大肠杆菌亮氨酰tRNA合成酶基因的克隆和鉴定

本文根据遗传互补原理,利用肠杆菌亮氨－ｔＲＮＡ合成酶基因的温度敏感突变株ＫＬ２３１,从大肠杆菌基因文库－克隆中筛选出带完整ＬｅｕＳ基因的ＤＮＡ片段。该片段长长度为３．２ｋｂ。对此片段做了１４种限制性内切酶图谱分析和部分ＤＮＡ序列鉴定,并与文献报道的ＬｅｕＳ基因序列进行了比较。发现在编码区和３＇端非编码区各有一对碱基发生了转换,另外在３＇端非编码区有一对碱基缺失。编码区的碱基对转换导致编码的氨基酸由     

编码大肠杆菌精氨酰—tRNA合成酶的基因（argS）拥？…

编码大肠杆菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）精氨酰－ｔＲＮＡ合成酶（ＡｒｇＲＳ）的基因（ａｒｇＳ）和编码亮氨酰－ｔＲＮＡ合成酶（ＬｅｕＲＳ）的基因（ＬｅｕＳ）分别插入ｐＵＣ１８后,各自在Ｅ．ｃｏｌｉ ＴＧ１转化子中的表达有很大的差异（高表达倍数分别为１０００和３５倍）。为了调查造成其表达差异的原因,用ａｒｇＳ的５＇上游非编码区取代ｌｅｕＳ的５＇上游非编码区,构建了融合基因ｐａｒｇ－ｌｅｕＳ;将它插入质粒ｐＵＣ１８     

大肠杆菌JM83精氨酰－tRNA合成酶基因的克隆、测序及表达

用聚合酶链反应（ＰＣＲ）以大肠杆菌ＪＭ８３基因组ＤＮＡ为模板,扩增了精氨酰－ｔＲＮＡ合成酶（ＡｒｇＲＳ）基因。将该基因重组到载体ｐＵＣ１８上转化到大肠杆菌ＴＧ１中,得到在转化子中ＡｒｇＲＳ的高表达。粗抽液中ＡｒｇＲＳ的氨酰化活力,ＴＧ１和ＴＧ１转化子分别为１．６５Ｕ／ｍｇ和２１０Ｕ／ｍｇ,后者为前者的１２７倍。ＤＮＡ顺序测定表明,与从大肠杆菌ＪＡ２００中克隆到的ＡｒｇＲＳ基因相比９１３位碱基为Ａ而不为Ｃ,这种变化使ＡｒｇＲＳ的３０５位氨基酸残基由Ｇｌｎ变为Ｌｙｓ,但这种改变不影响酶的活力。     

大肠杆菌JM83精氨酰—tRNA合成酶基因的克隆,测序及表达

用聚合酶链反应（ＰＣＲ）以大肠杆菌ＪＭ８３基因组ＤＮＡ为模板,扩增了精氨酰ｔ－ＲＮＡ合成酶基因,将该基因重组到载体ｐＵＣ１８上转化到大肠杆菌ＴＧ１中,得到在转化子中ＡｒｇＲＳ的高表达。精抽液中ＡｒｇＲＳ的氨酰化活力,ＴＧ１和ＴＧ１转化子分别为１．６５Ｕ／ｍｇ。后者为前者的１２７倍,ＤＮＡ顺序测定表明,与从大肠杆菌ＪＡ２００中克隆到的ＡｒｇＲＳ基因相比９１３位碱基为Ａ而不为Ｃ,这种变化使ＡｒｇＲＳ的     

大肠杆菌亮氨酰—tRNA合成酶基因表达和酶的纯化

在克隆含大肠杆菌氨酰－ｔＲＮＡ合成酶基因的３．２ｋｂＤＮＡ片段,并ｌｅｕＳ在大肠杆菌和中高表达提高３５倍的基础上ｌｅｕＳ改造,分别将两处不同长度的ｌｅｕＳ１和ｌｅｕＳ２分别构建在表达载体ＰＫＫ－２３３－２和ｐＴｒｃ－９９Ｂ中,其中ｌｅｕＳ１比ｌｅｕＳ２多一段１３０ｂｐ的３非翻译区。构建在表达载体ｐＴｒｃ－９９Ｂ中的基因片段ｌｅｕ３２可将酶的表达量提高１３５倍,经ＤＥＡＥ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ和ＨＡ－     

大肠杆菌tRNA~(Leu)的提取、纯化及性质研究

采用高表达大肠杆菌ｔＲＮＡＬｅｕ菌株提取、纯化了亮氨酸等受体转移核糖核酸ｔＲＮＡＬｅｕ１和ｔＲＮＡＬｅｕ２．利用稳态动力学手段研究了ｔＲＮＡＬｅｕ１及脱镁ｔＲＮＡＬｅｕ１在不同稀土离子作用下与纯化亮氨酰－ｔＲＮＡ合成酶的氨酰化作用．ｔＲＮＡＬｅｕ１与亮氨酰－ｔＲＮＡ合成酶的结合及催化效率均受参与稀土离子的影响,表观Ｋｍ值有较明显的变化．结果表明,亮氨酰－ｔＲＮＡ合成酶催化的ｔＲＮＡＬｅｕ１氨酰化反应所需Ｍｇ２＋能够被稀土离子取代,但亲合性能不同．     

