体外培养脐血单个核细胞与CD34+富集细胞

对比MNC和CD34 +富集细胞在SCF +IL 3+IL 6 +FL +Tpo细胞因子组合下的体外扩增特性 ,发现 :CD34 +富集细胞具有很高的扩增潜力 ,在本实验条件下其总细胞持续扩增了 8周 ,扩增倍数达 312 70 9± 86 40 5倍 ;而MNC在培养至第 4周扩增就已呈现下降趋势 ,最大仅扩增了 5 3 3± 6 2倍。对比集落和CD34 +细胞的扩增发现 ,MNC的集落密度和CD34 +细胞含量由第 0天至第 7天有一个上升的过程 ,而CD34 +富集细胞在培养过程中 ,集落密度和CD34 +细胞含量却始终呈下降趋势。在体外培养过程中 ,CD34 +富集细胞的CFU GM和CD34 +细胞最大分别扩增了 185 7± 14 1和 191 7± 188 8倍 ,明显高于MNC的 12 4± 3 2和 5 0 6± 33 2倍 ;而CD34 +富集细胞和MNC的BFU E则只实现了少量扩增 ,分别为 7 2± 5 2和 10 1± 3 4倍。结果显示 ,从CD34 +富集细胞出发扩增造血干 祖细胞 ,可以得到更多的CD34 +细胞和CFU GM集落形成细胞     

人胎盘间充质干细胞对脐血CD34~+细胞迁移作用的影响

人胎盘作为间充质干细胞的新来源在调控造血干/祖细胞(CD34+细胞)发育与分化方面具有重要作用,但其在移植中是否对CD34+细胞迁移起作用尚不清楚.为此,本研究通过胰酶消化法和密度梯度离心法,单克隆筛选培养出人胎盘来源间充质干细胞,RT-PCR检测其与造血和趋化相关的细胞因子和黏附分子的表达;进一步利用transwell体系检测其对脐血CD34+细胞的迁移作用.结果表明,PDMSCs呈现典型的成纤维样细胞,表达间充质干细胞相关表面抗原CD73,CD90和CD105,不表达造血及内皮细胞表面抗原CD34,CD45,CD31等,PDMSCs具有诱导成脂肪、成骨和成软骨的能力.RT-PCR检测结果显示,PDMSCs表达IL-6,LIF,G-CSF,GM-CSF,M-CSF,FL,SCF,SDF-1,VEGF等多种造血与趋化因子,Integrinβ1,Integrinα5,ICAM-1,ICAM-2,ICAM-3,VCAM-1等多种黏附分子;将PDMSCs按照不同密度接种在transwell体系,4h后脐血CD34+细胞迁移率随着PDMSCs的密度增加而增加;在PDMSCs与SDF-1对CD34+细胞的趋化迁移比较实...     

Wnt3a 转基因基质细胞的建立及其对脐血CD34+ 造血干/祖细胞扩增作用的研究

Wnt 信号通路在造血干/祖细胞自我更新的过程中发挥至关重要的作用 . 纯化的 Wnt3a 蛋白可以实现造血干/祖细胞的扩增 . 通过病毒转染原代小鼠骨髓基质细胞,建立转基因滋养层细胞 . 通过共培养对转基因滋养层细胞扩增 CD34+ 造血干/祖细胞的作用进行了研究 . 实验结果显示 , 与普通滋养层加细胞因子组相比,经转基因滋养层加细胞因子组培养的 CD34+造血干/祖细胞集落形成能力 (CFC) 是其 (1.55±0.06) 倍;混合集落形成能力是其 (1.95±0.26) 倍;高增殖潜能集落形成能力 (HPP-CFC) 是其 (1.45±0.40) 倍; LTC-IC 活性是其 (3.83±0.86) 倍 . 结果表明,转基因滋养层细胞通过分泌具有天然活性的 Wnt3a 蛋白能在体外有效地扩增造血干/祖细胞的数量 .     

