A组轮状病毒实时定量PCR检测方法的研究进展

A组轮状病毒是引起婴幼儿急性肠胃炎的最主要病原之一。目前已建立的轮状病毒检测方法有电镜检测、酶免疫法、反转录PCR法、实时定量PCR法。实时定量PCR法与其他方法相比具有特异性强、敏感度高、可以分型、定量准确等优势。本文就实时定量(Real-time)PCR技术应用于A组RV检测的研究进展进行简单概述。     

膜芯片检测A组轮状病毒的初步研究

建立表面带正电荷的尼龙膜为基片的基因芯片,采用RT-semi-nested PCR方法,对A组轮状病毒RNA实现高度扩增,并通过5'端带地高辛标记的上游引物实现扩增产物的标记.通过同膜芯片上探针的杂交和免疫显色,实现对A组轮状病毒的检测.结果表明,膜芯片对探针的固定效果、杂交吸脱和检测结果可靠,空白对照和阴性对照均为阴性,探针均显示为阳性信号,并且信号强弱与探针浓度关系不大,而主要与探针本身同互补链的结合相关.以上结果说明已经初步建立了快速检测A组轮状病毒的膜基因芯片检测技术.     

检测A组轮状病毒的微阵列技术初探

采用荧光染料TAMRA标记上游引物,经RT semi nestedPCR扩增A组轮状病毒的保守区域,并将扩增产物与自行研制的玻片微阵列进行杂交。经杂交信号扫描分析,可简便快速地检出A组轮状病毒,并能达到高灵敏性,为下步进入临床打下了基础。     

A组轮状病毒可视化RT-LAMP方法的建立

【目的】建立一种利用颜色判定的快速、简单、灵敏度高的检测方法,即可视化的逆转录环介导等温扩增(RT-LAMP)方法,并应用于人A组轮状病毒的基因检测。【方法】针对A组轮状病毒VP6基因的6个保守区域设计4条特异性引物,在64 °C恒温条件下进行核酸扩增反应1 h,在扩增前加入染料钙黄绿素(Calcein)作为反应指示剂,以钙黄绿素的颜色变化作为结果判定标准。评价该方法的特异性和灵敏度,并同时利用RT-LAMP和RT-PCR两种方法对90份临床腹泻样本中的病毒核酸进行检测。【结果】RT-LAMP方法特异性较高,灵敏度可以达到103 copies/μL RNA分子水平,比RT-PCR高出100倍。对临床标本的检出率与RT-PCR方法相当。【结论】建立的RT-LAMP法灵敏度较高,特异性强,节省时间,结果可视化,具有野外检测和现场快速检测的潜力。     

A组轮状病毒相关受体的研究进展

轮状病毒(Rotavirus,RV)是导致人类和动物病毒性腹泻的重要病原体,其中A组RV是导致全球5岁以下婴幼儿腹泻的主要病原体。RV感染宿主细胞的第一步是病毒与细胞表面的受体结合,介导病毒颗粒进入细胞内。因此,研究RV病毒受体对于揭示RV的致病和免疫机理具有重要价值。对近年来发现的A组RV受体及其作用的研究进展进行了综述。     

B组轮状病毒RT—PCR来源的cDNA探针核酸诊断方法的建立

近十年来,国内外学者相继报道在人以及牛、羊、猪、大鼠的腹泻粪样中检出Ｂ组轮状病毒〔１－３〕。洪涛等于１９８３年首次报道成人腹泻轮状病毒（ＡＤＲＶ）属于Ｂ组轮状病毒〔４〕。目前,轮状病毒Ｂ组已被公认为引起人及不同动物腹泻的流行病学的重要因素。由于Ｂ组轮...     