一个高效表达,快速纯化大肠杆菌精氨酰—tRNA合成酶的 …

编码大肠杆菌精氨酸－ｔＲＮＡ合成酶的基因ａｒｇＳ被克隆到ｐＭＦＴ７－５载体上。将此质粒转化的大肠 力ＪＭ１０９（ＤＥ３）中,该转化子粗抽液的比活是宿主菌的２５００倍。通过ＤＥＡＥ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ－６Ｂ ＦａｓｔＦｌｏｗ和ＢｌｕｅＳｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ－６Ｂ两步柱层析在一天内即可将精氨酰－ｔＲＮＡ合成酶纯化至电泳一条带,比活为３６０００ｕ／ｍｇ,总收率可达６９％。     

大肠杆菌亮氨酰—tRNA合成酶LeuRS67R的纯化及其动力学研究

本实验室已得到的亮氨酰－ｔＲＮＡ合成酶基因,与文献相比,６７位氨基酸残基由Ｈｉｓ变为Ａｒｇ,此酶被定名为ＬｅｕＲＳ６７Ｒ。我们从该基因与ｐＵＣ１９重组质粒的大肠杆菌ＴＧ１转化子ＴＧ１－９１中得到ＬｅｕＲＳ的高表达,粗抽液中ＬｅｕＲＳ的表达量在转化子中比在宿主菌ＴＧ１中高２０倍以上。用三步柱层析得到电泳一条带的酶,其比活为１７８９单位／毫克。测定其动力学常数,氨酰化活力为Ｌｅｕ、ＡＴＰ的Ｋｍ值分别为     

大肠杆菌精氨酰—tRNA合成酶的Lys306为酶活力所必需

将大肠杆菌精氨酰ｔＲＮＡ合成酶（ＡｒｇＲＳ）上Ｌｙｓ３０６用基因点突变的方法分别变为Ａｌａ和Ａｒｇ的密码子,得到变种基因ａｒｇｓ３０６ＫＡ和ａｒｇｓ３０６ＫＲ。变种基因重组在ｐＵＣ１８上,转化到大肠杆菌ＴＧ１中,转化子中ＡｒｇＲＳ及其变种ＡｒｇＲＳ３０６ＫＡ和ＡｒｇＲＳ３０６ＫＲ所表达的蛋白量生活为ＴＧ１表达ＡｒｇＲＳ蛋白量的１００倍。细胞粗抽提液中ＡｒｇＲＳ的比活ＴＧ１,转化子ｐＵＣ１８－ａｒｇ     

线粒体tRNA^Trp的原核起源

构建了３种来源于水稻、人和啤酒酵母的线粒体ｔＲＮＡ＾Ｔｒｐ基因。实验表明这些线粒体ｔＲＮＡ＾Ｔｒｐ的体外转录产物具有被枯草杆菌色氨酰－ｔＲＮＡ合成酶（ＴｒｐＲＳ）氨酰化的能力,但是不能被鼠肝来源的氨酰ｔＲＮＡ合成酶粗酶所催化。动力学资源常数测定表明枯草杆菌ＴｒｐＲＳ对线粒体ｔＲＮＡ＾Ｔｒｐ的亲和力为野生型ｔＲＮＡ＾Ｔｒｐ的一半,而在催化效率上,水稻和啤酒酵母线粒体ｔＲＮＡ＾Ｔｒｐ的色氨酰化能力比野     

基因系统生态及其应用

运用基因生态系统观点,探讨了基因的行为生态,提出了基因具有整体性、联系性、有序性和平衡性等特性．还讨论了基因生态的应用及其发展前景．     

人血小板生成素重组载体的构建与体外表达

应用基因克隆技术,以人ＴＰＯｃＤＮＡ为目的基因,构建真核细胞表达重组体ＶＲＴＰＯ,藉脂质体将其转染于ＮＩＨ３Ｔ３细胞,应用ＰＣＲ、ＲＴ－ＰＣＲ及Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹等技术对其转染及表达情况进行鉴定．结果表明：ＶＲＴＰＯ构建成功,在ＮＩＨ３Ｔ３细胞可表达人ＴＰＯ,为应用人ＴＰＯｃＤＮＡ进行质粒ＤＮＡ骨骼肌直接注射于动物体内的基因治疗研究奠定了基础     

多倍体植物中基因表达模式的变化

植物杂交和多倍化能导致基因组结构发生变化,并显著影响了基因表达,因此认为杂交和多倍化是促进植物进化的一个重要力量。近些年大量的研究表明植物多倍化后基因表达模式发生了复杂的改变,包括基因沉默、基因表达的基因组偏向性及组织特异性、基因激活等现象,本文对这些现象及其特点和机制进行了综述。     