血小板第四因子对脐血CD34+细胞趋化作用的研究

目的 :研究PF4及其小肽PF417 70对新鲜脐血CD34+细胞的趋化作用及对粘附分子表达的影响。方法 :采用免疫磁珠法 (MACS)分选CD34+细胞 ,利用Transwell穿孔板测定PF4对CD34+细胞的趋化作用 ;流式细胞仪检测免疫荧光标记的粘附分子及CXCR4的表达。结果 :①PF4对脐血CD34+细胞有趋化作用 ,PF4组的趋化百分比为 15 7.43%± 5 0 .0 6 %(P <0 .0 5 ) ,PF417 70组为 187.0 2 %± 10 .6 9%(P <0 .0 5 )。②PF4作用于CD34+细胞时 ,CD49d和CXCR 4表达增加 ,对其它粘附分子CD31,CD44 ,CD11a ,CD6 2 p ,CD6 2E的表达没有影响。 结论 :PF4对脐血CD34+细胞有趋化作用 ,促进整合素CD49d及CXCR4的表达 ,PF4有助于脐血干细胞的归巢。     

S-亚硝基谷胱甘肽诱导脐带血CD34+细胞来源的巨核细胞产生血小板

为了探讨一氧化氮供体S-亚硝基谷胱甘肽（S—nitrosoglutathione,GSNO）对脐带血CD34^＋细胞分化来源的巨三核细胞产生血小板的可能作用,我们采用免疫磁珠法从8例健康产妇足月顺产的胎儿脐带血中分选CD34^＋细胞,并在含血小板生成素（thrombopoietin,TPO,50ng／ml）、白细胞介素-3（IL-3,10ng／ml）、干细胞因子（stem cell factor,SCF,50ng／ml）和重组人粒-巨噬细胞刺激因子（rHu GM—CSF,20ng／ml）的无血清培养基中培养14d。随后,用免疫磁珠法分选CD61^＋细胞。CD61^＋细胞在含有（实验组）和缺乏（对照组）GSNO（20mg／ml）的无血清培养基[含TPO（50ng／ml）、IL-3（10ng／ml）、SCF（50ng／ml）]中培养不同时间（30min、2h）。采用流式细胞仪检测培养体系中的血小板数;电子显微镜观察巨核细胞的形态学;倒置显微镜和流式细胞仪观察凝血酶诱导的血小板凝集;ELISA方法检测巨核细胞中cGMP的含量。结果显示,与对照组比较,实验组血小板数量明显增加（P〈0．05）;电子显微镜下可见巨核细胞有明显伪足形成和突出;凝血酶诱导后在倒置显微镜和流式细胞仪上均可观察到血小板凝集现象;GSNO作用后巨核细胞中的cGMP明显升高（P〈0．05）。这些结果提示,GSNO可以促进脐带血CD34^＋细胞来源的巨核细胞产生具有一定功能的血小板,其产生的机制可能部分与cGMP途径有关。     

CD34+和CD34-细胞在NOD/SCID小鼠体内的造血重建

利用非肥胖糖尿病型重症联合免疫缺陷型(NOD/SCID)小鼠模型, 比较了新鲜及培养后的CD34+和CD34-细胞在体内植入及重建造血能力。从新鲜脐血及培养后的单个核细胞(MNC)中分离出CD34+和CD34-细胞, 经尾静脉输注入经亚致死剂量照射的NOD/SCID小鼠体内, 6周后处死存活的小鼠, 取其骨髓、脾脏和外周血细胞, 分别进行细胞表型分析、造血集落形成单位和人特异性基因的检测。经检测, 输注CD34+细胞和混合细胞的小鼠, 其体内CD45+细胞及人源各系血细胞的含量相近, 两者均远远高于输注CD34-细胞的小鼠。输注培养后CD34-细胞的小鼠饲养6周后全部死亡,输注培养后CD34+细胞的小鼠存活率约为66.7%, 而输注培养后混合细胞的小鼠全部存活, 且在两组存活的小鼠体内均能检测到CD45+细胞及人源各系血细胞。结果表明: 无论是新鲜还是培养后的CD34+细胞均具有在NOD/SCID小鼠体内植入和重建造血能力, 而CD34-细胞不具有该能力, 但CD34-细胞与CD34+细胞同时输注有助于提高小鼠的存活率, 说明其对CD34+细胞在小鼠体内发挥植入和造血重建能力有一定的辅助作用。     

