6A型肺炎球菌结合物分子大小对小鼠免疫原性的影响

目的 比较不同分子大小的6A型肺炎球菌(serotype 6A Streptococcus Pneumoniae )结合物和佐剂吸附在小鼠体内免疫原性的影响。方法 通过乙酸水解降低6A型荚膜多糖的相对分子质量制备成水解物,水解物经1-氰基-4-二甲胺基吡啶四氟硼酸盐(CDAP)活化并与破伤风类毒素己二酸酰肼衍生物TT AH 结合,制备成结合物。用Sepharose 4 Fast Flow 纯化结合物,并根据化学检测结果将结合物分为 K D 0.0~0.2、 K D 0.2~0.4、 K D 0.4~0.6等3个组分,每个组分分别以磷酸铝佐剂吸附,将吸附前后的各个组分按照每针次每只小鼠0.2 μg分别免疫小鼠,并采用ELISA检测结合物在小鼠体内的抗体水平。结果 3种不同相对分子质量吸附前后的结合物在小鼠体内均能产生较高水平的抗体,各组2、3针之间具有明显的加强效应。在吸附组和未吸附组中,3种不同分子大小的结合物在小鼠体内产生抗体水平无明显差异。各组分佐剂吸附后的结合物血清抗体滴度高于未吸附组,但这种差异无统计学意义( P > 0.05)。结论 结合物的分子大小对小鼠体内抗体水平的产生没有明显影响;磷酸铝佐剂吸附对于不同分子大小的结合物在小鼠体内的免疫原性有一定的增强效应,但这种增强效应差异无统计学意义。     

C群脑膜炎球菌多糖-rP64K结合物的制备及免疫原性

用1-氰基-4-二甲基氨基吡啶·四氟化硼(CDAP)活化C群脑膜炎球菌多糖(GCMP),以己二酰肼(ADH)作为连接子,与重组B群脑膜炎球菌外膜蛋白64 KD(rP64K)在碳二亚胺的(EDAC)作用下结合,制备GCMP-P64K结合物。纯化后免疫NIH小鼠,用间接ELISA法检测小鼠血清中抗GCMPIgG抗体水平,并GCMP-TT结合物比较载体诱导的免疫抑制。所制备多糖-蛋白结合物(GCMP-P64K)保持了GCMP抗原特异活性,结合物免疫小鼠后可诱生比多糖单独免疫更高水平的GCMP血清IgG抗体,并能形成免疫记忆,为研究理想载体蛋白提供了新的思路。     

A群奈瑟氏脑膜炎球菌荚膜多糖-破伤风类毒素结合疫苗的制备及其免疫原性研究

采用溴化氰(CNBr)活化多糖,以无水己二酸二肼(ADH)作为连接剂,1乙基13(3二甲基氨基丙基)碳化二亚胺(EDAC)为偶联剂制备A群奈瑟氏脑膜炎球菌荚膜多糖(GAMP)与破伤风类毒素(TT)的结合物,经皮下免疫NIH小鼠,用ELISA检测小鼠血清中抗GAMP及抗载体蛋白的IgG抗体水平。用补体介导的体外杀菌试验检测血清中GAMP抗体的杀菌活性。结果显示,实验中制备的多糖衍生物和多糖蛋白质结合物都具有GAMP抗原特异活性。结合物免疫小鼠后可诱生比多糖单独免疫更高水平的GAMP血清IgG抗体,并能形成免疫记忆,产生再次应答。结合物免疫小鼠所诱生的血清GAMP抗体较之多糖组具有更强的体外杀菌活性。表明此方法制备的结合物可获得优于多糖的、稳定的特异免疫原性。     

不同剂量肺炎链球菌荚膜多糖与蛋白结合物的免疫原性比较

用肺炎链球菌19F型、23F型的荚膜多糖(C-PS)分别和破伤风类毒素(TT)蛋白结合,制备了两个型别的多糖-蛋白结合物(19F-TT,23F-TT)。为探讨结合物的最适免疫剂量,以10μg多糖和含1μg、3μg、9μg、27μg多糖的结合物经腹腔免疫NIH小鼠,ELISA方法检测小鼠血清中多糖和含不同多糖的结合物所产生的特异性IgG抗体。结果在不同的剂量免疫小鼠后,3μg剂量组在免疫三针后可诱生高浓度的抗体,但随着免疫剂量的增加,9μg与27μg诱生的抗体浓度较3μg诱生的抗体浓度之间并无显著性差异。含多糖3μg的19F型和23F型多糖蛋白结合物剂量组可诱生高浓度的特异性IgG抗体。     

