硫氧还蛋白还原酶缺陷的大肠杆菌宿主促进含半胱氨酸残基的重组蛋白可溶性表达

以人工设计的,不含半胱氨氨酸残基的三元蛋白,六聚和八聚鲑鱼降钙素融合蛋白和人尿激酶原等不同半胱氨酸残基含量的外源蛋白质为例,利用大肠杆菌硫氧还蛋白还原酶基因缺陷菌GH980（DE3 trxB^-）,探索把以包涵体形式表达的外源蛋白质变为可溶性表达的可能性及其规律。研究表明：由于硫氧还蛋白还原酶基因的缺陷所引超的细胞质氧化还原态势的变化,使一些在普通大肠杆菌宿主中以包涵 形式表达,含有半胱氨酸残基的重组蛋白,在GJ980中能在一定程度上以可溶性蛋白质形式表达;不含有半胱氨酸残基的重组蛋白在GJ980中仍以包涵体形式表达,推测重组蛋白在GJ980细胞质中形成二硫键对其正确构象的形成具有一定的作用。     

无标签重组人硫氧还蛋白的大规模表达、纯化及活性检测

目的:利用基因工程的方法原核表达无标签的重组人硫氧还蛋白(rhTrx)并对其进行大规模表达、纯化和鉴定.方法:从人胚胎肾HEK293细胞中提取总RNA,反转录合成cDNA,经PCR扩增、酶切后连入pET-22b(+)载体构建重组质粒,重组质粒转化大肠杆菌BL21( DE3)感受态细胞,IPTG诱导表达,经两步离子交换层析纯化重组蛋白,采用SDS-PAGE、Western blotting、HPLC、MALDI-TOF-MS及经典的胰岛素二硫键还原法对重组蛋白进行鉴定.结果:构建成功了rhTrx基因表达载体;实现了rhTrx在原核细胞中的可溶性表达;纯化出的蛋白经SDS-PAGE和Western blotting分析证实为rhTrx;HPLC和MALDI-TOF-MS分析表明,纯化出的目的蛋白纯度大于95％;胰岛素二硫键还原法证实纯化出的rhTrx具有生物学活性.结论:成功构建了rhTrx的原核表达体系,建立了rhTrx的纯化和鉴定方法,为其进一步的理论研究和生产开发提供了有效基础数据.     

大肠杆菌I型分泌表达系统研究进展及提高蛋白表达量的策略

大肠杆菌是表达重组蛋白最常用的宿主之一。利用大肠杆菌分泌途径胞外表达重组蛋白具有可促进蛋白正确折叠,有效减少包涵体形成,简化纯化工序等诸多优势,近年来备受关注。其中,大肠杆菌I型分泌途径具有分泌表达速度快,蛋白活性高,对宿主代谢无影响等特点,是目前应用最广泛的分泌途径之一。综述了大肠杆菌I型分泌系统的元件组成和分泌机理及提高I型分泌系统蛋白表达量的有效策略,为重组蛋白生产应用提供了理论依据。     

大肠杆菌二硫键氧化还原酶

真核生物中正确二硫键的形成是在内质网中由二硫键异构酶PDI及相关蛋白催化的,而在原核生物大肠杆菌中二硫键的氧化、还原和异构化发生在细胞周质,由一系列的二硫键氧化还原酶完成。从1991年Badewell发现第一个氧化还原蛋白DsbA开始,目前已发现有七种二硫键氧化还原酶。DsbB、DsbD、DsbE/CcmG及CcmH位于细胞膜上,DsbA、DsbC、DsbG在细胞周质空间中。DsbA和DsbB的氧化和电子传递链相联系,而DsbC、DsbD、DsbE、DsbG和CcmH的还原需要来自细胞质的电子传递。     

大肠杆菌二硫键氧化还原酶

真核生物中正确二硫键的形成是在内质网中由二硫键异构酶PDI及相关蛋白催化的,而在原核生物大肠杆菌中二硫键的氧化、还原和异构化发生在细胞周质,由一系列的二硫键氧化还原酶完成.从1991年Badewell发现第一个氧化还原蛋白DsbA开始,目前已发现有七种二硫键氧化还原酶.DsbB,DsbD、DsbE/CcmG及CcmH位于细胞膜上,DsbA、DsbC,DsbG在细胞周质空间中.DsbA和DsbB的氧化和电子传递链相联系,而DsbC、DsbD,DsbE,DsbG和CcmH的还原需要来自细胞质的电子传递.     