FLT3配基在人骨髓基质细胞系中的基因转移与表达

目的：研究逆转录病毒介导的FL在骨髓基质细胞系HFCL中的表达。方法：采用脂质体法将重组质粒pLF-SN/HFCL和空载体pLXSN/HFCL转染包装细胞PA317,G418筛选抗性克隆,用抗性克隆上清液感染HFCL。RT－PCR和基因组DNA－PCR检测外源基因mRNA水平的表达及染色体的整合,小鼠CFU－GM集落法检测FL生物学活性。结果：在mRNA水平上有FL的表达,染色体基因组中整合有标记neo基因和FL基因。活性测试结果显示转染的骨髓基质细胞分泌FL。结论：提示骨髓基质细胞可作为基因治疗的靶细胞。     

骨髓基质细胞条件培养液联合TPO体外扩增巨核系细胞

目的：探讨骨髓成纤维细胞条件培养液（F-CM）和骨髓内皮细胞条件培养液（E-CM）分别联用TPO对巨核系细胞的体外扩增作用。方法：分别收集纯的F-CM和E-CM,观察它们分别与TPO联用后对体外扩增成熟巨核细胞和巨核系祖细胞的作用。结果：F-CM或E-CM与TPO联用后对巨核系成熟细胞的扩增作用明显优于F-CM或E-CM单用（P〈0．01或P〈0．05）;F-CM＋TPO的扩增效果明显优于E-CM＋TPo或SCF＋TPO＋IL-3＋IL-6的扩增效果（P〈0．01或P〈0．05）;F-CM或E-CM联合TPO后对祖细胞的扩增作用无明显改变（P〉0．05）。结论：F-CM与TPO联用后可显著提高它们对成熟巨核细胞体外扩增的效率,其作用优于SCF＋TPO＋IL-3＋IL-6;F-CM或E-CM与TPO联用后对巨核系祖细胞体外扩增作用与二者单用无显著差异。     

肝素促进脐血巨核祖细胞体外扩增

目的 :探索肝素在脐带血CD34⁺ 细胞定向扩增巨核祖细胞中的作用。方法采用免疫磁珠法 (MACS)分选CD34⁺ 细胞 ,在TPO ,IL 1 1的扩增体系中加入肝素 ,巨核祖细胞集落分析 (CFU MK)测定巨核祖细胞扩增倍数 ,流式细胞仪检测巨核祖细胞分化过程中的特异性标记 (CD34⁺ ,CD41a⁺ ,CD61⁺ ,CD34⁺ CD41a⁺ ,CD41a⁺ CD61 ⁺ ) ,巨核细胞特异性抗体 (CD41a)免疫组化染色和透射电镜观察鉴定巨核细胞形态及超微结构 ,血小板体外活化实验及NOD/SCID小鼠异种体内移植实验评价扩增的巨核祖细胞的功能。结果 :TPO( 5 0ng/ml)与IL-1 1 ( 5 0ng/ml)双因子联合应用 ,7天巨核祖细胞克隆扩增倍数为 83 1 7± 39 41倍 ,1 0天为 2 0 5 0 6± 74 2 6倍 ,流式细胞仪分析显示 7天CD34⁺ CD41a+ 细胞扩增 1 0 5 1± 4 79倍 ,0天加入肝素后 ,7天巨核祖细胞克隆扩增倍数为 1 0 8 2 5± 32 67倍 ,1 0天为 333 0 6± 2 7 5 4倍 ,7天CD34⁺ CD41a⁺ 细胞扩增到 2 9 93± 6 39倍 ,为无肝素组的 2.85倍 ,与双因子组相比有统计学差异 (P <0.0 1 ) ,肝素在第 5天及第 7天加入没有增加巨核祖细胞扩增效果。经全身照射预处理的NOD/SCID小鼠静脉输注扩增第 7天的巨核细胞 (TPO、IL-11、肝素联合 ) ,可明显加速其血小板及白细胞计数的恢复并提高生存率 ;同时 ,体外血小板活化实验证实扩增的巨核细胞在体外可产生血小板 ,有正常巨核细胞功能。结论 :TPO、IL-11组合的扩增体系中加入肝素可进一步改善脐带血巨核祖细胞的扩增效果 ,优化体外扩增体系。     