不同剂量伤寒Vi多糖蛋白结合疫苗在小鼠体内诱导的抗体水平分析

目的研究伤寒Vi多糖蛋白结合疫苗免疫效果及不同剂量伤寒Vi多糖蛋白结合疫苗在小鼠体内诱导的抗体水平,以确定合适的免疫剂量。方法将150只清洁级NIH雌性小鼠随机分为5组,分别为A组(0.625μg结合疫苗组)、B组(1.250μg结合疫苗组)、C组(2.500μg结合疫苗组)、D组(2.500μg多糖组)及阴性组(10mmol/L PBS),每组30只;另领取10只为空白对照(不接种)。A、B、C、D组及阴性组小鼠经腹股沟皮下注射,剂量0.1 m L/只,每隔2周免疫1次,共免疫3次,每次免疫后第7天采血。采用ELISA检测小鼠血清抗体效价,同时对不同剂量伤寒Vi多糖蛋白结合疫苗在小鼠体内诱导的抗体效价进行分析比较。结果与D组相比,A、B、C三组诱导的抗体水平与之均有统计学意义(P<0.05);A组与B组、A组与C组之间的抗体水平也具有统计学意义(P<0.05),而B组与C组之间的抗体水平无统计学意义(P>0.05)。说明与多糖疫苗相比,伤寒Vi多糖蛋白结合疫苗能够诱导更高的抗体水平,且具有明显的剂次加强效应。同时证明1.250μg的伤寒Vi多糖蛋白结合疫苗可诱导与2.500μg伤寒Vi多糖蛋白结合疫苗相同的抗体水平。结论伤寒Vi多糖蛋白结合疫苗的两种免疫剂量在小鼠体内可诱导相同的抗体水平,在选择接种剂量时,可致免疫应答的无统计学意义的低剂量可能是较为经济和安全的选择。     

W135群脑膜炎球菌结合物小鼠免疫血清IgG抗体亚类和亲合力的检测

目的通过检测W135群脑膜炎球菌结合物(简称W135群结合物)小鼠免疫血清中IgG抗体亚类及IgG抗体亲合力,判断W135群结合物的免疫应答特征。方法 (1)免疫血清的制备:将NIH雌性小鼠随机分为3组(A组、B组、对照组),每组30只。A组采用含2.5μg多糖的PSW135CNBr-TT分别于0、2、4、8周腹股沟皮下注射小鼠;B组采用含2.5μg多糖的PSW135CNBr-TT分别于0、4、8周腹股沟皮下注射小鼠;对照组采用含2.5μg多糖的PSW135分别于0、2、4周腹股沟皮下注射小鼠。分别于每次免疫7 d后,经小鼠眼眶静脉采血,分离血清备用;(2)IgG抗体亚类和亲合力的检测:采用间接ELISA分析各组免疫血清中IgG抗体及IgG抗体亚类含量;采用单一浓度的硫氰酸钾溶液作为洗脱液,用间接ELISA测定免疫血清中IgG相对亲合力。结果 A组和B组获得的小鼠免疫血清,IgG抗体均以IgG1为主(占总IgG抗体的80%以上),IgG抗体及其亚类抗体含量均呈典型的剂次加强效应;对照组各针次免疫血清中的IgG3抗体含量所占比例最高,未见免疫剂次加强效应。A组IgG抗体的相对亲合力分别是46.6%、25.4%、17.6%和47.6%,B组IgG抗体的相对亲合力分别是46.6%、23.6%和48.3%,对照组IgG抗体的相对亲合力分别是92.4%、81.9%和81.0%。结论 W135群结合物小鼠免疫血清呈现典型的胸腺依赖性(thymus dependent,TD)抗原的免疫应答特征。     

C群奈瑟氏脑膜炎球菌荚膜多糖-TT结合疫苗的制备及其在小鼠体内免疫原性的研究

将C群脑膜炎球菌荚膜多糖以ADH作为间隔剂与TT结合形成GCMP-TT结合疫苗,然后用此结合疫苗免疫NIH小鼠,结果显示使用GCMP免疫小鼠后仅能产生较低水平抗GCMP的IgG抗体,而用GCMP-TT免疫后小鼠血清中产生了较GCMP免疫显著增高抗GCMP的IgG抗体,并且GCMP-TT组第二次和第三次免疫后与初次免疫相比,IgG抗体水平均有显著升高(P<0.01),表明GCMP-TT结合疫苗具有免疫记忆和再次免疫加强应答效应。补体介导的血清抗体体外杀菌试验结果证明,GCMP-TT结合疫苗组免疫小鼠诱导的抗体IgG比GCMP组具有增强的体外杀菌活性。     