HBV PreS2-MBP融合蛋白在大肠杆菌不同部位的表达

目的:分析比较HBV PreS2蛋白在大肠杆菌细胞周质和细胞质中的融合表达情况。方法:构建大肠杆菌细胞周质中融合表达HBV PreS2蛋白的载体pMAL-P2x/S2和细胞质中融合表达载体pMAL-C2x/S2,IPTG诱导表达,产物经SDS-PAGE和Western Blot检测,分析HBV PreS2-MBP融合蛋白在菌体不同部位的表达情况及表达产物的存在形式。结果:细胞周质中表达的融合蛋白有一部分被降解了,而细胞质中表达出了完整的融合蛋白。细胞质中表达的融合蛋白以包涵体和可溶性蛋白两种形式存在。结论:HBV PreS2-MBP融合蛋白适合在大肠杆菌细胞质中表达。     

包涵体蛋白体外复性的研究进展

外源基因在大肠杆菌中高水平表达时 ,通常会形成无活性的蛋白聚集体即包涵体。包涵体富含表达的重组蛋白 ,经分离、变性溶解后须再经过一个合适的复性过程实现变性蛋白的重折叠 ,才能够得到生物活性蛋白。近年来 ,发展了许多特异的策略和方法来从包涵体中复性重组蛋白。最近的进展包括固定化复性以及用一些低分子量的添加剂等来减少复性过程中蛋白质的聚集 ,提高活性蛋白的产率。     

重组芋螺毒素His-Xa-MrVIB分泌表达研究

[目的]利用简单快速的基因工程法来生产富含二硫键的芋螺毒素Mr VIB,寻找有效合成具有天然活性芋螺毒素的新途径。[方法]人工设计合成芋螺毒素Mr VIB基因引物来构建表达载体p ET22b(+)/His-Xa-Mr VIB,将其转化大肠杆菌BL21(DE3)plys S进行诱导表达。再利用Ni-NTA琼脂糖柱进行亲和层析纯化重组蛋白,Tricine-SDS-PAGE电泳分析重组蛋白表达形式。[结果]重组芋螺毒素His-Xa-Mr VIB(r His-Xa-Mr VIB)在大肠杆菌中获得有效分泌表达,经一步亲和层析获得纯度大于90%的重组芋螺毒素。[结论]基因工程方法能够有效分泌表达芋螺毒素Mr VIB,解决化学合成芋螺毒素产量低、成本高、难以纯化等问题。     

蜘蛛多肽毒素JZTX-51和JZTX-26的重组表达和纯化

为建立一种简便、快速且能大量获得富含二硫键的蜘蛛多肽毒素JZTX-26 (35 aa)和JZTX-51 (27 aa)的有效方法,利用PCR的方法克隆成熟肽编码基因并插入至大肠杆菌Escherichia coli表达载体pMAL-p2x中与MBP(麦芽糖结合蛋白)标签融合,构建重组表达质粒pMAL-jz26和pMAL-jz51。在受体菌TB1和BL21(DE3)中对两个重组表达质粒分别进行IPTG诱导表达,通过Amylose亲和层析柱纯化并进行SDS-PAGE分析;采用因子X对融合蛋白进行酶切后通过分子筛以及反相高效液相色谱对两种重组蛋白进行纯化。通过MALDI-TOF-TOF质谱鉴定,表达产物的分子量与预期的多肽理论分子量一致。1L表达培养液中能获得大约5mg纯化的目的蛋白JZTX-26或JZTX-51。结果表明利用该原核表达体系可对蜘蛛毒素基因jztx-26和jztx-51进行融合表达,并对重组蛋白进行亲和层析,为采用基因工程的手段大量获得蜘蛛多肽毒素奠定了基础。     

梅毒螺旋体硫氧还蛋白的原核表达、纯化及抗氧化活性分析

本研究利用生物信息学方法预测梅毒螺旋体(Treponema pallidum,Tp)Trx蛋白的生物学性质。Trx蛋白无信号肽,定位在细胞质。二级结构无规卷曲占41.9%,β片层为55%,使用枯草芽胞杆菌Trx蛋白结构(PDB:2gzz.1.A)进行同源建模,获得Trx蛋白三级结构。根据TpTrx基因序列设计引物,以TpDNA为模板,PCR扩增得到大小为318 bp的Trx基因,然后将其连接到pET30a构建重组质粒pET30-Trx,将该重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),得到重组菌大肠杆菌。利用IPTG诱导目的蛋白表达,该质粒编码的重组Trx蛋白分子量约为16 kDa。使用Ni~(2+)亲和层析纯化获得重组Trx蛋白,发现Trx蛋白具有二硫键还原酶活性。利用菌落计数法观察重组大肠杆菌在H_2O_2胁迫下的存活率,发现能表达Trx蛋白的大肠杆菌存活率高于对照。本研究利用生物信息学方法分析了TpTrx蛋白的性质,并发现它具有抗氧化功能,本研究为解析Tp的抗氧化机制提供实验依据。