逆转录病毒介导的人血小板生成素(TPO)在骨髓基质细胞中的表达

为探讨逆转录病毒介导的TPO基因在人骨髓基质细胞系HFCL中的表达,利用脂质体法将含TPO基因的逆转录病毒载体导入HF-CL细胞中,RT-PCR和基因组DNAPCR分析证实mRNA水平有表达,基因组中整合有Neo基因和TPO基因。TPO依赖细胞株TD-3检测生物学活性表明转染的骨髓基质细胞分泌TPO。上述结果为进一步研究转基因骨髓基质细胞对造血细胞的调控作用提供了必要的基础资料。     

人脐血CD34+细胞在NOD/SCID小鼠免疫重建及其抗HBV作用的初步探讨

目的：探讨NOD／SCID（nonobese diabetic／severe combined immunodeficient）小鼠移植人脐带血（human umbilical cord blood,HUCB）CD34＋细胞后免疫重建的特性。建立hu—NOD／SCID人鼠嵌合模型并观察其人源化免疫细胞在小鼠体内的生长分化特性、存活时间及其对HBV感染的清除作用。方法：1．NOD／SCID小鼠于C0603．5Gy照射后24h内尾静脉输注HUCBCD34＋细胞;2．以流式细胞技术鉴定小鼠外周血中CD45＋,CD3＋,CD19＋,CD56＋等人源化细胞的比例;3．NOD／SCID小鼠于移植后第4wk注射HBV感染者血清并以未移植的NOD／SCID小鼠作为对照,注射同等量的患者血清;4．于感染后1、7、10、15天采血,免疫荧光定量PCR方法分别检测其HBV—DNA含量。结果：1．HUCBCD34＋细胞移植后第2wk,在小鼠外周血中检测出的CD3＋CD8＋T细胞、CD3＋CD4＋T细胞、CD19＋B细胞、CD56＋NK细胞的比例分别为18．6％、16．1％、13．1％和27．8％。各细胞比例随小鼠周龄而变化。所有移植小鼠存活时间均达9wk;2．移植后小鼠感染HBV血清后,病毒仅在感染后第一天检出,随后消失;未移植CD34＋细胞的小鼠外周血HBV—DNA一直维持在103水平：结论：1．NOD／SCID小鼠经射线照射后移植HUCBCD34＋细胞,在不加任何刺激因子的情况下小鼠可以长时间存活并重建免疫;2．hu—NOD／SCID人鼠嵌合模型小鼠免疫成功重建后,对HBV感染有快速的清除作用。     

促红细胞生成素基因修饰的胎肝基质细胞促进脐血CD34 +细胞向红系分化

通过重组慢病毒系统感染人胎肝基质细胞(fetal liver stromal cells,FLSCs),建立了能够稳定高效表达促红细胞生成素(erythropoietin,EPO)的细胞株EPO/FLSCs.从胎儿肝脏克隆EPO基因,构建重组慢病毒EPO的表达载体,感染FLSCs,根据荧光表达强弱进行流式分选,获得能够继续稳定传代的高表达EPO基因的FLSCs,RT-PCR和ELISA结果证实,细胞株中的EPO基因稳定表达.RT-PCR结果显示,FLSCs的EPO在mRNA水平的表达分别是未转染FLSCs和转染空载体FLSCs的5.63倍和5.71倍.ELISA法检测了转染重组慢病毒EPO表达载体的FLSCs EPO蛋白表达水平,结果显示EPO蛋白的表达水平也明显升高.收集EPO/FLSCs的条件培养基,体外诱导脐血CD34+细胞向造血细胞分化,结果显示向红系定向分化的细胞比例明显居多,有可能为临床细胞治疗提供稳定、高质量的细胞来源.     

