一种新的精子结合蛋白HBRP在原核表达及其活性研究

为了发现和研究牛精浆(bovine seminal plasma,BSP)蛋白及其相关蛋白在受精及受精卵发育中的重要作用,我们克隆了人类生殖相关新基因HBRP(Human BSP—Related Proteins),本通过基因重组技术,构建了GST—HBRP融合蛋白表达质粒,在大肠杆菌中获得大量表达,并检测了该蛋白对PKC活性的影响。     

内毒素结合肽的原核表达、纯化及生物学活性鉴定

重组人内毒素结合肽 (endotoxinbindingpeptide ,EBP)融合蛋白在大肠杆菌中表达 ,分离和纯化后对其进行生物学活性观察 .将构建好的PinpointⅩa3 EBP生物素融合表达载体转化大肠杆菌DH5α ,IPTG诱导表达菌株 ,亲和层析法纯化表达产物 ,因子Ⅹa(factorⅩa)切割分离内毒素结合肽 ,采用凝胶过滤和反相液相高效色谱法两步纯化 ,从相对分子质量、N端 1 0个氨基酸的序列分析等方面进行鉴定 ;利用人单核细胞U937对重组内毒素结合肽进行了生物学活性的检测 .结果发现 ,内毒素结合肽以包涵体形式存在 ,因子Ⅹa酶切融合蛋白后得到 3 5kD的内毒素结合肽 ,纯化后内毒素结合肽纯度达 99%以上 ,N端 1 0个氨基酸的分析结果与预期相符 ;初步证实内毒素结合肽具有较好的LPS结合活性 ,能够抑制LPS的作用 .经原核表达及纯化复性 ,获得了具有较好生物学活性的内毒素结合肽 ,为进一步研究其功能奠定了良好的基础     

水稻osRACB基因的原核表达及其蛋白质产物的生化特性鉴定

Rac蛋白作为高等植物中已知的惟一一类分布广泛的信号GTP结合蛋白 ,在植物体众多生命活动调节中起着分子开关的作用。实验将水稻Rac家族新成员osRACB基因克隆于原核表达载体pET 2 8a中 ,转化大肠杆菌BL2 1(DE3)宿主菌 ,经IPTG诱导实现了目标融合蛋白质的高效表达。通过Ni2 NTA柱纯化 ,获得纯化的目标融合蛋白质 ,经凝血酶作用后得到osRACB非融合蛋白质。该蛋白质经谷胱甘肽氧化还原体系复性和超滤浓缩后 ,用于体外功能鉴定。结果显示 ,osRACB蛋白具有与GTP特异性结合的活性以及水解GTP的功能。与另一Rac蛋白osRACD相比较 ,osRACB具有更强的GTP结合活性和较弱的GTP水解活性。     

重组苦荞麦过敏蛋白TBa的原核表达及其免疫活性鉴定

TBa ［tartary buckwheat allergen］是苦荞麦中的一种主要过敏蛋白.根据长度为585 bp 的TBacDNA序列,以pET-28a为表达载体并选择合适的酶切位点合成上、下游引物,采用基因克隆技术构建重组表达载体pET-28a-TBa.进一步将重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3) 中进行表达.从而获得以包涵体形式存在的TBa目的蛋白.该目的蛋白经Ni ²⁺ -NTA琼脂糖柱亲和纯化及SDS-PAGE分析显示, 纯度达到95% 以上.用透析复性的方法将目的蛋白重折叠,其复性产率可达到约68%.Western印迹证实,目的蛋白N端带有6个组氨酸标签.ELISA检测表明,通过基因重组及表达获得的重组苦荞麦过敏蛋白,与天然苦荞种子中的该蛋白具有相似的免疫学活性,与荞麦过敏病人血清中的IgE有特异性的结合.     