SEA为载体蛋白的A/C群脑膜炎奈瑟菌结合物初步免疫效果评价

目的对以金黄色葡萄球菌肠毒素A(staphylococcal enterotoxin A,SEA)为载体蛋白的A/C群脑膜炎奈瑟菌结合物的免疫效果进行初步评价。方法采用1-氰基-4-二甲氨基-砒啶四氟硼酸(1-cyano-dimethylamino pyridiniumtetrafluoroborate,CDAP)活化法,将SEA、破伤风类毒素(tetanus toxin,TT)分别与A群脑膜炎奈瑟菌荚膜多糖(group A N.meningitidis capsular polysaccharide,GAMP)、C群脑膜炎奈瑟菌荚膜多糖(group C N.meningitidis cap-sular polysaccharide,GCMP)结合制备结合物;将结合物分别免疫BALB/c小鼠,腹部皮下免疫3次,于第1针免后第9天、第19天、第27天眼眶采血,分离血清备用;检测体液免疫及细胞免疫反应水平。结果 SEA与GAMP结合后能增强抗-GAMP Ig G抗体水平,第3次免后GAMP-SEA组多糖抗体水平达到1∶12 800,高于GAMP组1∶400,但GCMP-SEA组结果不理想。SEA与GAMP结合后均能激发细胞免疫反应,IFN-γ和IL-4的SFC与GAMP组比较均升高,且IFN-γ高于IL-4。SEA与GAMP、GCMP结合后Th1/Th2细胞亚群比值分别达到23.48和22.19,高于GAMP组(14.09)和GCMP组(16.73),差异有统计学意义(P0.05),提示SEA与GAMP、GCMP结合后可激发细胞免疫。结论 SEA与GAMP、GCMP结合后既能增强GAMP、GCMP的免疫原性,提高体液免疫反应,又能激发细胞免疫反应,提示SEA具备作为A/C群脑膜炎奈瑟菌结合疫苗载体蛋白的可行性。     

DTaP-Hib联合疫苗中Hib-TT免疫原性研究

考查DTaP-Hib联合疫苗中Hib-TT的免疫原性,对其剂量、免疫持久性和抗原相容性进行分析。将不同剂量的Hib-TT、DTaP-Hib联合疫苗分别免疫小鼠,设单价的Hib-TT结合疫苗为对照,末次免疫后1、2、4、6、8、10w分别采集血清测定血清中Hib多糖抗体滴度。结果显示,不同剂量的Hib-TT和DTaP疫苗联合后均具有较好的免疫原性,血清中Hib多糖抗体阳转率达100%,并具有剂量效应和较好的免疫持久性。2.5μg剂量Hib-TT的DTaP-Hib联合疫苗免疫小鼠后1~2w诱导产生的Hib多糖抗体水平显著性地低于单价Hib-TT(P<0.05),4~10w,二者的Hib多糖抗体水平无显著性差异(P>0.05)。5μg剂量Hib-TT的DTaP-Hib联合疫苗在免疫小鼠后1w诱导产生的Hib多糖抗体水平与单价2.5μg剂量Hib-TT无显著性差异(P>0.05),免后2~10w则显著性地高于单价2.5μg剂量Hib-TT(P<0.001)。Hib-TT和DTaP疫苗联合后,仍然具有较好的免疫原性、剂量效应和免疫持久性;其抗原性干扰只是暂时的。     

6A型肺炎链球菌荚膜多糖水解物的制备及其结合物在小鼠体内免疫原性研究

目的制备6A型肺炎链球菌荚膜多糖(PS6A)水解物及其结合物,研究结合物在小鼠体内的免疫原性。方法在60℃水解温度下,筛选出PS6A水解适宜的醋酸水解浓度和水解时间。通过水解物和原糖(PS6A)的核磁共振氢谱(1H NMR)和磷谱(31P NMR)比较验证水解物结构的正确性。以1-氰基-4-二甲胺基吡啶四氟硼酸盐(1-Cyano-4-(dimethylamino)pyridinium tetrafluoroborate,CDAP)活化水解物的羟基,并与破伤风类毒素己二酸酰肼衍生物(TTAH)结合,制备结合物PS6A-TTAH;并检测结合物的理化性质。通过抑制ELISA分析原糖、水解物和结合物的抗原性。将小鼠分为2组(PS6A组和PS6A-TTAH组),分别免疫3剂次,用间接ELISA分析原糖和结合物在小鼠体内的免疫原性。结果多糖经0.2 mol/L醋酸60℃水解8 h后,其相对分子质量大小(KD)由0.03升高为0.51,重均相对分子质量(Mw)由8.127×10~5g/mol降为1.175×10~5g/mol。核磁共振结果表明,各特征质子的化学位移相比原糖未发生改变。结合物的游离多糖质量分数为4.55%,游离载体蛋白质质量分数为1.08%。抑制ELISA结果显示,水解物、结合物的抑制曲线与原糖基本吻合。PS6A-TTAH组有剂次加强效应(P分别为0.001、0.004和0.001),其第1~3针免后IgG抗体水平均高于PS6A组,差异均具有统计学意义(P分别为0.001、0.002和0.001)。结论制备的PS6A水解物能有效的保留天然多糖的特异基团,以此水解物制备的结合物在小鼠体内具有良好的免疫应答。