马铃薯卷叶病毒单克隆抗体的制备

采用杂交瘤技术,以马铃薯卷叶病毒(Potato Leafroll Virns,PLRV)为抗原,用直接将病毒注入脾脏和随后尾静脉注射的方法,免疫BALB/C小鼠。将免疫小鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合。用Dot-ELISA和间接血凝试验筛选分泌抗马铃薯卷叶病毒抗体的阳性克隆,建立了分泌抗PLRV单克隆抗体的杂交瘤细胞株。用微量玻片双扩散法测定单克隆抗体亚类为IgG_1和IgG2a,轻链为λ。注射杂交瘤细胞株A_1、A_3、C_3和D_3于小鼠腹腔,制备出含高效价单克隆抗体的腹水。用获得的四种单克隆抗体对马铃薯卷叶病毒15个分离物进行了鉴定。     

番茄环斑病毒单克隆抗体的制备

以纯化的番茄环斑病毒(Tomato ringspot virus,ToRSV)为抗原,注射免疫BALB/c小鼠,将免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞Sp2/0进行融合,经多次细胞筛选及克隆化,获得3株(A8、B7和G9)可分泌抗ToRSV单克隆抗体的杂交瘤细胞株,并以之分别制备小鼠腹水单克隆抗体。经酶联免疫吸附试验检测表明,该3株杂交瘤细胞腹水抗体效价在10-5～10-6之间,且均具有与ToRSV反应的特异性。     

抗乙型肝炎病毒e抗原和核心抗原双特异性单克隆抗体的建立与应用

用基因工程技术在大肠杆菌中高效表达的乙型肝炎病毒核心抗原(内含高滴度的e抗原)免疫Balb/C小鼠,取免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞(Sp2/0)融合,获得两株分泌高滴度既抗-HBe又抗-HBc的双特异性杂交瘤细胞系。细胞培养上清液中抗体滴度为100～1000以上;免疫腹水中的抗体滴度为8万至10万以上,均属IgG2a亚类。细胞在实验室连续传代二年多,仍保持高效分泌抗体能力。此单克隆抗体与HBeAg或HBcAg的结合可被抗-HBc或抗-HBc阳性血清所抑制,竞争抑制率在85.9％～96.8％之间。用此单克隆抗体与HBe的β型单克隆抗体和抗HBc的α型单克隆抗体配对,可组装成检测HBeAg/抗-HBe和抗-HBc的诊断试剂,具有重要的应用价值。     

抗乙型肝炎病毒表面抗原“y”亚型及“a”组抗原决定簇杂交瘤细胞株的建立与应用

用部分纯化的HBsAg/adr和ayw亚型免疫Balb/c小鼠的脾细胞,在PEG作用下与Sp2/o骨髓瘤细胞进行融合,经ELISA及RIA法筛选出了分泌抗HBsAg/a(SH 1 D9)、抗HBsAg/y(SG 3 B10)亚型决定簇的杂交瘤细胞系,在组织培养上清液中它们的滴度分别     

青霉素结合蛋白2a单克隆抗体的研制和初步应用

目的研制青霉素结合蛋白2a(PBP2a)单克隆抗体(Mc Ab),为建立耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)免疫层析检测方法提供检测用抗体。方法以基因工程抗原r PBP2a免疫BALb/c小鼠,通过常规小鼠B淋巴细胞杂交瘤技术制备单克隆抗体,采用免疫印迹技术(Western blotting)分析单克隆抗体特异性。选取敏感、特异的单克隆抗体进行金标记和硝酸纤维膜包被,建立胶体金免疫层析检测方法。结果共获得11株分泌抗r PBP2a的杂交瘤细胞,其中6株分泌的单克隆抗体能够与天然PBP2a呈阳性反应。用其中2株单克隆抗体建立的PBP2a胶体金免疫层析方法,可在5~20 min内完成检测。结论获得了特异性针对PBP2a蛋白的单克隆抗体,并初步建立了检测PBP2a蛋白的胶体金免疫层析检测方法,为临床快速、简便检测产生PBP2a的细菌提供了检测方法。     