β-ME和BHA体外诱导人胎肝CD34+细胞向神经组织细胞分化研究

目的:建立巯基乙醇(β-mercaptoethanol,β-ME)和丁羟回醚(butylated hydroxyanisole,BHA)体外诱导人胎肝(fetal liver,FL)干细胞向神经细胞分化模型.方法:采用MACS试剂盒分离人胚胎肝CD34 细胞,以DMEM 10%胎牛血清培养液培养;第五代细胞待细胞融合达80%后,用DMEM 10%胎牛血清 1mmol/L β-ME 0.2 mmol/L BHA诱导24 h,PBS洗涤.然后在无血清培养基中培养5 h～5 d.用免疫细胞化学方法分析诱导前后的细胞表型特点.结果:经β-ME BHA诱导处理后,细胞表现神经元样细胞形态,表达神经组织细胞特异蛋白,如neustin、NeuN、NF-M、TuJ-1和NSE.统计显示81%细胞NeuN染色阳性,75%细胞TuJ-1染色阳性,47%染色NF-M阳性,90%染色NSE阳性.结论:β-ME和BHA能够诱导体外培养的人FL CD34 细胞分化为具有神经细胞特异性抗原和成分的神经样细胞;胚胎肝细胞具有向神经组织分化的潜能.     

人CD34^＋和CD34^-细胞在NOD／SCID小鼠体内的造血重建

利用非肥胖糖尿病型重症联合免疫缺陷型(NOD/SCID)小鼠模型,比较了新鲜及培养后的CD34 和CD34-细胞在体内植入及重建造血能力.从新鲜脐血及培养后的单个核细胞(MNC)中分离出CD34 和CD34-细胞,经尾静脉输注入经亚致死剂量照射的NOD/SCID小鼠体内,6周后处死存活的小鼠,取其骨髓、脾脏和外周血细胞,分别进行细胞表型分析、造血集落形成单位和人特异性基因的检测.经检测,输注CD34' 细胞和混合细胞的小鼠,其体内CD45 细胞及人源各系血细胞的含量相近,两者均远远高于输注CD34-细胞的小鼠.输注培养后CD34-细胞的小鼠饲养6周后全部死亡,输注培养后CD34 细胞的小鼠存活率约为66.7%,而输注培养后混合细胞的小鼠全部存活,且在两组存活的小鼠体内均能检测到CD45 细胞及人源各系血细胞.结果表明:无论是新鲜还是培养后的CD34 细胞均具有在NOD/SCID小鼠体内植入和重建造血能力,而CD34-细胞不具有该能力,但CD34-细胞与CD34 细胞同时输注有助于提高小鼠的存活率,说明其对CD34 细胞在小鼠体内发挥植入和造血重建能力有一定的辅助作用.     

人骨髓CD34^＋造血细胞体外扩增形成HPP—CFC造血祖细胞的能力

目的和方法：高增殖潜能集落形成细胞（ＨＰＰＣＦＣ）是表达ＣＤ３４＋ＤＲＬｉｎ－的最早期造血祖细胞之一,它在体外的增殖分化能力可反映造血干细胞的某些特征。结果：本文研究了人正常骨髓ＣＤ３４＋造血细胞在体外扩增和形成ＨＰＰＣＦＣ的能力。利用ＣＩＭＳ１００免疫磁性分离术首先获得＞９０％的ＣＤ３４＋造血细胞以富集ＨＰＰＣＦＣ。在含有Ｅｐｏ＋ＧＭＣＳＦ＋ＩＬ３＋ＩＬ６＋ＳＣＦ（简ＥＧＩＩＳ）的无基质液培条件下,ＣＤ３４＋造血细胞在四周内可持续产生单个核细胞和ＨＰＰＣＦＣ,并使其总量最高可达１７７０倍和８倍,以第２和３周为最佳时期,但不同个体ＣＤ３４＋造血细胞的这种能力差别较大。结论：高度纯化的人骨髓ＣＤ３４＋造血细胞能够在含有最佳组合造血生长因子的无基质液培条件下持续扩增,为临床应用提供了重要依据。     