大熊猫轮状病毒PCR检测方法的建立及应用

轮状病毒是威胁大熊猫健康的主要病原微生物之一。为了对大熊猫轮状病毒进行快速、方便且准确地检测,研发适合于基层饲养单位和保护区的检测方法是非常有必要的。本研究通过合成大熊猫轮状病毒Vp7基因序列,构建了PUC-VP7的重组质粒,并将其作为阳性对照对大熊猫轮状病毒样本进行PCR检测和分析。结果表明,在进行PCR扩增分析时,该质粒和病毒cDNA二者均在340 bp处出现了特异性条带。此外,对收集到的45份大熊猫粪便样本进行轮状病毒抗原检测时,其中2份样品在340 bp处出现条带,该基因片段与大熊猫轮状病毒CH-1株的相似性为99.89%。本研究构建的PUC-VP7质粒不但可以作为大熊猫轮状病毒PCR检测中的阳性质控品,而且还能有效地促进该PCR病毒检测技术在基层饲养单位和保护区的推广和应用。     

DNA芯片制作原理及其杂交信号检测方法

文章讨论了ＤＮＡ芯片的制作原理和杂交信号的检测方法。依其结构,ＤＮＡ芯片可分为两种形式,ＤＮＡ阵列和寡核苷酸微芯片。ＤＮＡ芯片的制作方法主要有光导原位合成法和自动化点样法。ＤＮＡ芯片与标记的探针或ＤＮＡ样品杂交,并通过探测杂交信号谱型业实现ＤＮＡ序列或基因表达的分析。适应于ＤＮＡ芯片的发展,同时出现了许多新型的杂交信号检测方法。主要有激光荧光扫描显微镜、激光扫描共焦显微镜、结合作用ＣＣＤ相机的荧光     

腹泻患儿粪便A群轮状病毒抗原检测的结果分析

目的:了解本地区腹泻婴幼儿的A群轮状病毒感染情况及其流行特点。方法:采用胶体金法对我院2009年10月-2010年9月2104例有腹泻和肠炎特征的婴幼儿粪便进行A群轮状病毒抗原检测。结果:在2104例受检者中,A群轮状病毒感染的总阳性率是24.71%,其中男性感染率24.17%,女性为25.40%。不同年龄组间以1-2岁婴幼儿感染率最高,为32.13%,0-1岁为20.72%,2-5岁为12.03%。感染的季节特征是秋末冬初季(10-12月)阳性率最高,为42.82%,春末夏初季(4-6月)最低,为8.81%。结论:由A群轮状病毒感染引发的急性腹泻主要发生在1-2岁的婴幼儿,各个季节均有发生,以秋末冬初季为高发。     

用反转录—聚合酶链反应检测B组轮状病毒

轮状病毒（Ｒｏｔａｖｉｒｕｓ）是属于呼肠病毒科（Ｒｅｏｖｉｒｉｄａｅ）的双链ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）病毒。至今已将轮状病毒分为七个组（Ａ～Ｇ）。已经发现的Ｂ组轮状病毒分别来自人、大鼠、牛、猪、羊。近十年来,通过轮状病毒的研究,轮状病毒Ｂ组已被公认为引起人...     

An Occurrence of Diarrheal Cases Associated with Group C Rotavirus in Adults

Six of the 23 college students who joined a group trip in February of 1991 developed acute nonbacterial gastroenteritis with severe diarrhea. The causal agent was identified as group C rotaviruses by electron microscopy (EM), immune-EM (IEM) and the molecular examinations including polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) and polymerase chain reaction (PCR) on virus particles detected in the extract of watery fecal specimens of the patients. The patients positive for virus isolation showed significant increase in IEM antibody to the isolated virus in their paired sera. These findings suggest that the group C rotavirus is an important etiological agent of diarrhea and may also cause serious food-borne diarrheal disease in adults.     