棉铃虫激活增强子结合蛋白AP-4基因的原核表达、多克隆抗体制备、表达谱分析及功能鉴定

【目的】激活增强子结合蛋白4(activating enhancer binding protein 4, AP-4)是近年来备受关注的一类功能广泛的转录因子,参与Wnt/β-catenin信号通路的调控。本研究旨在研究棉铃虫Helicoverpa armigera HaAP-4基因的原核表达并制备多克隆抗体,明确HaAP-4基因的时空表达谱,初步探究HaAP-4对棉铃虫胆固醇载体蛋白2(sterol carrier protein-2, SCP-2)基因(HaSCP-2)表达的调控作用。【方法】通过PCR扩增棉铃虫HaAP-4基因片段,将其克隆至pET-28a原核表达载体,转化至大肠杆菌Escherichia coli BL21,经IPTG诱导表达,采用镍柱纯化重组蛋白,免疫新西兰兔制备多克隆抗体。运用RT-qPCR检测HaAP-4基因在棉铃虫不同发育阶段(卵、幼虫、预蛹、蛹和成虫)以及5龄幼虫和预蛹不同组织(中肠、脂肪体、头和表皮)中的表达水平。设计并合成HaAP-4 siRNA,转染棉铃虫Ha细胞,通过RT-qPCR检测和分析使用HaAP-4 siRNA进行RNA干扰后Ha细胞中HaAP-4和HaSCP-2基因 mRNA的表达情况。【结果】成功构建pET-28a-HaAP-4重组表达质粒,在大肠杆菌细胞中获得高效表达的可溶性蛋白,目的蛋白大小约为55 kD,经纯化获得了纯度较高的重组蛋白,免疫新西兰兔成功制备了多克隆抗体,通过Western blotting检测显示抗体具有较好的特异性,ELISA分析表明抗体效价较高。发育阶段特异性表达结果显示,HaAP-4基因在棉铃虫不同发育阶段均有表达,其中在卵期、5龄幼虫期和预蛹期的表达量较高。组织表达结果表明,HaAP-4基因在5龄幼虫和预蛹不同组织中均有表达,且在中肠和头部具有高表达,而在表皮和脂肪体中表达量较低。RNA干扰实验发现,HaAP-4基因的敲降对HaSCP-2基因转录有显著影响,HaSCP-2基因mRNA表达水平下降了约55%。【结论】利用pET-28a原核表达系统能有效地在体外表达可溶性的HaAP-4,并制备了较好的多克隆抗体。RNAi实验结果提示,在中肠内高表达的HaAP-4基因能促进HaSCP-2基因的转录表达,在棉铃虫脂质生理代谢过程中发挥作用。本研究为进一步深入阐明棉铃虫HaAP-4的潜在功能打下了基础。     

麦二叉蚜体内病毒结合蛋白基因的克隆和原核表达

从麦二叉蚜体内克隆了一个DNA片段,经序列测定表明该片段全长为1647bp,编码548个氨基酸.与禾谷缢管蚜的病毒结合蛋白基因核苷酸同源性为92%,氨基酸的同源性为96%,从而认为这是病毒结合蛋白基因(GenBank登录号为AF434719).构建了该基因的原核表达载体pBVSG和pETSG,用pBVSG表达出63kD的非融合目的蛋白,用pETSG表达出69kD的融合蛋白,二者均有较高的表达量.以纯化的融合蛋白免疫家兔,制备了此病毒结合蛋白的抗血清,用琼脂双扩散法测定效价为1∶512.     

水稻双链RNA结合蛋白同源基因OsRBP的克隆及其表达的分析

在基因数据库中发现两个水稻EST片段与大白菜BcpLH基因的双链RNA结合结构域 (dsRBD)有同源的区域 ,根据同源片段的位置特征设计引物 ,用RT-RCR扩增粳稻 (Oryzasativasubsp .japonica)愈伤组织的cDNA ,得到大小为 1.8kb的DNA片段。该cDNA片段含完整的编码区 ,有两个典型的dsRBD ,分别与BcpLH的dsRBD在氨基酸水平上同源性为 75 %左右 ,故将其命名为OsRBP。RT -PCR表达分析显示该基因在未成熟的种子和愈伤组织中表达 ,在根、茎、叶、穗、成熟种子及胚芽鞘中没有表达信号 ,由此推测该基因的表达可能与种子和胚的早期发育相关。该研究首次从水稻中分离到双链RNA结合蛋白基因 ,并初步研究了其表达方式 ,为进一步探讨水稻重要器官的发育和植物中双链RNA结合蛋白的调节作用奠定了基础     

人sCR1活性片段原核表达载体的构建与蛋白表达及生物活性鉴定

补体系统过度活化片段所介导的器官缺血再灌注损伤和机会病原菌感染等疾病的防治十分棘手。国内外的研究证实,其始动因子除了C5a之外还有C3a和C5b-9等成分的共同作用。在经典、旁路和MBL三个补体激活途径中,都以C3活化为中心,sCR1结合功能域片断SCR15-18既可灭活C3/C5转化酶,又     

双链RNA结合蛋白与双链RNA结合域

双链RNA(double stranded RNA,dsRNA)能引发细胞的抗病毒机制,其产生效应是因为作用于含有dsRNA结合域(dsRNA·binding domain,DRBD)的酶类和其他功能蛋白质,这些蛋白质能够特异性地识别并结合dsRNA,从而引起细胞应答.已有的资料表明DRBD不仅与dsRNA结合,还能与DNA或其他形式的RNA分子结合,而且有些蛋白质的DRBD不与任何核酸分子结合,仅起调节作用.另外,同种蛋白质的不同DRBD之间以及不同蛋白质的DRBD之间也能相互作用,从而形成复杂的蛋白质一蛋白质复合体,参与多种细胞代谢途径.因此,DRBD及其含有这些结构域的蛋白质可能具有多种功能.     