肌酸激酶同工酶MB(CK-MB)单克隆抗体制备及检测方法的建立

该文通过制备出特异性高的单克隆抗体,初步建立了双抗夹心ELISA定量测定CK-MB的方法,为CK-MB试剂和原料的国产化奠定重要的基础。以购入的CK-MB抗原为免疫原,对随机选取的5只6～8周龄Balb/c健康雌性小鼠进行免疫。采用有限稀释法、间接ELISA、捕获ELISA方法,最终筛选出了3株能够稳定分泌抗体的细胞株,分别命名为2F6、2H3和2H9,其分泌的单克隆抗体亚型均为IgG3,腹水效价分别为1:102000、1:51200和1:102000。采用亲和层析法对3株杂交瘤细胞产生的小鼠腹水进行纯化,分光光度计测定纯化后的单克隆抗体2H3、2F6、2H9的浓度分别为5 mg/mL、6 mg/mL、6 mg/mL, SDS-PAGE结果表明,成功纯化了小鼠腹水,能够清晰地观察到轻链和重链两条带。Western blot结果表明,单克隆抗体2F6、2H3和2H9均能特异性识别CK-MB蛋白。间接ELISA及捕获ELISA方法检测显示,单克隆抗体2H3只与CK-MB及CK-BB发生捕获ELISA方法反应;单克隆抗体2H9只与CK-MB及CK-BB发生捕获ELISA方法反应;单克隆抗体2F6只与CK-MB及CK-MM发生捕获ELISA方法反应。稳定性实验表明, 3株杂交瘤细胞都能稳定分泌抗CK-MB单克隆抗体。高质量单克隆抗体的获得,为建立CK-MB检测方法奠定了基础。     

重组人红细胞生成素单克隆抗体的制备

本文应用常规淋巴细胞杂交瘤技术制备了4株能稳定分泌抗人重组红细胞生成素(rHuEPO)单克隆抗体(McAb)的小鼠杂交瘤细胞系:BⅡ1B5、DⅡ6B9、MⅡ1H4、GⅠ3E7,用鼠单克隆抗体分型试剂盒鉴定,其分泌的McAb的类型分别是:IgM、IgM、IgG1和IgG2a。间接ELISA法测定细胞上清的效价为1×10~(-2)～1.25×10~(-1),腹水效价为1×10~(?)～1×10~(?)。培养上清经ELISA鉴定,与IL-2、GM-CSF、IFN-α等细胞因子均无交叉反应。只与rHuEPO特异性结合。     

幽门螺杆菌尿素酶单克隆抗体的研制及鉴定

应用杂交瘤技术 ,建立稳定分泌抗幽门螺杆菌尿素酶单克隆抗体 (HPU McAb)的细胞系。用纯化幽门螺杆菌尿素酶 (HPU)抗原加福氏佐剂免疫BALB/c小鼠 ,按常规方法进行细胞融合 ,以纯化HPU抗原包被 ,间接ELISA方法筛选 ,并经多次有限稀释法克隆。获得 6株抗HPU的杂交瘤 ,腹水效价达 1∶6 .4× 10 4～ 1∶2 .5 6× 10 5,特异性专一 ,并对其进行体内外连续传代 3个月 ,分泌抗体能力稳定。IgG亚类分型主要为IgG1型。该细胞系能稳定分泌幽门螺杆菌尿素酶单抗。     

抗鳗弧菌独特型单克隆抗体的制备及鉴定

利用具有中和活性的抗鳗弧菌单克隆抗体 4A6作为免疫原 ,通过单克隆抗体技术制备出 7株分泌抗独特型单抗的杂交瘤细胞。以ELISA竞争抑制实验及诱导Ab3的功能实验证实 ,其中 4株属于Ab2 β,有可能用于疫苗生产。     

抗H9亚型禽流感病毒血凝素单克隆抗体的制备和鉴定

目的:获得分泌抗H9亚型禽流感病毒(AIV)血凝素单克隆抗体的杂交瘤细胞。方法:以H9N2亚型AIV为免疫原,免疫6～8周龄雌性BALB/c小鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞Sp2/0-Ag-14,在PEG4000的作用下进行细胞融合,通过血凝抑制(HI)试验筛选分泌抗H9亚型AIV血凝素单克隆抗体的杂交瘤细胞。结果:经过连续3～4次克隆化,获得能稳定分泌抗H9亚型AIV血凝素的单克隆抗体细胞系6株,分别命名为1B2、1C10、1G2、2B7、2E3和5E11。6株细胞培养上清HI效价为24～28,腹水HI效价为210～213。除1G2为IgM外,其余5株均为IgG1。Western blotting结果显示,1B2、1C10、2B7和2E3能与AIVH9蛋白在Mr为75000处反应,表明其是针对AIVH9亚型血凝素蛋白的单抗。特异性试验表明该6株单抗均只与H9亚型AIV发生特异性HI反应,而不与其他14个HA亚型的AIV及新城疫病毒、传染性支气管炎病毒发生交叉反应,显示出良好的特异性。结论:制备了针对H9亚型禽流感病毒血凝素的单克隆抗体,为禽流感的快速诊断和病毒的抗原性分析等奠定了基础。     