基因突变的分子检测技术

基因突变的分子检测是确定生物性状与某种遗传变异的关系、探讨生物物种内基因的差异、了解生物种间亲缘和进化的关键技术,对群体遗传学和生物分类学研究、遗传病诊断等都有着重要的理论意义和实用价值。因此,对于基因突变的检测方法的研究目前受到广泛关注。对基因突变的形式及其分子检测技术作了全面综述。     

Gene structure and chromosomal localization of mouse cyclin G2 (Ccng2)

Cyclins are essential activators of cyclin-dependent kinases (Cdk) which, in turn, play pivotal roles in controlling transition through cell-cycle checkpoints. Cyclin G2 is a recently discovered second member of the G-type cyclins. The two members of the G-type cyclins, cyclin G1 and cyclin G2, share high structural similarity but their function remains to be defined. Here we characterize the structure of the mouse cyclin G2 gene by first cloning and sequencing the full-length mouse cyclin G2 cDNA. The cyclin G2 cDNA was used to isolate the cyclin G2 gene from a BAC library and to establish that the gene was transcribed from eight exons spanning a total of 8604 bp. The cyclin G2 gene was mapped by fluorescence in situ hybridization (FISH) to mouse chromosome 5E3.3.–F1.3. This region is syntenic to a region on human chromosome 4. The expression of cyclins G1 and G2 was examined in various tissues, but no correlation between expression patterns of the two genes was observed. However, during hepatic ontogenesis the cyclin G2 expression level decreased with age, whereas cyclin G1 expression increased. Transient expression of cyclin G2-green fluorescent protein (GFP) fusion protein in NIH3T3 cells showed that cyclin G2 is essentially a cytoplasmic protein, in contrast to the largely nuclear localization of cyclin G1. Our data suggest that, despite the close structural similarity between mouse cyclins G1 and G2, these proteins most likely perform distinct functions.     

Gene structure and chromosomal localization of mouse cyclin G2 (Ccng2)

Cyclins are essential activators of cyclin-dependent kinases (Cdk) which, in turn, play pivotal roles in controlling transition through cell-cycle checkpoints. Cyclin G2 is a recently discovered second member of the G-type cyclins. The two members of the G-type cyclins, cyclin G1 and cyclin G2, share high structural similarity but their function remains to be defined. Here we characterize the structure of the mouse cyclin G2 gene by first cloning and sequencing the full-length mouse cyclin G2 cDNA. The cyclin G2 cDNA was used to isolate the cyclin G2 gene from a BAC library and to establish that the gene was transcribed from eight exons spanning a total of 8604 bp. The cyclin G2 gene was mapped by fluorescence in situ hybridization (FISH) to mouse chromosome 5E3.3.–F1.3. This region is syntenic to a region on human chromosome 4. The expression of cyclins G1 and G2 was examined in various tissues, but no correlation between expression patterns of the two genes was observed. However, during hepatic ontogenesis the cyclin G2 expression level decreased with age, whereas cyclin G1 expression increased. Transient expression of cyclin G2-green fluorescent protein (GFP) fusion protein in NIH3T3 cells showed that cyclin G2 is essentially a cytoplasmic protein, in contrast to the largely nuclear localization of cyclin G1. Our data suggest that, despite the close structural similarity between mouse cyclins G1 and G2, these proteins most likely perform distinct functions.     

代谢工程中基因修饰与基因表达的工具

代谢工程利用重组DNA技术导入定向改造的基因 ,以改进微生物细胞的某些代谢特性 ,已经发展成为一个工业微生物育种和优化发酵过程的强有力工具。基因的修饰与表达是代谢工程的重要组成部分。本文介绍了近年来代谢工程中基因修饰与表达所用的工具方面的进展。     

基因工程技术在花卉中的应用

近年来花卉产业得到了蓬勃发展,不断成熟的基因工程技术为花卉的品质改良提供了新的思路,也为花卉产业化发展带来了新的机遇。本文综述了影响植物花色、花型、花期等相关基因及转基因的研究,展望了基因工程技术在花卉育种和产业化应用的发展前景。     

人新基因HBRP基因工程细胞系的建立

在研究牛精浆蛋白 (bovineseminalplasmaproteins ,BSPproteins)及其相关蛋白在受精卵发育过程中的重要作用时 ,在人睾丸组织中发现并克隆了一个与BSP蛋白相关新基因的序列 ,其开放阅读框架 (openreadingframe ,ORF)编码了一个含 2 2 3个氨基酸残基的蛋白质 ,氨基酸序列中含有4个纤连蛋白Ⅱ型结构域 ,与BSP蛋白在结构上有一定的相似性 ,称其为人BSP相关蛋白 (humanBSP relatedprotein ,HBRP) ,并在GenBank注册 ,登录号为AF2 791 4。预测该蛋白是与BSP蛋白功能相关的结合蛋白 ,并已成功地将该基因定位在 1 9号染色体 1区 3带上。为进一步研究该新基因的生物学功能 ,利用重组质粒pEGFP C2 HBRP转染人胚肾HEK2 93细胞 ,通过G41 8筛选出药物抗性克隆 ,建立了稳定的基因工程细胞系 ,为该基因功能的研究奠定了基础 ,对该基因功能的进一步研究有重要的意义 义。