棉铃虫普通气味结合蛋白Ⅱ基因的表达及鉴定

通过PCR扩增的方法获得了棉铃虫普通气味结合蛋白Ⅱ(GOBP2-Harm)基因成熟蛋白阅读框序列,构建了GOBP2-Harm原核表达载体pGEX/GOBP2-Harm,并成功地在大肠杆菌中进行了表达。SDS-PAGE分析表明：大部分GOBP2-Harm重组蛋白形成不溶性的包涵体,超声波破碎大肠杆菌细胞后,在上清液中能检测到少量的可溶性GOBP2-Harm蛋白。为了获得大量纯化的可溶性目的蛋白,我们对包涵体进行了溶解和重折叠,并通过亲合层析法进行了纯化。纯化产物能与多音天蚕(Antheraea polyphemus) GOBP抗血清发生交叉反应,证实表达产物属于昆虫普通气味结合蛋白。     

人心型脂肪酸结合蛋白(H-FABP)的原核表达、纯化和冻干品的制备

目的：获得重组人心型脂肪酸结合蛋白,分析其活性及制备冻干品。方法：从GenBank中检索人源H-FABP CDs 序列,合成基因后构建原核表达载体pET-28a（+）-H-FABP。将表达载体转入E.coli BL21（DE3）,摸索pET-28a（+）-H-FABP最佳诱导条件,表达并纯化重组蛋白。使用检测试剂检测纯化后的重组H-FABP活性,研究最佳冻干方案并考察冻干品的稳定性。结果：经过优化诱导条件,重组H-FABP在BL21（DE3）中以可溶性蛋白形式表达。诱导条件为OD₆₀₀≈0.6,IPTG终浓度0.4mmol/L,30℃诱导4h。通过Ni²⁺亲和层析纯化可得到纯度大于95%的重组H-FABP蛋白。重组H-FABP冻干品可以在37℃稳定保存12d,25℃、4℃稳定保存至少4个月。结论：本项研究中的重组H-FABP表达体系成熟、蛋白活性高,冻干品稳定性好,为后续研究提供了稳定高效的生物原材料。     

RBPMS不同剪接体的真核表达和亚细胞定位

目的：构建具有多种剪接形式的RNA结合蛋白（RBPMS）基因的真核表达载体,并在真核细胞中表达,确定不同形式的RBPMS在细胞中的定位。方法：采用PCR技术从人卵巢cDNA文库中扩增RBPMS基因的几种完整编码序列（命名为RBPl～RBP4）,克隆到带绿色荧光蛋白标签的pEGFP-C1表达载体上,转染人胚肾细胞293T,Western印迹鉴定RBPMS的表达,并利用激光共聚焦显微镜观察RBPMS不同剪接体在细胞中的定位。结果：限制性内切酶分析和DNA序列测定表明构建的重组表达载体正确,Western印迹实验证明RBP1～RBP4表达成功。通过激光共聚焦显微镜观察,RBP1／4围绕胞核在核膜的周围呈聚集状分布;RBP2则在细胞质和细胞核中均有分布,但会出现斑点状聚集;RBP3呈半月状紧密分布在细胞核周围;RBPMS中的RNA识别基序缺失后,这种现象消失,与空载体对照类似,在细胞核和细胞质中均有分布。结论：构建并表达了RBPMS基因的真核表达载体,RBPMS不同剪接体及RNA识别基序缺失后具有不同的亚细胞分布模式,提示具有不同的功能。     

人PSF蛋白的原核表达及分析鉴定

PSF(polypyrimidine tract binding protein-associated splicing factor)蛋白是一种多功能的DNA/RNA结合蛋白,能够抑制原癌基因的表达,在人和小鼠中具有肿瘤抑制的作用.以人成纤维细胞总RNA为材料,利用PSF特异性引物通过RT-PCR的方法扩增得到PSF...     

