蜂毒素分子的改造及其基因在毕赤酵母中的表达

为获得保留有抗菌活性而降低溶血作用的蜂毒素,对蜂毒素的分子结构进行了改造。将第5位的Val变为Arg,第15位Ala变为Arg,删除了第16位的Leu。用PCR技术获得了改造后的蜂毒素基因,将其克隆入酵母表达载体pPICZa-A,获得重组表达质粒pPICZa-A-MEA。该质粒转化毕赤酵母菌GS115,甲醇诱导下表达,发酵上清液经抑菌活性、溶血活性测定及亲和层析纯化,结果表明,蜂毒素基因成功地在毕赤酵母中表达,经改造后表达的蜂毒素保留了抗菌活性且溶血活性显著降低,经纯化后用Bradford法测定表达蜂毒素的含量约为0.29mg／ml。     

蜂毒素基因的突变与表达及其构效关系研究

为获得保留有抗菌活性而降低溶血活性作用的蜂毒素,对其分子结构进行了改造.其中一条序列缺失Lys-7,另一条缺失Leu-9.用PCR技术获得两条新的蜂毒素基因,将其克隆到酵母表达载体pPICZα-A,获得重组质粒pPICZα-A-Mel1和pPICZα-A-Mel2.将2个重组质粒分别转化毕赤酵母菌GS115.筛选获得重组酵母菌.对重组酵母菌培养条件进行优化,在YEPD中含甘油2%,pH为7,重组酵母菌培养48h后,0.5%的甲醇诱导72h,表达目的蛋白通过Tricion-SDS-PAGE确定分子质量为5.4kD.杀菌效价分别达0.947、1.085.结果表明两条蜂毒素基因成功的在毕赤酵母中表达,经突变后表达的蜂毒素降低了溶血活性,同时保留了抗菌活性.     

改造的蜂毒素基因在毕赤酵母中分泌表达及培养条件研究

对蜂毒素基因进行改造后,通过PCR方法获得新蜂毒素基因(MEA),将其克隆到表达载体pPICZa—A,而后将重组表达载体pPICZa-A-MEA转化GS115,筛选获得重组酵母菌．对GS115-ME经甲醇诱导表达并对培养条件进行优化探讨．对改造的蜂毒素进行了溶血活性、热稳定性及酸碱稳定性测定．结果表明,蜂毒素基因成功地在毕赤酵母中表达,经改造的蜂毒素在保留了抗菌活性的同时溶血活性降低20倍左右,同时还具有良好的热稳定性和酸碱稳定性．     

人精氨酸酶在毕赤酵母的高效表达、纯化和活性研究

目的：人精氨酸酶（Arginase, Arg）的基因arg在毕赤酵母高效分泌表达,建立相应纯化工艺路线,研究重组人精氨酸酶的活性。方法：将人精氨酸酶基因arg按正确的阅读框架插入到毕赤酵母表达载体pPIC9α信号肽基因后,构建得到重组毕赤酵母表达质粒。转化毕赤酵母GS115筛选高表达菌株。结果：成功构建了酵母表达载体pPIC-Arg,转化毕赤酵母GS115后筛选到分泌表达目的蛋白Arg的菌株,目标蛋白可以分泌到培养基中。经过膜过滤和凝胶过滤层析对培养基上清进行纯化,即可获得纯度达到95%的活性产物。活性测定表明,纯化的Arg比活性为310 IU/mg。结论：成功构建了Arg的毕赤酵母高效表达菌种,建立了目标物质的分离纯化工艺。     

抗菌肽牛乳铁多肽素（LfcinB）在毕赤酵母中的表达及活性鉴定

利用巴斯德毕赤酵母(Pichia pastors)系统表达抗菌肽——牛乳铁多肽素(bovine lactoferricin,简称Lf-cinB),获得的分泌型表达产物具有较强的抗菌活性。首先将人工合成的LfcinB基因片段克隆到巴斯德毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K中,获得的重组质粒pPIC9K-LfcinB通过限制性内切酶SalⅠ酶切线性化,经电穿孔法转化入毕赤酵母细胞SMD1168内。G418抗性筛选,得到高拷贝转化子,经PCR检测LfcinB基因与毕赤酵母染色体稳定整合。阳性克隆经甲醇诱导表达LfcinB。结果表明,抗菌肽牛乳铁多肽素基因已经整合到酵母细胞基因组中并获得表达,表达产物具有较强的杀菌作用。     