马IgM、IgG单克隆抗体的研制与鉴定

以马IgM、luG作为免疫抗原,以此免疫BALB/c小鼠,并取其脾细胞与骨髓瘤细胞(SP2.0)融合,通过酶联免疫吸附试验(ELISA)方法筛选,结果获得了4株分泌抗马IgM和2株分泌抗IgG的单克隆抗体的杂交瘤细胞,特异性试验证明,4株IgM单抗有很好的特异性,仅与马的IgM特异反应,而不与IgG反应;这4株单抗分别命名为IgM4H、IgM6B、IgM8A和IgM12F.经鉴定,IgM4H、IgM6B、IgM12F株为IgG1亚类,IgM8A株为IgG2a亚类,杂交瘤细胞的平均染色体数目为99条.杂交瘤细胞培养上清液及小鼠腹水McAb的ELISA都具有较高的效价,该杂交瘤细胞连续培养20代后仍能稳定分泌抗体.2株IgG的单克隆抗体有很好的特异性,只与IgG反应,而不与IgM发生交叉反应.     

乙型肝炎病毒表面抗原a、d、r亚型单克隆抗体的制备与应用

本文成功地建立了分泌抗乙型肝炎病毒表面抗原(抗-HBsAg)a,d、r3种亚型决定簇抗体的4株杂交瘤细胞。经一系列生化、免疫学鉴定,证明4株细胞所分泌的单克隆抗体(McAb)均具有各自的亚型特异性。反复克隆培养16周,并液氮冻存8个月后复苏,抗体的效价仍稳定不变。用纯化的McAb制备RPHA诊断试剂,检测了80例有乙型肝炎自觉症     

抗人B7-H1单克隆抗体的制备和鉴定

目的:采用杂交瘤技术制备抗人B7-H1单克隆抗体,并对其进行鉴定。方法:经抗原免疫的小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞以常规方法融合;用间接ELISA法筛选分泌抗体的杂交瘤细胞株;阳性克隆用有限稀释法获得稳定分泌抗人B7-H1单克隆抗体的杂交瘤细胞株;扩增杂交瘤细胞注射进小鼠腹腔后制备腹水;纯化腹水中的单克隆抗体并对其亚型进行鉴定;用间接ELISA法测抗体效价;将肺癌组织制成石蜡切片,用抗人B7-H1抗体进行免疫组化染色。结果:获得1株稳定分泌抗人B7-H1单克隆抗体的杂交瘤细胞株,所分泌的单抗类型为IgG1;抗体效价为1×108,纯化后的抗体含量为6.76g/L;免疫组化实验中,单抗可与肺癌组织表面的B7-H1蛋白特异地结合。结论:制备了人B7-H1单克隆抗体,为B7-H1检测试剂盒的研制奠定了基础。     

P2X7受体短肽单克隆抗体的制备及鉴定

旨在制备与鉴定鼠抗P2X7受体的蛋白单克隆抗体.以人P2X7受体的胞外段制备短肽作为抗原,皮下注射免疫Balb/c小鼠.分离小鼠脾脏B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合并培养,挑选阳性杂交瘤细胞,扩大培养,制备和鉴定P2X7其生物学效应.结果显示,获得1株稳定分泌抗人P2X7受体的单克隆抗体的杂交瘤细胞株,所分泌的单抗类型重链为IgG1,轻链为κ;该株杂交瘤细胞腹水效价为1∶6.4×104;传30代及液氮中保存6个月,抗体效价稳定;Western blotting检测证明该单抗与人细胞表面的P2X7受体蛋白特异地结合.所制备的抗人P2X7受体的单克隆抗体具有高度的特异性及稳定性,为针对P2X7受体为靶点的抗体药物的开发应用、疾病的辅助诊断奠定了基础.     

马铃薯卷叶病毒单克隆抗体的制备

马铃薯卷叶病毒(Potato leafroll virus,PLRV)在植物体内数量很少,难以提纯足够量病毒进行免疫,至今未见国内有制备PLRV单克隆抗体(McAb)的报道.本文以本室以前报道的方法提纯马铃薯卷叶病毒作为抗原,直接注入Balb/c小鼠脾脏,随后从尾静脉加强注射,采用杂交瘤技术建立了4个分泌抗PILRV McAb的杂交瘤细胞株。经微量免疫双扩散法鉴定,杂交瘤细胞株A1、A3、D3分泌的McAb均属gG1亚类,C3株者属IgG2a,它们的轻链都是λ型。将0.5ml含10~8个A1,A3,C3,D3杂交瘤细胞注入     