硅-玻璃聚合酶链式反应微芯片对β-葡糖苷酸酶基因的扩增

聚合酶链式反应（PCR）微芯片是基于微机电系统（MEMS）制作,在微芯片上进行PCR反应,实现生物样品扩增的一项新技术.介绍了硅-玻璃PCR微芯片的设计和制作、微反应腔的清洗和表面处理、借助外置温度控制系统进行PCR扩增反应以及扩增产物在琼脂糖凝胶电泳下的检测分析,实现了对β-葡糖苷酸酶（GUS）基因的有效扩增,扩增时间由原来的90 min缩短到现在的37 min.     

腹泻患儿粪便A群轮状病毒抗原检测的结果分析

目的：了解本地区腹泻婴幼儿的A群轮状病毒感染情况及其流行特点。方法：采用胶体金法对我院2009年10月-2010年9月2104例有腹泻和肠炎特征的婴幼儿粪便进行A群轮状病毒抗原检测。结果：在2104例受检者中,A群轮状病毒感染的总阳性率是24．71％,其中男性感染率24．17％,女性为25．40％。不同年龄组间以1—2岁婴幼儿感染率最高,为32．13％,0-1岁为20．72％,2-5岁为12．03％。感染的季节特征是秋末冬初季（10—12月）阳性率最高,为42．82％,春末夏初季（4．6月）最低,为8．81％。结论：由A群轮状病毒感染引发的急性腹泻主要发生在1-2岁的婴幼儿,各个季节均有发生,以秋末冬初季为高发。     

A组人轮状病毒全基因组克隆和基因型分析

运用基因克隆和重组技术,从一急性胃肠炎患儿样品中克隆到一株轮状病毒（RV）全基因组cDNA。核苷酸序列测定结果表明,该株RV基因组11条RNA共含有18613个核苷酸（3302bp—751bp）,编码5791个氨基酸。全基因组研究结果表明,该株RV（TB-Chen）为A组,II亚组,基因型为G2P[4]/NSP4[A]。这是首个A组人RV全基因组研究结果的报道,对研究和开发RV疫苗具有积极的意义。     

2种微小RNA实时定量PCR检测方法的比较

目的:对目前最常用的检测微小RNA(miRNA)的茎环实时定量PCR法和PAP实时定量PCR法进行比较。方法:分别用茎环实时定量PCR法和PAP实时定量PCR法检测人乳腺癌细胞MCF-7中U6和23种miRNA的表达,利用定量PCR分析软件和琼脂糖凝胶电泳方法,将2种方法在引物设计难度、特异性与灵敏度,以及检测通量方面进行比较。结果:茎环法的特异性和灵敏度比PAP法高,但引物设计难度大,检测通量低;PAP法引物设计难度较低,检测通量较高,但特异性和灵敏度较差。结论:茎环法实时定量PCR适于有针对性地检测小规模miRNA,而PAP法则适于大规模miRNA筛选实验。     

不同纯化方法处理DNA合成引物对PCR扩增效率的影响

对ＤＮＡ合成的幽门螺杆菌尿素酶引物ＨＰ１、ＨＰ２、ＨＰ３、ＨＰ４进行了几种不同的纯化试验,分别采用无水乙醇沉淀法、ＮＴ柱及聚丙烯酰胺凝胶电泳方法,对其相应的纯化收率,ＰＣＲ扩增效率作了比较及分析。琼脂糖凝胶电泳结果证实,以无水乙醇沉淀纯化方法的ＰＣＲ扩增效果较为理想。该方法操作简便、稳定高效、省时省力、成本低。为此建议用该法处理ＤＮＡ合成引物。     

应用于染色体步移的PCR扩增技术的研究进展

各种建立在PCR基础上染色体步移的方法能够根据已知的基因序列得到侧翼的基因序列。染色体步移技术主要应用于克隆启动子、步查获得新物种中基因的非保守区域、鉴定T-DNA或转座子的插入位点、染色体测序工作中的空隙填补,从而获得完整的基因组序列等方面。其方法主要有3种：反向PCR的方法,连接法介导的PCR的方法以及特异引物PCR的方法。文章就各种方法进行举例说明并加以分析比较。