猪PR-39抗菌肽基因在毕赤酵母中的表达

[目的]在毕赤酵母中表达抗菌肽PR-39基因,获得有抗菌活性的PR-39。[方法]根据酵母和猪密码子偏好性,对其密码子进行优化改造。将经SOE-PCR获得的PR-39基因与毕赤酵母表达载体pPIC9K连接,构建重组载体pPIC9K-PR-39。经SacⅠ线性化电击转化毕赤酵母GS115,取阳性克隆进行髙拷贝转化子筛选和诱导表达。[结果]pPIC9K-PR-39重组质粒构建成功,pPIC9K-PR-39菌株发酵产物检测结果对DH5α大肠杆菌和金黄色葡萄球菌都有抑菌效果。[结论]获得了PR-39基因的重组酵母,并用毕赤酵母系统成功地分泌表达了具有明显抗菌活性的抗菌肽PR-39。     

抗菌肽牛乳铁蛋白肽衍生肽在毕赤酵母中的表达及活性鉴定

利用巴斯德毕赤酵母系统表达抗菌肽牛乳铁蛋白肽衍生肽简称LfcinBD,获得的表达产物具有较强的抗菌活性.将人工设计的用化学合成法合成的以酵母偏爱密码子编码的LfcinBD基因片段克隆到巴斯德毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K中,获得的重组质粒pPIC9K-LfcinBD通过限制性内切酶Sac Ⅰ酶切线性化,电击法转化毕赤酵母GS115宿主菌,G418抗性筛选,得到高拷贝转化子.经PCR检测,LfcinBD基因与毕赤酵母染色体稳定整合.阳性克隆经甲醇诱导表达LfcinBD,诱导表达5 d,每24 h取上清1 mL,进行抑菌试验.结果表明,抗菌肽牛乳铁多肽衍生肽基因已整合到酵母细胞基因组中并获得表达,经0.5%甲醇在30℃诱导48 h可产生较强抗菌活性的抗菌肽,而且对氨苄青霉素抗性的大肠杆菌亦有较强的抑菌作用.     

高效表达具有生物学活性的植酸酶的毕赤酵母

对来源于Aspergillusniger 96 3的植酸酶基因 phyA2进行了改造 ,包括去掉基因中的内含子和信号肽编码序列 ,在不改变所编码氨基酸的情况下 ,定点突变优化了对此基因在酵母中高效表达起关键作用的Arg密码子 .经改造的植酸酶基因按正确的阅读框架融合到毕赤酵母 (Pichiapastoris)高效表达载体 pPIC9上的α 因子信号肽编码序列 3′端 ,重组表达载体电击转化毕赤酵母得到重组转化子 ,经Southernblotting分析证实了植酸酶基因已整合到酵母基因组中 ,并确定了基因整合的拷贝数 .Northernblotting分析证明植酸酶基因能进行正常的转录 .SDS PAGE分析和表达产物的酶活性研究证明 ,植酸酶能有效分泌和高效表达 (Arg密码子优化后其表达量可达每毫升培养液 1 5 0 0 0U ,比Arg密码子没有优化的表达量高约 37倍 ,比原菌株A .niger 96 3的表达量高约 30 0 0倍 ) ,表达产物具有正常的生物学活性 .这是迄今为止我国饲料工业中 ,构建的第 1株具有实用价值和应用前景的生产饲料添加剂的基因工程菌株     

柔嫩艾美耳球虫钙依赖蛋白激酶3基因在毕赤酵母中的表达及分析

旨在真核表达系统中高效表达柔嫩艾美耳球虫钙依赖蛋白激酶3(Eimeria tenella calcium-dependent protein kinase-3,EtCDPK3),获得有活性的天然蛋白,利用毕赤酵母表达系统对该基因进行了表达.将EtCDPK3基因连接到毕赤酵母表达载体pPIC9K上,构建重组质粒pPIC9K-EtCDPK3.重组质粒通过电击转化入酵母细胞GS115后,用组氨酸缺陷培养基和G418分别进行筛选,获得含重组质粒的酵母表达细胞.重组酵母细胞在含1％甲醇的BMMY培养基中诱导产生目的蛋白,培养收集1-4d的部分上清.经SDS-PAGE检测,所表达的蛋白相对分子质量约为49 kD.Western blotting表明,该蛋白能与兔抗EtCDPK3血清特异性结合.结果表明,柔嫩艾美耳球虫CDPK3基因在毕赤酵母中成功地进行了表达.     

猪β防御素1基因在毕赤酵母中的分泌表达

PBD-1是猪防御系统起重要作用的抗菌小肽,为实现其在毕赤酵母中的表达,根据已发表的猪β防御素1(PBD-1)氨基酸序列和酵母偏好密码子,用PCR方法获得PBD-1基因,克隆到分泌型表达载体pPIC9K信号序列α因子之后,构建重组表达质粒pPIC9K-PBD-1,用SalⅠ将其线性化后转化毕赤酵母SMD1168,采用PCR法筛选Mut 表型,在AOX1启动子调控下,分子量约4.5kD的PBD-1抗菌肽得到表达。抗菌特性研究表明,该表达产物对金黄色葡萄球菌有较好的抑菌活性。首次在毕赤酵母表达系统中实现了PBD-1的分泌表达。