重组人Doppel蛋白的表达及其细胞毒性作用的研究

Doppel(Dpl)蛋白是新近发现的PrP相关蛋白.根据GenBank公布的人PRND cDNA序列设计合成特异性引物,用PCR方法从人外周血白细胞总DNA中扩增获得531 bp的人PRND完整基因序列,测序正确后克隆至表达载体,转化大肠杆菌JM109,IPTG诱导表达重组人Doppel(rhDpl)蛋白.目的蛋白以包涵体形式表达,表达量占菌体总蛋白的60%以上.表达产物用Ni2 亲和层析柱纯化及羟胺化学裂解法去除标签蛋白,SDS-PAGE检测证实,纯化的rhDpl蛋白相对分子量约为15 kD.Trypan Blue及MTT实验显示,在50μg/mL及以上剂量时,rhDpl蛋白具有抑制人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞生长的作用,在100μg/mL及以上剂量时,rhDpl具有杀伤HeLa细胞的活性,呈现明显的剂量和时间依赖性.Hoechst33342荧光染色观察显示经rhDpl作用的人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y呈现出细胞凋亡现象.这些结果提示Dpl蛋白具有体外细胞毒作用,并呈现明显的组织类型特异性.以上工作为进一步了解人Dpl蛋白体内外生物学作用奠定了基础.     

利用RNA干扰抑制具有多种剪接形式的RNA结合蛋白基因的表达

目的:构建具有多种剪接形式的RNA结合蛋白(RBPMS)基因siRNA的真核表达载体,观察其对RBPMS表达的影响。方法:利用RNA干扰(RNAi)技术,设计并合成了2条针对RBPMS基因的siRNA,将其克隆到siRNA表达载体pSliencer2.1-U6neo上。将重组质粒和带FLAG标签的RBPMS共转染293T人胚肾细胞,通过Western印迹检验RNAi效应。结果:测序证明成功构建了RBPMSsiRNA真核表达载体;Western印迹表明构建的siRNA能有效地抑制RBPMS基因的表达。结论:构建了RBPMSsiRNA的真核表达载体,该siRNA能有效地抑制RBPMS基因的表达。     

RNA结合蛋白与非编码RNA调节关系的研究进展

近年来,越来越多的研究表明,RNA结合蛋白(RNA binding protein,RBP)与多种类型的非编码RNAs(noncoding RNA,ncRNAs)具有互相调节的关系,且调节机制形式多样。一方面,RBP可以调节ncRNA的生物合成、稳定性和功能;另一方面,ncRNA也可以影响RBP的功能和结构。同时,RBP和ncRNA的相互作用还在其他靶基因的调节上起着重要的作用,从而参与众多的生物过程,如组织发育、代谢性疾病、神经退行性疾病、抗病毒免疫和各种癌症等。该文就RBP与常见类型的ncRNAs,包括miRNA、lncRNA、circRNA的相互作用方式和调节机制的研究进展作一综述。     

RRM RNA结合蛋白的结构与功能

RRM RNA结合蛋白是一类含一个或数个RRM结构域及附属结构域的RNA结合蛋白,参与RNA前体的剪接、RNA的细胞定位、RNA的稳定性等多种转录后调控过程.在RRM基序中含有许多保守的氨基酸以保证对RNA的结合活性,但是这一家族的不同蛋白质却能特异地结合各种不同的RNA分子.RRM RNA结合蛋白与某些人类遗传性疾病及肿瘤相关.     

CaMBP-10的cDNA克隆和表达及钙调素结合活性分析

采用RT PCR法 ,从中国大白菜中分离了编码CaMBP 1 0的cDNA克隆 .该cDNA全长 4 96bp ,编码 92个氨基酸 ,3′端含有 2 1 6bp的非编码区和poly A尾 .将此BP 1 0cDNA的成熟蛋白序列导入表达质粒pET1 5b并转化至大肠杆菌E .coliBL2 1 (DE3)condonplus RIL进行表达 .以免疫印迹和钙调素结合分析法对重组BP 1 0进行鉴定 ,证明其保持了与天然BP 1 0相同的钙调素结合活性 .氨基酸和核苷酸序列分析结果显示 ,它与植物转脂蛋白高度同源 ,特别是含有 8个保守半胱氨酸 .BP 1 0与转脂蛋白之间具极为相似的理化性质如分子量、等电点、热稳定性等 .据此认为 ,CaMBP 1 0是转脂蛋白家族的新成员 ,Ca2 + CaM信号系统可能参与植物转脂蛋白功能的调节     

Crystallization and Characterization of Pumilio: A Novel RNA Binding Protein

Axis determination in early Drosophila embryos is controlled, in part, by regulation of translation of mRNAs transcribed in maternal cells during oogenesis. The Pumilio protein is essential in posterior determination, binding to hunchback mRNA in complex with Nanos to suppress hunchback translation. In order to understand the structural basis of RNA binding, Nanos recruitment, and translational control, we have crystallized a domain of the Drosophila Pumilio protein that binds RNA. The crystals belong to the space group P6₃ with unit cell dimensions of a = b = 94.5 Å, c = 228.9 Å, α = β = 90°, γ = 120° and diffract to 2.6 Å with synchrotron radiation. We show that the purified protein actively binds RNA and is likely to have a novel RNA binding fold due to a very high content of α-helical secondary structure.