD63表达水平普遍低于HEV非易感细胞。过表达CD63抑制PLC/PRF/5细胞的HEV感染,而小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)干扰CD63表达则促进HEV感染。结果提示,CD63能与HEV ORF2相互作用,可能抑制HEV感染肝细胞。     

戊型肝炎病毒ORF2编码多肽抗原的表达及其特性研究

迄今所发现的唯一的戊型肝炎病毒（HEV）中和表位定位于开放读码框架2（ORF2）编码蛋白的第578和第607氨基酸（aa）之间的区域。将对应此区域的基因片段通过一段柔性的甘氨酸铰链与乙型肝炎病毒（HBV）表面抗原（HBsAg）基因的3′端相连,构建成HBV/HEV融合基因。该融合基因在毕赤酵母细胞内的表达产物物为分子量约29kDa的融合蛋白,具有组装成嵌合病毒样颗粒（VLP）的能力。此嵌合VLP具有与HBsAgVLP相似的特性且保留了天然HBV/HEV双重抗原性。对此嵌合VLP特性的初步研究提示其可能具有HBV/HEV双价重组疫苗的潜在应用前景。     

大肠杆菌表达的戊型肝炎病毒ORF2片段的聚合现象研究

在大肠杆菌中表达了戊型肝炎病毒（HEV）ORF2的a.a.394～a.a.604片段,得到的重组蛋白NE2在SDSPAGE中主要以可被尿素解聚的二聚体形式存在,二聚体对病人血清的反应性明显强于单体;质谱分析表明NE2可形成从二聚体到至少六聚体的多种聚体;动态光散射测定表明平均分子半径约4nm,相当于四聚体,但分散度较大,提示为多种大小不一的聚合体的混合物。这些证据表明NE2蛋白可形成以同源二聚体为基本单位的多种聚合体形式,其中以二聚体间的结合最为紧密,并且以二聚体为基础可进一步装配出多种更高级结构,从而具有作为HEV疫苗及诊断试剂抗原的良好前景。     

戊型肝炎病毒与HBV重叠感染患者的血清学分析

目的了解戊型肝炎病毒(HEV)感染情况以及乙型肝炎病毒(HBV)重叠感染戊型肝炎病毒的血清学特点及临床意义。方法对HEV、HBV感染以及HBV重叠HEV感染进行血清学检测并进行统计学分析。结果 HBV重叠感染HEV病例多分布青壮年,且女性多于男性;重叠感染患者的年龄高峰都在21~40岁;HEV感染组与HBV-HEV重叠感染组比较,ALP、TB IL存在明显差异,胆汁淤积增多,黄疸程度加深,肝细胞损伤明显。结论 HEV主要侵犯青壮年,HBV重叠HEV感染后肝细胞损害加重,病情趋向重症化。     

Acidic pH enhances structure and structural stability of the capsid protein of hepatitis E virus

Hepatitis E virus (HEV) is enterically transmitted and endemic to tropical areas of the world. The major capsid protein of HEV is pORF2 ( approximately 74 kDa), encoded by open reading frame 2 (ORF2). When expressed in insect cells, it is processed into a approximately 55 kDa form (n-pORF2). We also generated a mutant, m-pORF2, lacking a C-terminal hydrophobic region shown earlier to be required for its homo-oligomerization. Circular dichroism was used to measure the secondary structure and stability of these proteins as a function of pH and temperature. With decreasing pH both proteins acquired increasing alpha-helicity and thermal stability in terms of midpoint of denaturation and the Gibbs energy change.     

HCV E2区基因的分子克隆及序列分析

用RT－PCR KIT从西安血站大样抗HCV阳性血清中筛选出HCV RNA阳性血清,提取HCV的RNA,利用随机引物反转录合成其cDNA并进行半巢式PCR反应。将纯化的PCR产物酶切后与表达载体PET－22b^＋连接,经过双脱氧末端终止法双向测序,得到852bp长的核苷酸序列,通过将该序列与已知不同型的HCV E2序列比较得知,此序列正是HCVⅡ型目的基因。     

不同戊肝抗原检测抗-HEVIgM反应性研究

目的　比较不同戊肝抗原检测抗 -HEVIgM反应性。方法用HEVE30、E42、E33合成肽和HEVORF 2重组抗原建立酶免疫试验 (EIA)检测肝病患者和健康人群中抗 HEVIgM。结果 6 0份抗 HEV阳性血清中 ,用E30、E42、E33及重组抗原包被检测抗 HEVIgM ,阳性率分别为 76 .6 % ,2 6 .6 % ,18.3 % ,6 6 .7%。用E30抗原进一步检测戊肝急性期及恢复期血清 ,抗HEVIgM阳性率为 90 %及 3 .3 %。结论以HEVE30为抗原的EIA特异性强、灵敏度高 ,是戊型肝炎早期诊断实用可靠的方法。     

HCV E2蛋白诱导的体液免疫及CTL应答研究

应用PCR方法扩增出HCVE2基因编码417a．a-750a．a的DNA片段,克隆到原核表达载体pQE30 LacZ启动子下游,转化JM109菌株。在JM109菌株中诱导表达出N端含6个组氨酸的E2融合蛋白,用Ni-NTA-Superflow亲和层析柱纯化作为抗原免疫实验兔和BALB／c鼠。定期取兔血,采用间接ELISA方法检测兔子体内针对E2的抗体水平和维持规律。结果显示,距初次免疫14d兔子体内已有抗体产生,直至免疫第55d抗体水平持续上升,之后抗体水平保持稳定,抗体滴度达到1：3200。六周后,取鼠脾脏制各淋巴细胞,定向刺激扩增后与经过重组真核表达质粒pCE2转染的P815细胞作用,利用LDH释放试验检测作用效果。在E：T＝200：1的情况下,杀伤率超过30％。这些结果表明工程菌株表达的HCVE2蛋白具有良好的免疫原性,可以诱发免疫实验动物机体产生较高滴度的抗体及特异性CTL应答。由此我们认为E2蛋白是发展HCV预防工程蛋白疫苗的合适候选者。     

戊型肝炎病毒DNA免疫的研究

利用PCR方法获得1163bp的戊型肝炎（Hepatitis E Virus,HEV）开放读码框架（Open Reading Frame,ORF）ORF2之3'大片段和369bp ORF3的完整片段,分别克隆到真核表达载体pcDNA3中,构建两种含有HEV主要抗原表位的质粒DNA：pcE2和pcE3,分别或混合免疫Swiss小鼠三次（0时,第2周,第4周）,观察其在小鼠体内诱发的体液免疫应答。ELISA检测结果表明,pcE2和pcE3在小鼠体内均可诱导出一定水平的HEV IgG抗体,且在第三次免疫接种两周后,100％的小鼠抗体阳转。与两和中质粒单独免疫相比,两者同时注射的抗体水平较高。本研究为HEV DNA疫苗的研究打下一定基础。