体外培养脐血单个核细胞与CD34+富集细胞

对比MNC和CD34⁺富集细胞在SCF+IL-3+IL-6+FL+Tpo细胞因子组合下的体外扩增特性,发现：CD34⁺富集细胞具有很高的扩增潜力,在本实验条件下其总细胞持续扩增了8周,扩增倍数达31270.9±8640.5倍;而MNC在培养至第4周扩增就已呈现下降趋势,最大仅扩增了53.3±6.2倍。对比集落和CD34⁺细胞的扩增发现,MNC的集落密度和CD34⁺细胞含量由第0天至第7天有一个上升的过程,而CD34⁺富集细胞在培养过程中,集落密度和CD34⁺细胞含量却始终呈下降趋势。在体外培养过程中,CD34⁺富集细胞的CFU-GM和CD34⁺细胞最大分别扩增了185.7±14.1和191.7±188.8倍,明显高于MNC的12.4±3.2和50.6±33.2倍;而CD34⁺富集细胞和MNC的BFU-E则只实现了少量扩增,分别为7.2±5.2和10.1±3.4倍。结果显示,从CD34⁺富集细胞出发扩增造血干/祖细胞,可以得到更多的CD34⁺细胞和CFU-GM集落形成细胞。      

喘可治注射液对小鼠体外CD4+CD25+T细胞的影响

利用荧光抗体标记和流式细胞术检测喘可治对刀豆蛋白A(ConA)诱导的T细胞CD69和CD25表达的影响,研究喘可治是否具有促进CD4 CD25 调节性T细胞升高的作用.结果发现喘可治对ConA诱导的T细胞活化标志分子CD69的表达具有抑制作用,但对CD25的表达具有促进作用.说明喘可治对T细胞活化具有抑制作用,CD25表达的上调并不是由活化引起的,而很可能是CD4 CD25 Tr水平升高的标志.     

CD4+CD25+调节性T细胞作用机制的双模式

CD4 CD25 调节性T细胞是具有免疫抑制功能的细胞群,在多种生理病理过程中发挥了重要作用。它们的作用机制主要包括细胞-细胞接触依赖和可溶性细胞因子介导两种抑制模式。由于CD4 CD25 调节性T细胞的抑制机制复杂,争议较大,进一步阐明它们的作用机制将有利于多种免疫相关疾病的防治。     

血小板生成素诱导胎肝CD34~ 造血干/祖细胞增殖分化与周期蛋白表达的关系

为了解胚胎时期巨核细胞增殖分化特有的内在机制 ,本研究观察了在体外培养体系中 ,胎肝源CD3 4 造血干 /祖细胞在血小板生成素 (thrombopoietin ,TPO)作用下增殖分化特征与相关周期蛋白B1、D1和D3表达及细胞内水平变化的关系。结果发现 :( 1)经 12d培养后 ,TPO使胎肝源CD3 4 细胞数从 1× 0 5个细胞 /ml增加到 13 12± 4 0 6× 10 5个细胞 /ml,CD4 1 细胞增加到了 95 % ,CD3 4 细胞下降到了 3 % ,大部分细胞的DNA倍性为 2N ,少数为 4N ,无大于 4N巨核细胞 ,TPO对MegaCultTm C胶原半固体培养体系中胎肝源CD3 4 细胞形成CFU Mk集落产率的影响呈明显的剂量效应关系 ;( 2 )在整个培养期间 ,周期蛋白B1表达逐渐增加 ,并保持在一个高水平上 ,培养后期 ,高水平的周期蛋白B1出现在G1期细胞上 ;( 3 )周期蛋白D1和D3表达先增加 ,培养后期细胞内水平下降 ,且以G2期细胞为主。该结果提示 :( 1)TPO通过上调周期蛋白B1和在所有细胞周期时限上调周期蛋白D1和D3表达 ,促进巨核细胞祖细胞的增殖分化 ;( 2 )周期蛋白B1在G2 M期的持续高水平和周期蛋白D1和D3在G2 M期的水平下降 ,可能导致胎肝源巨核细胞核内有丝分裂延迟或阻滞。