抗猪PD-L1单克隆抗体的制备与其生物学特性鉴定

本研究旨在制备抗猪PD-L1单克隆抗体(monoclonal antibody,m Ab),有助于阻断猪PD-1/PD-L1通路逆转免疫功能。免疫原为猪PD-L1胞外区重组蛋白,雌性BALB/c鼠为免疫动物,用淋巴细胞杂交瘤技术将鼠骨髓瘤细胞NS0和免疫BALB/c鼠脾细胞融合,ELISA法筛选及多次克隆化培养,筛选抗猪PD-L1 mAb的杂交瘤细胞株。成功制备1株能稳定分泌抗猪PD-L1的mAb的杂交瘤细胞株3B5,Ig亚型为IgG1,细胞上清和腹水效价分别为1:1×2~(10)和1:1.024×10~5,ELISA和Western-blotting结果表明该株单抗能特异性识别猪重组PD-L1蛋白,流式细胞术结果表明该单抗可以与猪PBMC上PD-L1蛋白有效结合,成功制备了1株分泌抗猪PD-L1单克隆抗体的杂交瘤细胞株3B5,为检测猪PD-L1蛋白表达水平及猪PD-1通路在猪传染性疾病中的致病机制提供有力的检测工具。     

幽门螺杆菌尿素酶B单克隆抗体的制备与鉴定

目的:制备稳定分泌抗幽门螺杆菌尿素酶B单克隆抗体(mAb)的杂交瘤细胞系,并对其分泌的mAb进行鉴定。方法:用初步纯化的重组幽门螺杆菌尿素酶B免疫BALB/c小鼠,利用杂交瘤技术制备抗尿素酶B的mAb,用间接ELISA检测mAb的特异性和亲和力,检测mAb腹水效价,鉴定Ig亚类并测定其抗原决定簇。结果:获得8株能稳定分泌抗尿素酶B的mAb杂交瘤细胞系,这8株单抗与能产生尿素酶的小肠结肠耶尔森氏菌、肺炎克雷伯氏菌和普通变形杆菌均无交叉反应,相对亲和力为1.13×10-8～4.66×10-10,腹水mAb效价可达2×104～3.2×105。其中2株单抗属IgG1亚类,3株单抗属IgG2a亚类。8株单抗分属于3种不同的抗原决定簇。结论:获得了IgG1和IgG2a类型的针对3种不同抗原决定簇的特异性幽门螺杆菌尿素酶B的mAb,为进一步用于幽门螺杆菌的临床诊断和实验研究创造了条件。     

活化相关分泌蛋白1单克隆抗体的制备及其在保守结构域鉴定中的应用

目的:制备重组活化相关分泌蛋白1(ASP-1)的单克隆抗体,并用其鉴定保守结构域。方法:用原核表达并纯化的重组ASP-1不加佐剂免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术及有限稀释传代法筛选稳定分泌特异性抗体的杂交瘤细胞株,制备单抗腹水后用间接ELISA进行抗体特异性鉴定和效价检测,利用肽结合ELISA和Western印迹鉴定单抗识别的保守结构域。结果:获得5株能稳定分泌抗ASP-1单克隆抗体的杂交瘤细胞株,且5株单抗的识别区域均为21~28氨基酸残基的保守性结构域。结论:制备了抗ASP-1的单克隆抗体,为深入研究ASP-1佐剂的活性功能区及作用机制提供了有效工具。     

细胞工程

生产一了分泌针对一种抗配位免疫球蛋白的抗个体基因型抗体的杂交瘤。(丘惠深)870505产生抗神经传递素降解酶单克隆抗体的杂交瘤细胞株仁专,英〕     

牛血清白蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立及鉴定

用牛血清白蛋白(BSA)免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行融合,培养上清经过双抗体夹心法检测初步筛选分泌鼠IgG的杂交瘤细胞,将此种杂交瘤细胞注射小鼠产生的腹水用间接ELISA法筛选,获得4株能稳定分泌抗BSA单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为2A5、3A3、3G6、4A8。鉴定结果显示,2A5细胞分泌IgG2a/κ,其余3株细胞分泌IgG1/κ;纯化后4株腹水单抗的纯度达90%以上,对BSA的ELISA滴度均可达到1∶100000以上;4株单抗均不与人以及马、猪、羊、兔、豚鼠等血清发生交叉反应;W estern B lotting试验证明4株单抗均识别分子量为68000的BSA;用间接ELISA法测定4株单抗相对亲和力及相对敏感度大小依次为3A3>2A5>3G6>4A8;杂交瘤细胞株连续培养3个月以及冻存半年后复苏,细胞生长良好,杂交瘤细胞分泌的抗体效价稳定。